CN104761481B

CN104761481B - 一种从蛹虫草中提取叶黄素的方法

Info

Publication number: CN104761481B
Application number: CN201410727076.4A
Authority: CN
Inventors: 李耀亭; 范远景; 史成龙; 盛新颖
Original assignee: Anhui Nong Da Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Henan jinjiayuan Cordyceps Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2034-12-04
Also published as: CN104761481A; CN103664725A

Abstract

本发明涉及一种从蛹虫草中提取叶黄素的高效方法。所述方法包括备料、发酵处理、离子液体提取和纯化多个步骤，通过对提取工艺的优化组合，并开创性地采用离子液体/助剂的复合提取模式，从而实现了从蛹虫草中高效提取叶黄素的目标，获得了远远高于现有技术中的提取率的技术效果，大大提高了原料的利用率，且避免使用大量有机溶剂，具有绿色环保、适宜大规模生产的优点，具有广泛的工业化应用前景。

Description

一种从蛹虫草中提取叶黄素的方法

技术领域

本发明属于从天然植物中提取药物有效成分的技术领域。更具体地，本发明涉及一种从蛹虫草中高效提取叶黄素的高效方法。

背景技术

叶黄素，又名“植物黄体素”，是一种优异的抗氧化剂，是唯一可存在于眼睛水晶体中的类胡萝卜素成分，可用于预防老年性眼球视网膜黄斑区病变引起的视力下降或失明，以及预防肌体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤疾病。

在自然界中，叶黄素与玉米黄素共存，是构成玉米、蔬菜、水果、花卉等植物色素的主要组分。基于其优异的抗氧化性，价格昂贵，被称为“天然黄金”。因此，从20世纪80年代中期开始，科研人员就开始关注叶黄素的各种生理功能，以及从天然植物中进行人工萃取和应用。现有技术中已存在多种方法提取叶黄素的报道，其主要分为：微波提取法、干燥法、有机溶剂萃取法、超临界CO₂提取法等。例如：

CN102174005A的专利申请中报道了一种从万寿菊干花中提取叶黄素的方法，其以四氢呋喃和碱性醇溶液为提取皂化溶剂，通过同时进行提取皂化反应进而提取叶黄素粗品，最终通过醚类溶剂、蒸馏水和乙醇洗涤除杂，获得叶黄素纯品。

CN101532045A的专利申请公开了一种以万寿花为原料，酶法提取叶黄素的方法。其技术方案为将粉碎的万寿花与安琪酵母粉的水溶液混合，发酵后先后加入乙醇、干粉活性炭，经过滤、烘干即可。

付鸣佳等(“蛹虫草产类胡萝卜素的研究”，《食品与生物技术学报》，第24卷第5期，2005年9月，第107-110页)对蛹虫草中的类胡萝卜素进行了研究，但并未提供任何的纯化分离手段。

闫喜涛等(“人工培养蛹虫草中一种天然色素的分离和结构鉴定”，《菌物学报》，第29卷，第5期，2010年，第777-781页)则报道了一种分离叶黄素的工艺并申请了相关专利，但其提取率很低，每2 kg的蛹虫草中仅能获得8 mg的叶黄素，并且提取过程中使用大量有机溶剂，不符合绿色环保理念，在工业化生产中存在安全隐患。

如上所述，虽然存在多种从蛹虫草中提取叶黄素的方法，然而却存在提取率低下、原料利用率极低的弊端。因此如何实现从人工蛹虫草中高效提取叶黄素的工艺成为研究领域的一个重要问题。

众所周知，离子液体由体积较大的有机阳离子和体积较小的无机阴离子构成，其具有诸多优点：(1) 不会造成环境污染且可用于低压条件；(2) 热稳定性和化学稳定性高；(3) 液态温度范围宽，一般室温下为液态；(4) 阴阳离子的特定组合设计可有效提高有机物的溶解性适合选择性用作萃取。因此，离子液体作为一种绿色环保、多功能型溶剂而引起了人们的广泛关注。

针对现有技术中存在的人工蛹虫草利用率低、叶黄素提取率低的缺陷，以及离子液体的功能性优势，本发明经过大量研究、筛选，旨在开发一种从人工蛹虫草中提取叶黄素的组合式提取方法，充分满足医药、化工领域的普遍需求，实现工业上规模化提取的目的。

发明内容

针对现有技术存在的诸多缺陷，本发明人经过大量的深入的研究，在付出了充分的创造性劳动后，开发了一种从蛹虫草中提取叶黄素的高效方法。

具体而言，本发明提供了一种从蛹虫草中提取叶黄素的方法，所述方法包括如下步骤：

A、备料

取蛹虫草，水洗、自然晾干后，再粉碎、研磨后充分混合均匀，过筛，得到蛹虫草粉末。

根据本发明的一种选择方式，所述蛹虫草可为人工蛹虫草或天然蛹虫草。

根据本发明的一种优选方式，所述步骤A中的蛹虫草粉末的粒度为10-50目，优选20-40目。

B、发酵处理

称取步骤A得到的蛹虫草粉末和安琪酵母粉，溶于30-50℃的温水中，恒温隔绝空气进行发酵12-24小时，得到发酵液。

根据本发明的一种优选方式，所述步骤B中的安琪酵母粉为人工蛹虫草粉末重量的0.1-2%，优选为0.3-0.8%，非限定性地例如可为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%或0.8%。

根据本发明的一种优选方式，所述步骤B中的温水为35-40℃，例如可为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。

所述步骤B中的发酵时间优选为18-22 h，例如可为18 h、19 h、20 h、21 h或22 h。选择合适的发酵温度、时间均至关重要，因为温度过高或时间太长会影响导致杂质增多或增加生产成本，温度过低或时间过短则会造成发酵不完全而影响后续的提取。

C、离子液体提取和纯化

将步骤B的发酵液使用过滤网过滤，除去酵母成分，所用过滤网网孔为100-150目，向所得滤液中加入离子液体，混合混匀后，再加入提取助剂，置于超声提取釜中于40-50℃下提取20-30 min，然后分离得提取液；将所得提取液经反萃取、真空浓缩后，柱色谱分离，冷冻干燥，即得到叶黄素。

根据本发明的一种优选方式，步骤B中的蛹虫草粉末与所述步骤C中的离子液体的重量比为1:5-15，非限定性地可为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15，更优选1:8-12。在本发明的提取工艺中，离子液体大的用量越大，提取率会逐渐增大，但当增加到一定程度时，其提取率增加不明显，故为了节约溶剂、降低成本而选择离子液体的用量在一定范围之内。

根据本发明的一种优选方式，所述步骤C离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑对甲苯磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐、 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、 1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐或1-丁基-3-甲基咪唑高氯酸盐中的任意一种，更优选1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐中的任意一种。对提取剂而言，其创新或核心所在为提取剂的合适选择，其必须能够识别目标物和其它物质的微小差异而实现目标物的选择性提取，而本发明人正是在经过大量的创造性实验之后，从大量的有机溶剂、离子液体中探索出了最适合从蛹虫草中提取叶黄素的少数几种离子液体，其中很多离子液体(如季铵类离子液体、吡啶类离子液体等)均无法实现叶黄素的顺利提取。此外，采用离子液体替换现有有机溶剂的萃取工艺大幅提高了萃取率，并且避免了有机溶剂对环境的污染，达到了绿色环保的要求，因而具备大规模生产的优势。

根据本发明的一种优选方式，所述步骤C中的提取助剂为β-环糊精、18-冠-6、15-冠-5、聚乙二醇400、聚乙二醇600中的任意一种，更优选18-冠-6、15-冠-5中的任意一种；所述步骤C中提取助剂的用量为离子液体重量的2-8%，优选2-5%。本发明人经过大量的实验研究开发了适于配合上述离子液体使用的提取助剂，在提取过程中加入一定量的提取助剂，与离子液体形成协同式提取剂，通过两种组分的协同作用可有效提高叶黄素的提取率，达到充分利用物料的目的。

根据本发明的一种优选方式，所述步骤C中的超声条件为：超声功率为200-300 W，提取时间为20-30 min，提取温度为40-50℃。

根据本发明的一种优选方式，所述步骤C中的反萃取所使用的溶剂为氯仿、甲醇中的任意一种。反萃取采用本领域常规是操作步骤，且在本发明的提取工艺中，反萃取后的离子液体余液经蒸除残余溶剂后循环可再循环利用。

采用HPLC-MS/MS法、辅助紫外-可见吸收光谱法以及薄层色谱法测定直接分析鉴定叶黄素。本发明的测试步骤与闫喜涛等(“人工培养蛹虫草中一种天然色素的分离和结构鉴定”，《菌物学报》，第29卷，第5期，2010年，第777-781页)公开的方法相同，鉴定结果相同，即所的产物为叶黄素：3,3’-二羟基-α-胡萝卜素。

采用HPLC法分析叶黄素的含量，具体步骤为：采用VP-ODS C18柱(150 ×4.6 mm)，检测波长454 nm，流动相为V(CH₂Cl₂) : V(CH₃OH): V(CH₃CN): V(H₂O) = 32:29:38:1，流速为0.5 ml/min，进样量为10 μL，温度为室温。准确称取叶黄素标准品0.1 g，用二氯甲烷溶解，配成一系列浓度：0.005 g/ml、0.01 g/ml、0.02 g/ml、0.03 g/ml、0.04 g/ml和0.05 g/ml，最小质量浓度为1×10^-5 g/ml，测定不同浓度下的峰面积，然后以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，然后确定提取物中的叶黄素含量。

与现有技术相比，本发明带来的有益效果是：

目前，现有技术中缺乏从蛹虫草中提取叶黄素的有效手段，而本发明人弥补了该项空白，其通过大量的创造性劳动和实验筛选出适合提取的由离子液体/助剂构成的复合提取剂，配合酵母法、超声提取等有效手段，优化工艺参数和提取条件，实现了叶黄素的高效提取，大大提高了原料的利用率，且避免使用大量有机溶剂，具有绿色环保、适宜大规模生产的优点，具有广泛的工业化前景和市场价值。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1：考察离子液体的种类

A、备料

取1 kg人工蛹虫草，水洗、自然晾干后，再粉碎、研磨后充分混合均匀，过20目筛，收集得到人工蛹虫草粉末。

B、发酵处理

称取步骤A得到人工蛹虫草粉末100 g和安琪酵母粉0.5 g，其中安琪酵母粉为人工蛹虫草粉末重量的0.5%，溶于35℃的温水中，恒温隔绝空气进行发酵20小时，得到发酵液。

C、离子液体提取和纯化

将步骤B的发酵液使用过滤网过滤，所用过滤网网孔为150目，向滤液中加入离子液体800 g，混合混匀后，再加入40 g提取助剂18-冠-6，置于超声提取釜中于超声功率300W、40℃下提取20 min，然后分离得提取液；所得提取液经氯仿反萃取、真空浓缩后，柱色谱分离，冷冻干燥，即得到叶黄素。

采用HPLC-MS/MS法、辅助紫外-可见吸收光谱法以及薄层色谱法测定直接分析鉴定叶黄素，采用HPLC法分析叶黄素的含量。

当步骤C中使用不同的离子液体时，其结果如下表1所示：

表1

人工蛹虫草粉末/g	离子液体	叶黄素总量/mg	叶黄素纯度(HPLC)
				100	1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐	1.31	99.5%
100	1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐	1.52	99.8%
				100	1-丁基-3-甲基咪唑对甲苯磺酸盐	0.94	99.6%
100	1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐	0.93	99.5%
				100	1-丁基-3-甲基咪唑高氯酸盐	1.07	99.7%
100	三丁基铵四氟硼酸盐	0.21	84.5%
				100	三丁基铵氯化盐	0.36	86.1%
100	N-丁基吡啶四氟硼酸盐	0.14	82.3%
				100	--	0.22	83.9%

“--”表示未加入任何离子液体

由表1的结果可见，作为提取剂的离子液体种类对提取结果至关重要，但并非任何的离子液体有均可用于人工蛹虫草中叶黄素的提取，其具有不可预期性。经过试验验证仅有1-丁基-3-甲基咪唑对甲苯磺酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐、 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、 1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐或1-丁基-3-甲基咪唑高氯酸盐中具备优异的提取效果，其中1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐、 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐表现最佳，而相同条件下季铵类离子液体(如三丁基铵四氟硼酸盐、三丁基铵氯化盐)、吡啶类离子液体(如N-丁基吡啶四氟硼酸盐)以及不加入任何离子液体时，所达到的效果较差且差异显著

实施例2：考察提取助剂的种类

A、备料

取1 kg人工蛹虫草，水洗、自然晾干后，再粉碎、研磨后充分混合均匀，过30目筛，收集得到人工蛹虫草粉末。

、发酵处理

称取步骤A得到人工蛹虫草粉末100 g和安琪酵母粉1 g，其中安琪酵母粉为人工蛹虫草粉末重量的1%，溶于40℃的温水中，恒温隔绝空气进行发酵18小时，得到发酵液。

C、离子液体提取和纯化

将步骤B的发酵液使用过滤网过滤，所用过滤网网孔为100目，向滤液中加入1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐1000 g，混合混匀后，再加入40 g提取助剂，置于超声提取釜中于超声功率200 W、50℃下提取30 min，然后分离得提取液，将所得提取液经甲醇反萃取、真空浓缩后，柱色谱分离，冷冻干燥，即得到叶黄素。

当步骤C中使用不同的提取助剂时，其结果如表2所示：

表2

人工蛹虫草粉末/g	助剂种类	叶黄素总量/mg	叶黄素纯度(HPLC)
				100	18-冠-6	1.45	99.8%
100	15-冠-5	1.67	99.6%
				100	聚乙二醇400	1.02	99.7%
100	聚乙二醇600	1.13	99.5%
				100	β-环糊精	1.07	99.4%
100	吡啶	0.51	99.1%
				100	三丁胺	0.24	98.7%
100	苄基三乙基氯化铵	0.33	98.9%
				100	四丁基溴化铵	0.45	99.2%
100	--	0.32	98.4%

“--”表示未加入提取助剂

由表2的结果可知，提取助剂β-环糊精、18-冠-6、15-冠-5、聚乙二醇400或聚乙二醇600与离子液体的协同复配作用而大幅提高了提取率，其中18-冠-6、15-冠-5作为提取助剂的提取效果最为优异，而本发明人尝试选择其他助剂(如吡啶、三丁胺、苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵)或无助剂添加时则均无法达到相同的提取效果。

实施例3：考察离子液体的用量

A、备料

取1 kg人工蛹虫草，水洗、自然晾干后，再粉碎、研磨后充分混合均匀，过40目筛，收集得到人工蛹虫草粉末。

、发酵处理

称取步骤A得到人工蛹虫草粉末100 g和安琪酵母粉1.5 g，其中安琪酵母粉为人工蛹虫草粉末重量的1.5%，溶于40℃的温水中，恒温隔绝空气进行发酵22小时，得到发酵液。

C、离子液体提取和纯化

将步骤B的发酵液使用过滤网过滤，所用过滤网网孔为150目，向滤液中加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，混合混匀后，再加入提取助剂18-冠-6，其中提取助剂的用量为离子液体重量的5%，置于超声提取釜中于超声功率250 W、40℃下提取25 min，然后分离得提取液，所得提取液经氯仿反萃取、真空浓缩后，柱色谱分离，冷冻干燥，即得到叶黄素。

步骤C中使用不同离子液体用量时的结果如下表3所示：

表3

人工蛹虫草粉末/g	离子液体用量(g)	叶黄素总量/mg	叶黄素纯度(HPLC)
				100	400	0.73	99.6%
100	500	1.25	99.8%
				100	600	1.43	99.7%
100	700	1.47	99.5%
				100	800	1.50	99.8%
100	900	1.52	99.7%
				100	1000	1.55	99.6%
100	1100	1.56	99.8%
				100	1200	1.57	99.6%
100	1400	1.41	99.5%
				100	1500	1.22	99.4%

实施例4：考察助剂的用量

A、备料

、发酵处理

称取步骤A得到人工蛹虫草粉末100 g和安琪酵母粉2 g，其中安琪酵母粉为人工蛹虫草粉末重量的2%，溶于35℃的温水中，恒温隔绝空气进行发酵20小时，得到发酵液。

C、离子液体提取和纯化

将步骤B的发酵液使用过滤网过滤，所用过滤网网孔为100目，向其中加入1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐1000 g，混合混匀后，再加入提取助剂15-冠-5，置于超声提取釜中于超声功率200 W、40℃下提取30 min，然后分离得提取液，所得提取液经甲醇反萃取、真空浓缩后，柱色谱分离，冷冻干燥，即得到叶黄素。

步骤C中使用不同提取助剂用量时的结果如下表4所示：

表4

人工蛹虫草粉末/g	提取助剂用量(g)	叶黄素总量/mg	叶黄素纯度(HPLC)
				100	10	1.02	99.5%
100	20	1.42	99.7%
				100	30	1.45	99.6%
100	40	1.60	99.6%
				100	50	1.63	99.8%
100	60	1.59	98.3%
				100	70	1.56	98.6%
100	80	1.54	98.5%
				100	90	1.07	99.6%
100	100	1.02	99.2%

由表3和表4的结果可知，基于提取率和成本节约等因素的考量，离子液体和助剂的用量均适合在一定的范围内，用量过少或过多均存在一定程度的提取率较低或增加生产负担的缺点。尽管原因尚未明确，但可能是由离子液体/助剂的组合与叶黄素分子的特异性识别有关，其经过上述试验验证离子液体的用量适于采用人工蛹虫草粉末与离子液体的重量比为1:5-15的合适比例，更优选1:8-12；而提取助剂的用量适于采用占离子液体重量的2-8%，优选2-5%。

实施例5：考察发酵步骤的参数

A、备料

B、发酵处理

称取步骤A得到人工蛹虫草粉末100 g和安琪酵母粉1 g，其中安琪酵母粉为人工蛹虫草粉末重量的1%，溶于温水中，恒温隔绝空气进行发酵，得到发酵液。

C、离子液体提取和纯化

将步骤B的发酵液使用过滤网过滤，过滤网网孔为150目，向其中加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐800 g，混合混匀后，再加入40 g提取助剂18-冠-6，置于超声提取釜中于超声功率300 W、40℃下提取20 min，然后分离得提取液；将所得提取液经氯仿反萃取、真空浓缩后，柱色谱分离，冷冻干燥，即得到叶黄素。

步骤C中使用不同的发酵温度、发酵时间时的结果如下表5所示：

表5

人工蛹虫草粉末/g	发酵温度(℃)	发酵时间(h)	叶黄素总量/mg	叶黄素纯度(HPLC)
					100	30	20	1.12	99.5%
100	32	20	1.16	99.8%
					100	34	20	1.27	99.6%
100	35	20	1.35	99.5%
					100	36	20	1.38	99.7%
100	38	20	1.41	99.5%
					100	40	20	1.50	99.8%
100	42	20	1.22	92.3%
					100	45	20	1.19	89.7%
100	40	16	1.13	99.5%
					100	40	18	1.44	99.8
100	40	22	1.51	99.6%
					100	40	24	1.21	91.4%
100	40	26	1.21	89.3%

由表5的结果可知，发酵步骤应采用不同合适的温度和时长，这是基于酶活性以及发酵效果的考虑，为保持产品的提取量和纯度，发酵温度适合在35-40 ℃，时长在18-22效果最佳。

综上所述，本发明人通过大量的文献调研以及实验探索，通过对提取工艺的优化组合，并开创性的采用离子液体/助剂的复合提取模式，而实现了从人工蛹虫草中高效提取叶黄素的目标，并已在工业生产中进行中试放大实验且效果优异。其中，任何的工艺参数选择和提取手段配合均倾注了本发明人的大量心血，令人可喜地是，该提取工艺也意外获得了远远高于现有技术中的提取率的技术效果，具有广泛的工业化应用前景。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims

1.一种从人工蛹虫草中提取叶黄素的方法，所述方法包括如下步骤：

A、备料

取人工蛹虫草，水洗、自然晾干后，再粉碎、研磨后充分混合均匀，过筛，得到人工蛹虫草粉末；

B、发酵处理

称取步骤A得到的人工蛹虫草粉末和安琪酵母粉，溶于30-50℃的温水中，恒温隔绝空气进行发酵12-24小时，得到发酵液；

C、离子液体提取和纯化

将步骤B的发酵液使用过滤网过滤，除去酵母成分，所用过滤网网孔为100-150目，向所得滤液中加入离子液体，混合混匀后，再加入提取助剂，置于超声提取釜中于40-50℃下提取20-30min，然后分离得提取液；将所得提取液经反萃取、真空浓缩后，柱色谱分离，冷冻干燥，即得到叶黄素；

所述步骤C中的人工蛹虫草粉末与离子液体的重量比为1:5-15；

所述步骤C中的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐中的任意一种；

所述步骤C中的提取助剂为18-冠-6、15-冠-5中的任意一种；

所述步骤C中提取助剂的用量为离子液体重量的2-8％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A中的人工蛹虫草粉末的粒度为10-50目。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤A中的人工蛹虫草粉末的粒度为20-40目

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的安琪酵母粉为人工蛹虫草粉末重量的0.1-2％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的安琪酵母粉为人工蛹虫草粉末重量的0.3-0.8％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤B中的温水为35-40℃，所述步骤B中的发酵时间为18-22h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤C中的人工蛹虫草粉末与离子液体的重量比为1:8-12。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤C中提取助剂的用量为离子液体重量的2-5％。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤C中的超声条件为：超声功率为200-300W，提取时间为20-30min，提取温度为40-50℃。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤C中的反萃取溶剂为氯仿、甲醇中的任意一种。