CN108586305A - 一种水华蓝藻叶黄素的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水华蓝藻叶黄素的提取 方法，步骤是：A、水华蓝藻的选择：取水华蓝藻样 品显微镜检测；B、蓝藻前期处理：收集选择的蓝 藻，喷雾干燥制成藻粉；C、蓝藻细胞破碎：超声波 破碎；D、蓝藻叶黄素的提取：高速冷冻离心机离 心，收集上清液，加入乙醇，萃取液变为澄清为 止；E、蓝藻叶黄素的纯化：向上清液中按比例加 入氢氧化钾‑乙醇溶液于4℃皂化，加入石油醚萃 取，有机相用蒸馏水冲洗至PH中性；F、叶黄素成 品的浓缩与干燥：将叶黄素溶液于通风橱中用氮 吹仪通气干燥制成叶黄素；G、叶黄素成品的储 存：将叶黄素放在自封袋中避光存放储存。方法 操作简单易行，成本低，效率高，产品安全性好， 适用于工业化快速大量提取蓝藻叶黄素。

Description

一种水华蓝藻叶黄素的提取方法

技术领域

本发明属于水华蓝藻资源化利用技术领域，具体涉及水华蓝藻色素提取技术，更具体涉及一种水华蓝藻叶黄素的提取方法，适用于提取水华蓝藻中的高价值成分。

背景技术

随着社会经济的迅速发展，长江中下游大型浅水湖泊呈现严重的富营养化和蓝藻水华堆积现象，可以形成水华的藻类很多，如蓝藻、绿藻、硅藻、甲藻等在一定条件下均可形成水华。这些藻类有些可产生异味物质，有的能产生毒素，对水环境危害极大。其中蓝藻水华分布范围最广、持续时间最长、危害最大，对水生生物和人类生命安全构成严重威胁。机械打捞是一种广泛应用于清除蓝藻水华并削减湖泊营养负荷的有效方法，然而打捞起来的蓝藻处置不当也会带来系列的生态安全问题，如腐烂后藻细胞释放出的微囊藻毒素随地表水迁移被蔬菜和农作物吸收。为了解决蓝藻机械打捞技术下游的生态安全问题，同时也为了开发一种新的打捞蓝藻资源化利用的技术，增加蓝藻变废为宝的效应，我们将对蓝藻细胞中有实用价值的成分进行分析并提取纯化为生物质产品。

水华蓝藻虽可产生一些对人体有害的物质，但它本身也含有许多高价值的成分，如藻蓝蛋白，藻多糖，各种色素等。藻蓝蛋白是一种少见的色素蛋白，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，且必须氨基酸的含量很高，它具有抗癌，促进血细胞再生，养护卵巢，促进人体合成弹力蛋白等功效，是一种极好的天然食用色素和良好的保健食品。另外，水华蓝藻通常含有丰富的蛋白质和多糖类物质，糖类作为一种可直接利用的能源物质，在食品、化工等行业发挥着重要的作用。

水华蓝藻色素中的叶黄素也是一种具有多种优良功能的物质。藻蓝蛋白和藻多糖均已经形成了比较成熟的资源化利用技术，而叶黄素虽也有巨大的实用价值，但提取效率和纯化方法有待进一步探索。

叶黄素是一种重要的类胡萝卜素，是四萜类化合物。天然存在的类胡萝卜素主要分为两大类：一是胡萝卜烯，属于烃类，在分子的任一端或者两端连接直链或者成环；二是叶黄素类，是胡萝卜烯类的含氧衍生物，包括叶黄素、黄体素、α-胡萝卜素、隐黄质、玉米黄质、蛋黄色素、隐黄素、玉米黄素、以及其它色素。叶黄素有两个紫罗酮环，即β-和γ-环，C3、C3’、C6’为手性碳原子，理论上叶黄素应该有8种光学异构体和多种顺反异构体。叶黄素在生物体内有时会与C12～C16的偶数碳饱和脂肪酸结合形成酯，其结构式如下：

叶黄素是一种橙黄色至橙红色的粉末状物质，不溶于水，极微溶于正己烷，易溶于某些有机溶剂如乙醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯等。叶黄素在偏酸溶液、弱光和低温的条件下稳定，在偏碱条件下较不稳定，在强碱强光条件下则会被破坏。因此，叶黄素最好封存在生物相容性及亲水性材料中。

叶黄素的用有很多很多，首先它是一种很好的抗氧化剂，它能抑制活性氧的产生，可以有效的防止细胞衰老、组织损伤等疾病；叶黄素也有一定的保护眼睛的作用，它能吸收对眼睛有害的蓝光，从而起到防止视网膜损伤的作用；叶黄素是一种可食用的色素，因而是天然的食品添加剂；叶黄素还能参与免疫调节，降低一些疾病的发生率，癌症是一种不可治愈的恶性疾病，有关研究表明，叶黄素能够抑制某些癌症的发生，同时，叶黄素也能降低心血管相关疾病的发生率。

蓝藻中叶黄素含量丰富，约占细胞干重的0.6％－0.9％，且我国蓝藻生物量庞大(仅仅无锡地区打捞的蓝藻生物质干重就达上万吨)，同时也可以解决我国蓝藻水华生物质堆积严重的问题，让水华蓝藻变废为宝，防止水华生物量出现二次污染。目前市场上售卖的叶黄素主要是从万寿菊花中提取的，但万寿菊花朵的生产需要大量耕地和农业生产投入，如何找到替代的原料来源是叶黄素生产的重要研究方向。因此蓝藻水华生物质可以作为提取叶黄素的便宜原料来源，但关于从水华蓝藻中提取叶黄素的相关内容还未曾报道，本发明的目的在于提出了一种快速从水华蓝藻中提取叶黄素的新方法。

目前已知叶黄素的提取方法主要有以下几种：

一、有机溶剂提取法。这是一种传统的提取方法，利用相似相容的原理，叶黄素易溶于有机溶剂难溶于水，从而将叶黄素提取出来，这种方法最为简单，但是提取效率低，耗时长(一般为18-24小时)，可以得到叶黄素粗产品，若要得到高纯度的叶黄素，还需要经过一系列的纯化过程。

二、微波辅助提取法。微波是一种高频率的电磁波，能使在磁场中的物质发生电离，从而产生高频率的震动。借助微波，可以使提取时间缩短，也能减少提取剂的消耗量。此方法虽提高了提取效率，但同样只得到了叶黄素的粗产品，含有较多细胞内容物。

三、超临界二氧化碳提取法。超临界流体介于液体和气体之间，溶解性好，易扩散，便于控制，可以通过控制压力和温度来控制选择性，常用于萃取和反萃取。常用的超临界流体便是超临界的二氧化碳。这种方法操作简单，溶剂残留量低，同时反应的温度也比较温和，适用于提取一些天然的有机成分。但是超临界萃取装置一般价格昂贵，增加了提取成本。

四、酶处理法。植物细胞大多具有坚韧的细胞壁，通过使用酶来处理细胞壁，可以使细胞内的色素更容易溶出。这种方法反应温和，但要彻底破碎细胞壁需要较长时间(约7-8小时)，生物酶价格也较贵，而且不同细胞的细胞壁成分往往不同，需要多种酶同时处理效果才能更好，这又增加了成本。

发明内容

中国多处水体中爆发过水华，以蓝藻水华为主，蓝藻水华生物质的处置和资源化利用一直是困扰着这个领域研究的问题。本发明的目的是在于提供了一种水华蓝藻叶黄素的提取方法，方法易行，操作简单，能简单高效、低成本、快速的将水华蓝藻细胞中的叶黄素提取出来，包括提取和纯化两个部分，大大缩短了提取时间，解决了已有方法耗时长、效率低、提取纯度不高和成本高等技术问题，特别适用于工业化快速大量提取水华蓝藻的叶黄素，为叶黄素的生产提供了又一个原料来源，同时还为水华生物质资源化利用提供了一个重要的应用方向。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种水华蓝藻叶黄素的提取方法，其步骤是：

1.水华蓝藻的选择。取水华蓝藻样品显微镜检测，选择相对单一物种的水华蓝藻。

2.蓝藻前期处理。收集选择的蓝藻，喷雾干燥或者冷冻干燥等其他方式制成藻粉。

3.蓝藻细胞破碎。精确称取0.1g-10g的藻粉按1:10-1:30的比例加入90％(v/v)的乙醇，通过BRANSON-S450D型超声波破碎仪，启动3秒停2秒，40％的频率破碎15－25分钟的程序破碎蓝藻细胞。

4.蓝藻叶黄素的提取。日立CR21GⅡ型高速冷冻离心机10000r/min离心4－6min，收集上清液，再向离心管中加入5mL的90％(v/v)乙醇，启动3秒停2秒，40％的频率超声振荡4－6分钟，反复萃取3－6次(多次)，直到萃取液变为澄清为止。

5.蓝藻叶黄素的纯化。向步骤4的上清液中按2:1的比例加入20％(w/v)的氢氧化钾-乙醇溶液于4℃冰箱中皂化1.5－2.5h，然后加入60-90℃的石油醚萃取28－32min，除去水相，保留有机相，在分液漏斗中进行。有机相用蒸馏水冲洗至PH中性，(PH6.5－7.5)。(PH试纸检测)。

6.叶黄素成品的浓缩与干燥。将得到的叶黄素溶液于通风橱中用氮吹仪通气干燥制成叶黄素成品。

7.叶黄素成品的储存。将得到的叶黄素成品放在自封袋中于-20℃冰箱避光存放储存待用。

本发明适用于所有水华蓝藻，包括微囊藻、鱼腥藻、束丝藻等藻类。

通过上述的技术措施：主要解决了以下技术问题和难点，主要达到了以下技术效果：用超声波的方法将蓝藻细胞破碎实现了细胞破碎时间长且难破碎的问题，实验中使用超声波破碎蓝藻15min，20min，25min后显微镜检测，20min时效果最好，细胞几乎全部破碎，继续超声破碎时细胞破碎率并没有显著提高；料液比设定了1:10、1:20、1:30三个浓度梯度，叶黄素的含量依次增加，当料液比从1:10到1:20时，叶黄素含量显著增加，而增加到1:30后则几乎无显著效果，反而增加了后面试剂的用量；用乙醇和丙酮分别提取蓝藻叶黄素，乙醇提取效果更好且更安全，当用乙醇萃取4次后，几乎没有叶黄素溶出(主要是叶绿素a)；石油醚挥发性非常强，叶黄素在石油醚中的溶解度较高，而且石油醚与水完全不互溶，最后用石油醚萃取叶黄素不仅除去了体系中含有的水分，也节约了风干干燥的时间。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.时间大大缩短。与传统的直接通过有机溶剂萃取(一般为18-24小时)和酶解法(约7-8小时)相比，提取时间缩短到只需3-4小时，效率更高。

2.更安全。与传统方法所使用的丙酮、甲醇、二氯甲烷等萃取剂相比，所加的有机试剂均无毒，而且易挥发，可以很容易的去除，更加安全。

3.成本大大降低。整个提取过程中都没有使用大型昂贵的仪器设备及昂贵的酶制剂，仅需要一台超声波细胞破碎仪即可提取，使得人工、材料等各方面的成本都大大降低，适用于任何场合提取水华蓝藻叶黄素，具有很高的经济效益。

4.效率高。直接有机溶剂萃取和酶解法提取的叶黄素仅占0.5％左右，此方法提取叶黄素能达到0.8％以上，而且叶黄素产品的纯度也很好。见说明书附图。

5.适用于大规模提取水华蓝藻叶黄素。整个提取过程耗时短，效率高，能快速大量的提取蓝藻叶黄素，特别适用于工业化大规模提取蓝藻叶黄素。

6.适用范围广。本方法对所有的水华蓝藻叶黄素以及其他藻类叶黄素的提取都可行。

附图说明

图1为一种叶黄素标准品的紫外光谱示意图。

在400-500nm之间出现峰值，在450nm附近有最大峰，其左右各含一个小峰。

图2为一种样品紫外光谱示意图。

在400-500nm之间出现峰值，在450nm处峰值最大，其左右可见一小峰，与叶黄素标准品的紫外光谱图相似。

图3为一种叶黄素标准品的HPLC光谱示意图。

选用90％(w/w)纯度的1mg/mL叶黄素标准品进行HPLC检测,在3.5-4min之间出现叶黄素的峰图，整个扫描时间段无其它峰出现。

图4为一种叶黄素标准品HPLC放大后光谱示意图。

叶黄素标准品HPLC放大后光谱图与紫外分光光度计上扫描的光谱图形状相近。

图5为一种提取样品HPLC光谱示意图。

由于提取的叶黄素没有经过浓缩，浓度较低，在2min之前可见到溶剂的峰，另外在16min处可见到含有少量的叶绿素a，26min处有另外一种类胡萝卜素出现，但在3.5-4min时的叶黄素峰值最大，含量最多。

图6为一种提取样品HPLC放大后光谱示意图。

提取样品中叶黄素HPLC放大后光谱图与紫外分光光度计上扫描的光谱图形相近。

具体实施方式

实施例1：

一种蓝藻叶黄素的提取方法，其步骤是：

1.水华蓝藻的选择。选择了微囊藻，中国的蓝藻水华中以微囊藻水华为主，选择微囊藻作为水华蓝藻的代表较为典型。

2.微囊藻的前期处理。将从水体中收获的微囊藻先用25号浮游植物网过滤除去大部分水分后喷雾干燥制成藻粉，用于提取微囊藻叶黄素。

3.微囊藻细胞的破碎。精确称取0.1或0.5或0.8g的藻粉按1:20的比例加入90％(v/v)的乙醇，通过BRANSON-S450D型超声波细胞破碎仪，启动3秒停2秒，40％的频率破碎20分钟的程序破碎微囊藻细胞。

4.微囊藻叶黄素的提取。日立CR21GⅡ高速冷冻离心机10000r/min离心5min，收集上清液，再向离心管中加入5mL的90％(v/v)乙醇，启动3秒停2秒，40％的频率超声振荡5分钟，反复萃取4次，此时溶液变为澄清。

5.微囊藻叶黄素的纯化。向步骤4收集的上清液按2:1的比例加入20％(w/v)的氢氧化钾-乙醇溶液于4℃冰箱中皂化2h，然后加入60-90℃的石油醚萃取30min，除去水相，保留有机相，在分液漏斗中进行，有机相用蒸馏水冲洗至PH为7。(用PH试纸检测)

6.微囊藻叶黄素的浓缩与干燥。将纯化的叶黄素溶液在通风橱中用奥盛牌MD200氮吹仪通空气鼓风风干干燥，得到微囊藻叶黄素成品。

7.叶黄素成品的储存。将得到的叶黄素成品放在自封袋中于-20℃冰箱避光存放储存待用。

该方法操作简单易行，无需大型仪器设备，成本低，效率高，所得产品安全性好，适用于工业化快速大量提取蓝藻叶黄素。

所述的提取之前需将收集的蓝藻制成藻粉，便于储存和后面的提取，用藻粉提取也可以使叶黄素的提取率提高。

所述的制备藻粉的方法采用的是喷雾干燥的方式，此方法能快速大量干燥水华蓝藻，更节省能源。

所述的步骤3中水华蓝藻细胞破碎的方式为超声波破碎，此法与直接有机溶剂萃取和酶解法等方法相比能够快速破碎细胞，缩短了提取时间，也节约了能源，最重要的是没有产生污染。

所述的步骤4中叶黄素的提取溶剂采用的是90％的乙醇，相比其他的有机溶剂如丙酮、二氯甲烷等，90％乙醇提取效果更好，而且没有毒性，挥发性高，能容易的去除。

所述的步骤5中收集的上清液可以先用氮吹仪通空气浓缩后再加入皂化液皂化，可以节约皂化液的使用量，同时也可防止皂化液对叶黄素结构的破坏。

所述的步骤5中用石油醚萃取后的溶液调节PH的方法为用蒸馏水冲洗至中性，因为叶黄素在中性时最为稳定，加酸加碱都会对其结构产生影响。

所述的步骤5中溶液PH调节至中性后可以用无水硫酸钠或无水氯化钙进行干燥除去少量残留的水分。

实施例2：

一种蓝藻叶黄素的提取方法，其步骤是：

1.水华蓝藻的选择。同实施例1.

2.微囊藻的前期处理。同实施例1.

3.微囊藻细胞的破碎。精确称取0.1或0.3或0.6或0.9g的藻粉按1:10或1:20或1:30的比例加入90％(v/v)的乙醇，通过BRANSON-S450D型超声波细胞破碎仪，启动3秒停2秒，40％的频率破碎15或20或25分钟的程序破碎微囊藻细胞。

4.微囊藻叶黄素的提取。日立CR21GⅡ高速冷冻离心机10000r/min离心4或5或6min，收集上清液，再向离心管中加入5mL的90％(v/v)乙醇，启动3秒停2秒，40％的频率超声振荡4或5或6分钟，反复萃取3或4或5或6次，直到溶液变为澄清为止。

5.微囊藻叶黄素的纯化。向步骤4收集的上清液按2:1的比例加入20％(w/v)的氢氧化钾-乙醇溶液于4℃冰箱中皂化1.5或2或2.5h，然后加入60-90℃的石油醚萃取28或29或30或31或32min，除去水相，保留有机相，在分液漏斗中进行，有机相用蒸馏水冲洗至PH中性(PH6.5－7.5)。(用PH试纸检测)

6.微囊藻叶黄素的浓缩与干燥。同实施例1。

7.叶黄素成品的储存。同实施例1。

通过上述二个实施例的技术措施，获得的提取之前需将收集的蓝藻制成藻粉，便于储存和后面的提取，用藻粉提取也可以使叶黄素的提取率提高。

所述的制备藻粉的方法采用的是喷雾干燥的方式，此方法能快速大量干燥水华蓝藻，更节省能源。

所述的步骤3中水华蓝藻细胞破碎的方式为超声波破碎，此法与直接有机溶剂萃取和酶解法等方法相比能够快速破碎细胞，缩短了提取时间，也节约了能源，最重要的是没有产生污染。

所述的步骤4中叶黄素的提取溶剂采用的是90％的乙醇，相比其他的有机溶剂如丙酮、二氯甲烷等，90％乙醇提取效果更好，而且没有毒性，挥发性高，能容易的去除。

所述的步骤5中收集的上清液可以先用氮吹仪通空气浓缩后再加入皂化液皂化，可以节约皂化液的使用量，同时也可防止皂化液对叶黄素结构的破坏。

所述的步骤5中用石油醚萃取后的溶液调节PH的方法为用蒸馏水冲洗至中性，因为叶黄素在中性时最为稳定，加酸加碱都会对其结构产生影响。

所述的步骤5中溶液PH调节至中性后可以用无水硫酸钠或无水氯化钙进行干燥除去少量多余的水分。

通过上述技术措施，可以快速获取纯度较高的蓝藻叶黄素。

Claims (1)

1.一种水华蓝藻叶黄素的提取方法，其步骤是：

A、水华蓝藻的选择：取水华蓝藻样品显微镜检测，选择相对单一物种的水华蓝藻；

B、蓝藻前期处理：收集选择的蓝藻，喷雾干燥制成藻粉；

C、蓝藻细胞破碎：称取0.1g-10g的藻粉按1:10-1:30的比例加入90%v/v的乙醇，通过超声波破碎仪，启动3秒停2秒，40%的频率破碎15－25分钟的程序破碎蓝藻细胞；

D、蓝藻叶黄素的提取：高速冷冻离心机10000r/min离心4－6min，收集上清液，再向离心管中加入5mL的90%v/v乙醇，启动3秒停2秒，40%的频率超声振荡4－6分钟，反复萃取3－6次，直到萃取液变为澄清为止；

E、蓝藻叶黄素的纯化：向步骤（D）的上清液中按2:1的比例加入20%w/v的氢氧化钾-乙醇溶液于4℃冰箱中皂化1.5－2.5h，然后加入60-90℃的石油醚萃取28－32min，除去水相，保留有机相，在分液漏斗中进行，有机相用蒸馏水冲洗至PH中性；

F、叶黄素成品的浓缩与干燥：将得到的叶黄素溶液于通风橱中用氮吹仪通气干燥制成叶黄素成品；

G、叶黄素成品的储存：将得到的叶黄素成品放在自封袋中于-20℃冰箱避光存放储存待用。