CN102976992A

CN102976992A - 一种从小球藻中提取叶黄素的方法

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Publication number: CN102976992A
Application number: CN2012105435782A
Authority: CN
Inventors: 林祥志; 马伏宁; 林汝榕; 荣辉; 闫晋飞; 刘潇; 杨善军; 王昭凯
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明公开了一种从小球藻中提取叶黄素的方法。该方法包括下述步骤：以乙醇或乙醇水溶液为提取剂，采用超声波法提取小球藻藻粉中的游离叶黄素及其酯，然后加入氢氧化钾或氢氧化钠溶液进行皂化反应；反应结束后，向反应体系中加入二氯甲烷或三氯甲烷进行萃取、离心、蒸馏水水洗后旋转蒸发至干，得到叶黄素。用甲醇溶解后，通过紫外分光光度仪及HPLC对叶黄素进行检测，叶黄素提取量可达到3.02mg/g(小球藻干重)。本发明实现了从小球藻中快速、高效提取叶黄素，为小球藻产业化生产叶黄素提供了技术支持。

Description

一种从小球藻中提取叶黄素的方法

技术领域

本发明涉及一种从小球藻中提取叶黄素的方法。

背景技术

叶黄素(lutein)属含氧的四萜类类胡萝卜素，是人体眼睛黄斑区和血液中的主要类胡萝卜素，具有吸收有害蓝色光保护视力及强的抗氧化活性，已经被运用到护眼功能饮料、化妆品、食品添加剂、医药、饲料等领域。

利用微藻提取叶黄素是近年国际上开发的代替万寿菊花为提取源的新方法，微藻生产叶黄素具有以万寿菊花等植物为材料来源不可比拟的优势：快速异养代谢、培养时间短、能够在生物反应器中实现高密度培养，不受气候、季节和区域的限制。国内外主要利用光生物反应器和发酵两种方式进行自养型及异养型微藻的生产。

叶黄素的提取方法有有机溶剂浸提法、微波提取、膜分离、高速逆流色谱、双水相等方法，实际应用中以有机溶剂浸提为主。叶黄素提取相关技术的专利主要以万寿菊为原料，微藻具有与植物不同的生理及结构特征，以微藻为原料的专利有CN1865242A以小球藻为材料，提取溶剂为甲醇与正己烷混合溶剂，通过细胞破碎仪及正己烷进行提取；专利CN101130513A以小球藻为材料，提取溶剂为乙醇与正己烷混合溶剂，皂化剂为NaOH，通过低温离心分离叶黄素。

发明内容

本发明的目的是提供一种从小球藻中提取叶黄素的方法。

本发明所提供的从小球藻中提取叶黄素的方法，包括下述步骤：以乙醇或乙醇水溶液为提取剂，采用超声波法提取小球藻藻粉中的游离叶黄素及其酯，然后加入氢氧化钾水溶液或氢氧化钠水溶液进行皂化反应；反应结束后，向反应体系中加入二氯甲烷或三氯甲烷进行萃取，通过低压旋转蒸发回收二氯甲烷或三氯甲烷，得到叶黄素粗提物。

其中，所述乙醇水溶液具体可为质量浓度为80％－100％的乙醇水溶液。

所述超声波法中，超声波功率可为200-300W，优选210-240W；超声波提取时间可为30-60min；超声波提取温度可为10-50℃，优选20-40℃，进一步优选30-40℃。

所述皂化反应中，所述氢氧化钾水溶液或氢氧化钠水溶液的质量浓度10％-20％；所述皂化反应的温度为可为10-50℃，优选20-40℃，进一步优选30-40℃；皂化反应的时间为10-20min。所述皂化反应在超声波辅助下进行，超声波功率为200-300W。

所述小球藻藻粉与所述提取剂的配比可为1g∶(30-80)mL。

所述小球藻藻粉与所述氢氧化钾水溶液的配比可为1g∶(10-30)mL。

所述萃取的方法是：向所述反应体系中加入二氯甲烷或三氯甲烷混合均匀，然后在4℃－8℃以4000g-8000g的转速离心5-10min，收集下相黄色液体，即为所述叶黄素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液。

所述方法还包括对叶黄素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液进行水洗、低压旋转蒸发回收二氯甲烷或三氯甲烷，得到叶黄素的步骤。

通过条件优化，从小球藻中提取叶黄素的最优方法为：以乙醇为提取剂，采用超声波法提取藻粉中的游离叶黄素及其酯，其中，超声波功率为240W，超声波提取时间为30min，提取温度为40℃，藻粉与乙醇的配比为1g∶50mL；然后加入质量浓度为20％氢氧化钾水溶液(藻粉与氢氧化钾水溶液的配比为1g∶30mL)在40℃、240W超声波辅助下进行皂化反应10min；反应结束后，向反应体系中加入藻粉与二氯甲烷配比大于1g∶150mL的二氯甲烷进行萃取，4℃、5000g离心5min，蒸馏水洗二氯甲烷相，低压旋转蒸干提取物，得到叶黄素。

本发明中所用的原料藻粉是按照下述方法制备得到的：将可用于叶黄素提取的小球藻藻泥进行冷冻干燥得到藻粉。

本发明以乙醇为溶剂，利用超声波法进行小球藻叶黄素及其酯类的提取，以20％KOH为皂化剂将叶黄素酯类转化为游离叶黄素，以二氯甲烷萃取游离叶黄素，达到与叶绿素等水溶性物质分离，采用低温旋转蒸发除去有机溶剂获得叶黄素。用甲醇溶解后，通过紫外分光光度仪及HPLC对叶黄素进行检测，叶黄素提取量可达到3.02mg/g(干重)。本发明实现了从小球藻中快速、高效提取叶黄素，为小球藻产业化生产叶黄素提供了技术支持。

附图说明

图1为实施例1对提取溶剂(a)、皂化剂(b)、萃取溶剂(c)的筛选柱形图，横坐标分别为溶剂种类，皂化剂及皂化先后顺序，纵坐标为提取的总类胡萝卜素在444nm的紫外吸收值。

图2为实施例2对超声波功率(a)、皂化时间(b)、提取及皂化温度(c)、提取溶剂乙醇的浓度(d)提取的单因子优化图。

图3为实施例3采用四因子三水平正交优化对小球藻叶黄素的提取工艺进行优化的效应曲线图。

图4为实施例4从小球藻藻粉中对提取的叶黄素与标准品叶黄素HPLC对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用藻种为购买自天津丰年水产养殖有限公司的海水小球藻(Chlorella sp.)藻泥。藻泥冷冻干燥得到小球藻藻粉。

实施例1、从小球藻中提取叶黄素的工艺优化

1、提取溶剂的筛选

准确称取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置于50mL离心管，加入5mL待筛选提取溶剂进行超声波(210W)提取30min，室温20-30℃；然后加入5mL，20％NaOH皂化10min；再加入三氯甲烷进行萃取，离心，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容检测含量。

上述待筛选的提取剂分别是：甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、石油醚(沸程60-90℃)、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇/三氯甲烷的混合溶剂(3∶1，v/v)

采用紫外分光光度仪对浓缩液中总类胡萝卜素含量进行检测，400-500nm波长扫描，比较最大吸收峰444nm处吸光度值。结果见图1a。由图可知，以乙醇作为提取剂时，提取的叶黄素浓度最高。

2、提取与皂化顺序的筛选及皂化剂的筛选

准确称取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置于50mL离心管，加入5mL乙醇进行超声波(210W)提取30min，室温20-30℃；然后加入5mL质量浓度20％NaOH水溶液(或质量浓度20％KOH水溶液)皂化10min；再加入三氯甲烷进行萃取，离心，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容检测含量。

准确称取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置于50mL离心管，加入5mL质量浓度20％NaOH水溶液(或质量浓度20％KOH水溶液)皂化10min；然后加入5mL乙醇进行超声波(210W)提取30min，室温20-30℃；再加入三氯甲烷进行萃取，离心，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容检测含量。

采用紫外分光光度仪对浓缩液中总类胡萝卜素含量进行检测，比较最大吸收峰444nm处吸光度值。结果见图1b。由图可知，以20％KOH溶液为皂化剂，采用先提取后皂化的方式，提取的叶黄素浓度最高。

3、萃取溶剂的筛选

准确称取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置于50mL离心管，加入5mL乙醇进行超声波(210W)提取30min，室温20-30℃；然后加入5mL质量浓度20％KOH水溶液皂化10min；再加入20mL待筛萃取溶剂进行萃取，离心，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容检测含量。

上述待筛选的萃取溶剂分别是：正己烷、石油醚(沸程60-90℃)、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷。

采用紫外分光光度仪对浓缩液中总类胡萝卜素含量进行检测，比较最大吸收峰444nm处吸光度值。结果见图1c。由图可知，以二氯甲烷作为萃取溶剂提取的叶黄素浓度最高。

实施例2、对从小球藻中提取叶黄素方法中超声波提取强度、提取剂乙醇浓度、皂化时间进行单因素考察

1、不同超声波强度对提取的叶黄素含量的影响。

取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置于50mL离心管，加入5mL乙醇进行超声波提取30min，温度25℃；然后加入5mL质量浓度20％KOH水溶液皂化10min；再加入20mL二氯甲烷进行萃取，离心，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容检测含量。

考察的超声波强度分别为：180W、210W、240W、270W、300W。

采用紫外分光光度仪对浓缩液中总类胡萝卜素含量进行检测，比较最大吸收峰444nm处吸光度值。结果见图2a。由图可知，超声波功率为240W提取的叶黄素浓度最高。

2、皂化时间对提取的叶黄素含量的影响

取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置于50mL离心管，加入5mL乙醇进行超声波(240W)提取30min，温度25℃；然后加入5mL质量浓度20％KOH水溶液进行皂化反应；反应结束，再加入20mL二氯甲烷进行萃取，离心，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容检测含量。

考察的皂化时间分别为：10min、20min、30min、40min、50min、60min。

比较444nm处吸光度值。结果见图2b。由图可知，皂化时间为10min的提取效果最好。

3、提取及皂化温度对提取的叶黄素含量的影响

准确称取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置于50mL离心管，加入5mL乙醇进行超声波(240W)提取30min；然后加入5mL质量浓度20％KOH水溶液皂化10min；再加入20mL二氯甲烷进行萃取，离心，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容检测含量。

考察的提取及皂化温度分别为：10℃、20℃、30℃、40℃、50℃。

比较444nm处吸光度值。结果见图2c。由图可知，提取及皂化水浴温度为40℃时，提取的叶黄素浓度最高。

4、提取剂乙醇浓度对提取的叶黄素含量的影响

取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉置于50mL离心管，加入5mL乙醇溶液进行超声波(240W)提取30min，温度40℃；然后加入5mL质量浓度20％KOH水溶液进行皂化反应10min，再加入20mL二氯甲烷进行萃取，离心，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容检测含量。

考察的提取剂乙醇溶液的质量浓度分别为：60％、70％、80％、90％、100％。

比较444nm处吸光度值。结果见图2d。由图可知，乙醇浓度为100％的提取效果最好。

实施例3、从小球藻中提取叶黄素最佳工艺条件的确定

根据单因素试验的结果，确定提取溶剂为乙醇，皂化剂为KOH，皂化时间10min，萃取溶剂为二氯甲烷，超声波频率为240W，提取及皂化温度为40℃后，对提取方法中料提取溶剂比、料皂化剂比、皂化剂浓度、超声波时间进行四因子三水平正交优化。

以总类胡萝卜素含量为提取效果考察指标，优选出最佳工艺条件，因素水平安排见表1。

表1提取因素水平

取0.1g海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉按一定比例加乙醇超声波240W提取一定时间，温度为40℃。按一定比例加一定浓度的KOH皂化剂超声波皂化10min，二氯甲烷20mL萃取，4℃、5000g离心4min，收集萃取液，浓缩至干，提取物用甲醇5mL定容，分光光度仪检测。

表2提取正交试验设计表及结果

通过正交试验可知，对小球藻叶黄素提取率影响的因子次序依次为：D超声时间＞A皂化剂浓度＞B料皂化剂比＞C料液比，确定最佳提取工艺为A₂B₁C₂D₃：皂化剂浓度为20％，料皂化剂比为1∶30，料液比为1∶50，超声波时间为30min组合的提取效果最好。

实施例4、超声波对提取叶黄素效果的影响

取海水小球藻(Chlorella sp.)藻粉0.1g入50mL离心管，加5mL无水乙醇，A组室温(25-30℃)静置30min；B组放入40℃超声波清洗仪进行超声提取30min，超声功率240W，两组均加入质量浓度20％KOH水溶液3mL，A组室温(25-30℃)静置10min，B组在40℃超声提取10min，超声功率240W；再加入20mL的二氯甲烷和20mL的蒸馏水振荡后入离心机4℃离心5min，转速5000g。萃取一次的二氯甲烷相用40mL蒸馏水水洗后旋转蒸发至干。提取物用5mL甲醇溶解后进行HPLC检测，根据峰面积计算叶黄素含量(mg/g干重)，设重复3次。

表4超声波对小球藻叶黄素提取的影响

超声波辅助乙醇提取方法对海水小球藻藻粉中的叶黄素提取效果比非超声波(静置)方式的提取含量高84％。

实施例5、从小球藻藻粉中提取叶黄素

取海水小球藻(Chlorella sp.)0.1g，入50mL离心管，加5mL无水乙醇放入超声波清洗仪进行超声提取30min，温度为40℃，超声功率240W；后加入质量浓度20％KOH水溶液3ml在40℃超声提取10min，超声功率240W；再加入20mL的二氯甲烷和20mL的蒸馏水振荡后入离心机4℃离心5min，转速5000g。上层水相用二氯甲烷重复萃取两次，合并三次萃取的二氯甲烷相，用40mL蒸馏水水洗后旋转蒸发至干。提取物用5mL甲醇溶解后进行HPLC检测，根据峰面积计算叶黄素含量，设重复3次。

叶黄素含量测定：小球藻藻粉叶黄素的含量采用HPLC进行检测。色谱条件：岛津LC-10ATvp泵，SPD-M10Avp二极管阵列检测器，Inertsil ODS-SP 5um(4.6×250mm)分离柱，流动相为甲醇∶水＝95∶5，流速0.8mL/min，进样量10uL，检测波长444nm。根据样品峰面积计算叶黄素含量，叶黄素标准曲线方程为y＝186572x-885.47(R2＝0.9948)，其中y为峰面积，x为叶黄素含量(mg/L)。

测定的海水小球藻藻粉中提取的叶黄素含量为3.02mg/g(干重)。

Claims

1.一种从小球藻中提取叶黄素的方法，包括下述步骤：以乙醇或乙醇水溶液为提取剂，采用超声波法提取小球藻藻粉中的游离叶黄素及其酯，然后加入氢氧化钾水溶液或氢氧化钠水溶液进行皂化反应；反应结束后，向反应体系中加入二氯甲烷或三氯甲烷进行萃取，得到叶黄素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乙醇水溶液为质量浓度为80％-100％的乙醇水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述超声波法中，超声波功率为200-300W，优选210-240W；超声波提取时间为30-60min；超声波提取温度为10-50℃，优选20-40℃。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述皂化反应中，所述氢氧化钾水溶液或氢氧化钠水溶液的为质量浓度10％-20％；所述皂化反应的温度为20-40℃，优选20-40℃，时间为10-20min；所述皂化反应在超声波辅助下进行，超声波功率为200-300W。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述小球藻藻粉与所述提取剂的配比为1g∶(30-80)mL。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述小球藻藻粉与所述氢氧化钾水溶液或氢氧化钠水溶液的配比为1g∶(10-30)mL。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述提取剂为乙醇；所述超声波法中，超声波功率为240W，超声波提取时间为30min，提取温度为40℃，所述小球藻藻粉与所述提取剂的配比为1g∶50mL；

所述皂化反应中，所述氢氧化钾水溶液为质量浓度20％的氢氧化钾水溶液；皂化反应的温度为40℃，时间为10min；所述皂化反应在超声波辅助下进行，超声波功率为240W；所述小球藻藻粉与所述氢氧化钾水溶液的配比为1g∶30mL。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述萃取的方法是：向所述反应体系中加入二氯甲烷或三氯甲烷混合均匀，然后在4℃以5000g的转速离心5min，收集上清液，即为所述叶黄素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对叶黄素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液进行水洗、除去二氯甲烷或三氯甲烷，得到叶黄素的步骤。