CN102442916A - 从柑橘落果中提取天然活性产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于柑橘天然产物提取技术领域，具体涉及从柑橘生理落果中连续提取天然活性产物如辛弗林、橙皮苷和柠檬苦素的方法。采用干燥后粉碎至20-100目的柑橘落果为原料，按重量/体积比1∶10-1∶50加入50-90％的乙醇在40-80℃下回流提取1-3h，过滤，滤液回收乙醇，得浓缩液备用；将该浓缩液加入少量氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75℃，过滤，加0.1mol/L的盐酸调节pH至3-4进行沉淀得橙皮苷粗品；将所得的氯仿层溶液旋干，加入适量丙酮结晶，真空干燥得辛弗林粗品；将结晶过滤后的丙酮溶液旋干，加入二氯甲烷溶解，过滤，按体积比1∶2向溶液中加入异丙醇，结晶得柠檬苦素粗品。利用高压液相色谱法对所得三种活性产物进行了定性和定量分析，其中以橙皮苷的纯度最高，为91.41％。
Description
技术领域
本发明属于植物天然产物的提取技术领域，具体涉及一种从柑橘生理落果中连续提取天然活性产物如辛弗林、橙皮苷和柠檬苦素等活性产物的方法。
背景技术
柑橘属在分类学上为芸香科(Rutaceue)柑橘属(Citrus)植物，为世界的第一大水果，2005年世界柑橘产量达到1亿多吨，中国约为1500万吨，仅次于巴西和美国(叶兴乾，柑橘加工与综合利用.北京：中国轻工业出版社，2005，12-15；李建敏等，联合提取柑桔皮中精油、色素、果胶和橙皮苷.生物质化学工程，2007a，41(1)：22-24)。我国柑橘种质资源丰富，是世界许多柑橘种类的原产地，世界各国的许多柑橘品种最初都引自我国。目前，中国柑橘品种仍然以宽皮柑橘为主，约占总种植面积的55％，甜橙占30％，柚子占10％，其它柑橘类占5％(田世英，我国柑橘产业基本情况及发展思路，中国农业信息，2004(2)：7)。柑橘属容易成花，但座果率较低，一般为3％～5％，丰产树可达10％左右，低产树通常不到1％(钟云等，柑橘落花落果的原因及防止措施，广东农业科学.2006(3)：62-63)。
柑橘各种类品种间，落果、落花、落蕾比例不同，宽皮橘类是以落果为主，占落花落果总数的83％-97％，而橙类是以落蕾落花为主，占落花落果总数的69％-77％。柑橘落花落果严重，座果率低，是一普遍现象。其幼果由于生理原因凋落为生理落果。生理落果有两个明显的高峰期，柑橘落果从调查的数据看，其第一次生理落果在5月上中旬(即花谢后1-2周)，幼果从果梗(花梗与枝的结合部)处脱落，落果的数量多，约占总落果量的73％-99％，时间短而集中；第二次落果高峰期出现在6月上旬，幼果枯黄后从蜜盘(子房基部和果蒂之间)处脱落，至6月下旬以后生理落果才基本停止，但落果的果实较大，约占总落果量的0.02％-27％(李玲等，赣中南柑橘果实生长发育规律与栽培技术关系，长江流域资源与环境，1998，7(4)：359-363；胡国元，柑桔落花落果与使用生长调节剂的研究初报，湖南农业科学，2003(3)：43-44)。
目前，对柑橘加工废弃物的研究越来越受到人们的重视，对柑橘皮渣利用的主要途径之一就是围绕其所含成分的提取而展开的，如从中提取香精油、色素、果胶、类黄酮、膳食纤维等。柑橘果渣的另一个主要利用途径就是利用微生物发酵，如生产果醋、乳酸饮料、高蛋白饲料和栽培食用菌(乔海鸥等，柑橘皮的综合利用，浙江柑橘，2003，20(2)：31-35；叶兴乾，柑橘加工与综合利用，中国轻工业出版社，北京，2005，12-15)。而对于柑橘的生理落果的利用，人们的重视程度还不够。生理落果是柑橘果实发育过程中的一种正常现象。在发展柑橘生产中，从栽培到收获都会有大量的落花、落果及残、次果实。在保花保果的同时，生理落果及蔬果依然占很大比重。柑橘的落花落果的资源很容易被人忽视。如果充分利用柑橘的落果以及蔬果，就能充分保证其中有效成分的提取和利用，将对有效保护环境，提高柑橘综合利用价值有重大意义。同时，将落果提取后的残渣进行营养成分分析，用微生物发酵制备饲料或肥料，可以最大化提高落果的综合利用率。柑橘落果资源的充分利用，不仅可以促进柑橘栽培业的发展，也可为制药等行业提供丰富的原料(周鸣谦等，不同品种柑橘落果的药用成分研究，湖南农业大学学报(自然科学版)，2008，34(4)：438-441)。
我国对柑橘落果的利用，主要是单一提取柠檬酸或者橙皮苷，对落果的利用还不够充分，部分企业有意从单一提取逐步向综合利用转变，如果能连续从柑橘落果中提取辛弗林、橙皮苷、柠檬苦素类似物等有效成分，将会大大提高对柑橘落果的综合利用，并推动我国柑橘产业的发展。我国柑橘种植面积广阔，落果资源丰富，因而成为具有工业化生产价值的原料。现有工艺都只对利用落果中某一成分进行了研究，落果中其它成分得不到充分的利用，造成很大的浪费。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种从柑橘生理落果中连续提取天然活性产物如辛弗林、橙皮苷和柠檬苦素的方法。
本发明通过下列技术方案实现：
一种从柑橘生理落果中连续提取天然活性产物辛弗林、橙皮苷和柠檬苦素的方法，其步骤包括：
(1)将柑橘落果清洗干净，于80℃下烘干后粉碎过20-100目分析筛，得到预处理柑橘落果粉；
(2)称取2.0-3.0g步骤(1)的预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1∶40-1∶50，于40-50℃水浴中加热回流8h，挥干石油醚后，再于100-105℃下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；
(3)将步骤(2)得到的脱脂柑橘落果粉按重量/体积比为1∶10-1∶50加入浓度为50-90％的乙醇，40-80℃下回流提取1-3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；
(4)将步骤(3)所得的浓缩液按体积比为1∶2-1∶3加入氯仿结晶后，加水分层，水层直接加热到75℃，趁热过滤，加0.1mol/L的盐酸调节pH至3-4进行沉淀，得到橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；
(5)将步骤(4)所得的氯仿层溶液旋干，按体积比为1∶2-1∶3加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50℃，真空度为800mmHg干燥条件(采用DZF-6021真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司生产)下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；
(6)将步骤(5)所得的结晶过滤后的丙酮溶液旋干，按体积比为1∶2-1∶3加入二氯甲烷溶解，过滤，将得到的二氯甲烷溶液按体积比为1∶2加入异丙醇，混匀后在4℃下结晶得到柠檬苦素粗品；
(7)将步骤(4)、(5)、(6)所得的三种活性成分粗品，用高效液相色谱仪(HPLC)进行定性和定量分析。
其中：
步骤(6)所述的柠檬苦素HPLC定性条件为：检测波长：210nm；流动相：乙腈/水＝45/55(v/v)；流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样量：10μL；橙皮苷HPLC定性条件为：检测波长：280nm；流动相：水∶乙腈∶四氢呋喃∶乙酸体积比为80∶16∶3∶1；流速：1.0mL/min；辛弗林HPLC定性条件为：检测波长：225nm；流动相：乙腈∶水∶磷酸体积比为32∶68∶0.2，内含0.2g十二烷基磺酸钠(SDS)/100mL；流速：1.0mL/min；柱温：室温。
作为优选方法之一，上述方法中的步骤(1)的前处理原料的最佳粉碎粒径为过60目分析筛，步骤(3)的回流温度是60-75℃，脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量体积比为1∶40-1∶55，乙醇的浓度为45-60％，共计提取3次，每次提取时间为2h。
作为优选方法之二，所述的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量体积比为1∶50，所述乙醇的浓度为50％。乙醇的回流温度为70℃。
本发明较好的解决了现有技术存在的缺陷，现有工艺主要是从柑橘落果中单一提取柠檬苦素或者橙皮苷，只对落果中某一活性成分进行了研究，而落果中其它活性成分的利用还不够充分，造成很大的浪费。本发明从柑橘落果中连续提取辛弗林、橙皮苷、柠檬苦素类似物等有效成分，将会大大提高对柑橘落果的综合利用价值，并将推动我国柑橘产业的发展。
附图说明
图1：本发明的柑橘生理落果有效成分提取的总工艺流程图。
图2：不同粒径下活性成分的提取率。
图3：提取温度与活性成分提取率的关系。
图4：提取时间与活性成分提取率的关系。
图5：提取固液比与活性成分提取率的关系。
图6：提取浓度与活性成分提取率的关系。
图7：提取次数与活性成分提取率的关系。
图8：橙皮苷液相色谱图及紫外图谱，其中图8-a为橙皮苷标准品的液相色谱图及紫外图谱，图8-b为样品中橙皮苷的液相色谱图及紫外图谱。
图9：辛弗林高效液相色谱图及紫外图谱，其中图9-a为辛弗林标准品的液相色谱图及紫外图谱，图9-b为样品中辛弗林的液相色谱图及紫外图谱。
图10：柠檬苦素高效液相色谱图及紫外图谱，其中图10-a为柠檬苦素标准品的液相色谱图及紫外图谱，图10-b为样品中柠檬苦素的液相色谱图及紫外图谱。
具体实施方式
实施例1
1、实验材料：以80℃烘干粉碎脐橙(品种为朋娜，一个中国南方广泛推广的优质脐橙品种，朋娜脐橙落果来自湖北省松滋市望春花果汁有限公司柑橘园)的第一次生理落果和第二次生理落果的果实。
2、实验方法
(1)将脐橙落果清洗干净，于80℃下烘干后粉碎过50目分析筛，得预处理柑橘落果粉；
(2)称取3.0g预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1∶40，于40-50℃水浴中加热回流8h，挥干石油醚后再于100-105℃下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；
(3)将步骤(2)所得的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量/体积比为1∶30，乙醇浓度为70％，于60℃下回流提取1-3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；
(4)将步骤(3)所得的浓缩液按体积比为1∶2加入氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75℃，趁热过滤，再用0.1mol/L的盐酸调节pH至3-4进行沉淀得橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；
(5)将步骤(4)的氯仿层溶液旋干(RE52-99型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产，按照仪器说明书操作)，按体积比为1∶3加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50℃，真空度为800mmHg条件下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；
(6)将步骤(5)的结晶过滤后的丙酮溶液旋干(RE52-99型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产，按照仪器说明书操作)，按体积比为1∶2加入二氯甲烷溶解，过滤，将获得的二氯甲烷溶液按体积比为1∶2加入异丙醇，混匀后在4℃下结晶得到柠檬苦素粗品。
实施例2
按照实施例1的基本步骤。脐橙来源同实施例1.
(1)将脐橙落果清洗干净，于80℃下烘干后粉碎过20目分析筛，得预处理柑橘落果粉；
(2)称取3.0g预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1∶40，于40-50℃水浴中加热回流8h，挥干石油醚后再于100-105℃下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；
(3)将步骤(2)所得的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量/体积比为1∶10，乙醇浓度为90％，于40℃下回流提取1-3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；
(4)将步骤(3)所得的浓缩液按体积比为1∶2加入氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75℃，趁热过滤，再用0.1mol/L的盐酸调节pH至3-4进行沉淀得橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；
(5)将步骤(4)的氯仿层溶液旋干，按体积比为1∶3加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50℃，真空度为800mmHg条件下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；
(6)将步骤(5)的结晶过滤后的丙酮溶液旋干，按体积比为1∶2加入二氯甲烷溶解，过滤，将获得的二氯甲烷溶液按体积比为1∶2加入异丙醇，混匀后在4℃下结晶得到柠檬苦素粗品。
实施例3
按照实施例1的基本步骤。脐橙来源同实施例1.
(1)将柑橘落果清洗干净，于80℃下烘干后粉碎过100目分析筛，得预处理柑橘落果粉；
(2)称取2.0-3.0g预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1∶40，于50℃水浴中加热回流8h，挥干石油醚后再于100-105℃下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；
(3)将步骤(2)所得的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量/体积比为1∶50，乙醇浓度为50％，于80℃下回流提取1-3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；
(4)将步骤(3)所得的浓缩液按体积比为1∶3加入氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75℃，趁热过滤，再用0.1mol/L的盐酸调节pH至3-4进行沉淀得橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；
(5)将步骤(4)的氯仿层溶液旋干，按体积比为1∶2加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50℃，真空度为800mmHg条件下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；
(6)将步骤(5)的结晶过滤后的丙酮溶液旋干，按体积比为1∶2加入二氯甲烷溶解，过滤，将获得的二氯甲烷溶液按体积比为1∶2加入异丙醇，混匀后在4℃下结晶得到柠檬苦素粗品。
实施例4
按照实施例1的基本步骤。脐橙来源同实施例1。
1、实验材料：以80℃烘干粉碎处理朋娜脐橙落果，得到预处理柑橘落果粉。
2、实验方法
2.1柑橘落果粉碎最佳粒径的确定
以朋娜脐橙第一次生理落果为原材料，于80℃烘干粉碎，分别过20目、40目、60目、80目和100目分析筛，分别精确称取0.5g朋娜脐橙落果粉，先用料(未脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比为1∶30的60％浓度的乙醇在70℃下回流提取2h，将滤液混合，用蒸馏水定容至50mL，利用高压液相色谱法(HPLC)测定柑橘落果提取物中辛弗林，柠檬苦素和橙皮苷含量。
含量测定：直接用高效液相色谱测定柠檬苦素、辛弗林及橙皮苷的浓度。再按下列公式计算各自提取率：提取率(μg/mg)＝C×V/W(式中：C为样品液浓度；V为体积：W为原料重)。
结果如图2所示。由图2可见，随着粒径的变小，总的提取率是逐渐增大的。但在60目过后，增加的幅度已经很小了，且有下降趋势。故柑橘落果原料在60目粒径下三种活性成分均达到较高提取率，确定柑橘落果粉的碎粒径为60目为最佳实施方式。
2.2柑橘落果复合提取前脱脂与否的确定
以80℃处理下朋娜脐橙的两次生理落果为原料进行活性成分的提取，比较原料脱脂与否对活性成分得率的影响。利用HPLC分别测定提取物中辛弗林，柠檬苦素和橙皮苷的含量。
称取2.0-3.0g柑橘落果粉，置于已称重的滤纸筒内，将滤纸筒封好后放入索氏抽提器内。连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1∶40-1∶50，于40-50℃水浴中加热回流8h，挥干溶剂后再于100-105℃下干燥，得到脱脂柑橘落果粉。
由表1可见，脐橙的两次生理落果的果实脱脂后效果不同，第一次生理落果的果实脱脂后，三种活性成分(辛弗林，柠檬苦素和橙皮苷)的提取得率均有不同程度的减少；第二次生理落果脱脂后，辛弗林的得率减少，橙皮苷和柠檬苦素脱脂后得率反而提高了。因此生产实践中可专门针对脐橙第二次生理落果的果实进行脱脂处理。
表1柑橘落果粉是否脱脂对活性成分提取率的影响
综合以上分析，采用乙醇回流法从柑橘(脐橙)落果中制备活性成分提取液时，证明柑橘落果粉在60目分析筛粒径下提取辛弗林，柠檬苦素和橙皮苷均达到较高的提取率，最终确定落果粉碎粒径应为过60目分析筛。对于第二次生理落果进行脱脂处理提高了三种活性物质(辛弗林，柠檬苦素和橙皮苷)的提取率，有利于上述三种活性产物的综合提取。
实施例5
按照实施例1的基本步骤。脐橙来源同实施例1。
1、实验材料：以80℃烘干粉碎处理的朋娜脐橙的第二次生理落果作为实验材料。
2、实验方法
2.1单因素实验
以80℃处理下的朋娜脐橙的第二次生理落果的果实为原料，选取温度、时间、固液比、浓度等对活性成分提取率有影响的因素进行单因素实验，确定其适宜范围。
2.1.1提取温度对朋娜脐橙的第二次生理落果活性成分提取率的影响
在不同温度下用浓度为60％乙醇以重量体积比为1∶20的料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比回流提取2h，其结果见图3所示，橙皮苷的提取率变化随温度的升高逐渐增大，辛弗林和柠檬苦素两种活性成分略有减少。综合考虑选用70℃为提取温度。
2.1.2提取时间对脐橙第二次生理落果活性成分提取率的影响
在60℃下用60％乙醇以1∶20(W/V)的料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比回流提取不同时间，结果如图4所示，柠檬苦素、辛弗林、橙皮苷三种活性成分的提取率变化随时间的延长略有增加，提取时间为2h时辛弗林和橙皮苷的提取率达到最大值。
2.1.3固液比对脐橙第二次生理落果活性成分提取率的影响
将60％浓度的乙醇以不同的料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比组合在60℃下回流提取2h，结果如图5所示，柠檬苦素、辛弗林、橙皮苷三种活性成分的提取率变化随料液比的增加逐渐增加，选定合适的料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比为1∶40(W/V)。
2.1.4浓度对脐橙第二次生理落果活性成分提取率提取率的影响
用不同百分浓度的乙醇以1∶20(W/V)的料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比在60℃下回流提取2h，结果如图6所示，其中柠檬苦素、辛弗林和橙皮苷三种活性成分的提取率随浓度的增加有所下降，当乙醇浓度为60％时三种活性成分的提取率较高，因此选取最佳乙醇浓度为60％。
2.2正交实验
根据单因素实验结果，对影响脐橙第二次生理落果活性成分提取率的因素(温度、时间、料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比、浓度等)，采用L9(34)正交实验来确定提取最佳条件，正交实验设计见表2。柠檬苦素、辛弗林和橙皮苷三种活性成分提取条件的正交试验结果及方差分析分别见表3、表4、表5、表6所示。
表2提取条件正交试验因素与水平
说明：料液比是指脱脂柑橘落果粉与乙醇的重量/体积
表3浸提条件正交试验结果
表4柠檬苦素提取条件正交试验结果分析
*F0.10(2，2)＝9.00，**F0.05(2，2)＝19.00，***F0.01(2，2)＝99.00
由表4的极差分析表明，四个因子对柑橘落果中柠檬苦素提取率的影响顺序为：浓度(D)＞温度(A)＞料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比(C)＞时间(B)，最佳条件组合为A3B2C1D1。方差分析表明，料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比、浓度和温度的影响均显著，浓度的影响最为明显。
表5辛弗林提取条件正交试验结果分析
*F0.10(2，2)＝9.00，**F0.05(2，2)＝19.00，***F0.01(2，2)＝99.00
由表5可知，极差分析表明，四个因子对辛弗林提取率影响的顺序为：温度(A)＞浓度(D)＞时间(B)＞料(脱脂后的柑橘落果粉)液(乙醇)比(C)，最佳条件组合为A1B2C1D3。方差分析表明：温度的影响达到极显著水平，浓度的影响达较显著水平，时间和料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比的影响较小。
表6橙皮苷提取条件正交试验结果分析
*F0.10(2，2)＝9.00，**F0.05(2，2)＝19.00，***F0.01(2，2)＝99.00
由表6可知，极差分析表明，四个因子对橙皮苷提取率的影响顺序为：温度(A)＞料(脱脂后的柑 橘落果粉)液(乙醇)比(C)＞时间(B)＞浓度(D)，最佳条件组合为A3B1C3D1。方差分析表明，温度的影响达到极显著水平，料(脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比的影响达到显著水平，温度和时间的影响较小。
综合上述三种活性成分的正交实验结果可知，柑橘生理落果中柠檬苦素在乙醇水体系中的最佳浸提条件为80℃，2h，料(脱脂后的柑橘落果粉)液(乙醇)比1∶30(W/V)，浓度50％乙醇；辛弗林在乙醇水体系中的最佳浸提条件为60℃、2h；橙皮苷在乙醇水体系中的最佳浸提条件为80℃、料(脱脂后的柑橘落果粉)液(乙醇)比为1∶50(W/V)。
2.3最佳提取条件的结果验证
根据正交实验结果，考虑到温度对辛弗林和橙皮苷的影响较大，因此分别选择在70℃，60℃，80℃温度下，用浓度50％乙醇，1∶50(W/V)的料(脱脂后的柑橘落果粉)液(乙醇)比提取2h作为乙醇水体系同时提取柑橘生理落果三种活性成分，最终确定最适宜浸提条件。
表7验证性实验数据表
说明：料液比是指脱脂柑橘落果粉与乙醇的重量/体积
结果见表7。由表可知，在其他提取条件一致的情况下，70℃下三种活性成分的平均提取率高于60℃和80℃下的提取率。故确定最佳提取条件为：温度70℃，用浓度50％乙醇，1∶50(W/V)的料(脱脂后的柑橘落果粉)液(乙醇)比提取2h作为乙醇水体系同时提取柑橘生理落果三种活性成分。
2.4浸提次数的选择
按照正交实验所得的最佳条件提取4次，每次浸提完后过滤，滤液定容至100mL，按高效液相方法测定其峰面积，计算柠檬苦素、辛弗林和橙皮苷的提取率，绘制提取次数与总提取率的关系曲线，结果见附图7。
由图7可见，对于柠檬苦素，提取次数对提取率的影响不大。对于橙皮苷和辛弗林，提取次数达3次时，总的提取率的上升趋势已平稳，因此这三种活性成分的提取率在最佳条件下进行三次，可以较低经济成本达到较好的提取率：柠檬苦素2.19μg/mg、辛弗林4.85μg/mg、橙皮苷24.47μg/mg。
综合以上分析，确定柑橘生理落果三种活性成分的最佳提取条件为：采用50％浓度乙醇回流，料(脱脂后的柑橘落果粉)液(乙醇)比1∶50(W/V)，温度70℃，提取3次，每次提取2h。
实施例6
参照实施例的步骤。
1、实验材料：以80℃烘干并粉碎的朋娜脐橙的第二次生理落果作为实验材料。
2、实验方法
2.1橙皮苷的制备
按照前述实施例1的步骤，采用乙醇回流法得到活性成分提取液，经过旋蒸干后得到糖浆状浓缩液，利用橙皮苷不溶于氯仿而溶于70℃热水，辛弗林和柠檬苦素均溶于氯仿的性质，加入少量氯仿结晶后，加水分层，水层直接加热到75℃，趁热过滤，考察沉淀方式对橙皮苷含量的影响。沉淀方式主要有两种：
(1)直接静置沉淀；
(2)加稀酸调节pH约3-4，静置沉淀。
通过比较两种沉淀方式的产率，确定精制工艺。
表8不同沉淀方式处理对橙皮苷得率的影响
由表8可见，加酸沉淀的平均得率高于直接沉淀，且直接沉淀的水液容易发霉变质。故选用加0.1M稀盐酸调节pH至3-4进行沉淀得橙皮苷粗品。
2.2辛弗林的制备
利用辛弗林溶于丙酮，柠檬苦素不溶的性质，取氯仿层溶液用旋转蒸发仪蒸干后，按体积比为1∶2-1∶3加入丙酮，使辛弗林结晶，真空干燥(温度为50℃，真空度为800mmHg，DZF-6021真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司生产)得到辛弗林粗品。
2.3柠檬苦素的制备
柠檬苦素的制备参考文献(陈丕玲，从芸香科果实中提取柠檬苦素的方法，专利公开号CN 1279242，发明名称：柑橘籽中柠檬苦素的提取与抑菌性研究，农产品加工(学刊)，2006，10：105-107)，将结晶过滤后的丙酮溶液用旋转蒸发仪蒸干，利用二氯甲烷溶解过滤，得到的二氯甲烷溶液按体积比1∶2的比例加入异丙醇混匀后在4℃结晶得到柠檬苦素粗品。
2.4橙皮苷HPLC定性分析
称取10-35mg的橙皮苷粗品，用甲醇溶解并定容到10mL，用HPLC定性定量，利用面积归一法计算其纯度。橙皮苷色谱条件根据参考文献(Dhuique-Mayer C，Caris-Veyrat C，Ollitrault P，Curk F，Amiot M J.Varietal and Interspecific Influence on Micronutrient Contents in Citrus from the Mediterranean Area.J AgricFood Chem，2005，53：2140-2145)略作修改。具体参数是：检测波长：280nm；流动相：水∶乙腈∶四氢呋喃∶乙酸体积比为80∶16∶3∶1；流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样量：10μL。
橙皮苷样品与对照品的高效液相色谱图见图8所示。由图8可见，样品保留时间(9.268min)与对照品数据基本一致，紫外光谱图中橙皮苷在283nm左右波长处有最大吸收峰。
2.5辛弗林HPLC定性分析
称取8-20mg的辛弗林粗品，用浓度为95％的乙醇溶解并定容至10mL，用HPLC定性定量分析，利用面积归一法计算其纯度。辛弗林色谱条件据参考文献(罗朝晖等，反相离子对高效液相色谱法测定枳实中辛弗林的含量，中国药房，2006，17：1502-1503)略作修改。参数是：检测波长：225nm；流动相：乙腈∶水∶磷酸体积比为32∶68∶0.2，内含0.2g十二烷基磺酸钠(SDS)/100mL；流速：1.0mL/min；柱温：室温。
辛弗林样品与对照品的高效液相色谱图见图9所示。由9图可知，样品保留时间(15.647min)与对照品数据基本一致，辛弗林的紫外吸收光谱图在225nm，275nm处有最大吸收峰。
2.6柠檬苦素HPLC定性分析
称取4-10mg的柠檬苦素粗品，用乙腈溶解并定容至10mL，用HPLC定性定量分析，利用面积归一法计算其纯度。柠檬苦素色谱条件根据参考文献(刘亮等，高效液相色谱法测定柑橘中的柠檬苦素类似物，食品与发酵工业，2007b，33：130-133)略作改动。其具体参数是：检测波长：210nm；流动相：乙腈/水体积比为45/55；流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样量：10μL。
柠檬苦素样品与对照品的高效液相色谱图见图10，由图10可知，样品保留时间(7.986min)与对照品数据基本一致，柠檬苦素的紫外吸收光谱图在210nm处有最大吸收峰。
利用HPLC定量，用面积归一法测得柠檬苦素、辛弗林、橙皮苷三种粗品的纯度，结果见表9。
表9HPLC测定柑橘落果粉活性提取物柠檬苦素、辛弗林和橙皮苷粗品纯度值
由表9，在最佳提取工艺下制备的柠檬苦素、辛弗林、橙皮苷三种活性成分粗品，利用HPLC定量，用面积归一法测得这三种粗品的纯度分别为29.94％，56.49％，91.41％。其中柑橘落果粉中提取的橙皮苷的纯度最高。
综上所述，本发明采用乙醇回流法从柑橘生理落果中制备活性成分提取液，逐一分离出橙皮苷、辛弗林和柠檬苦素三种活性成分，最终确定了三种活性成分的最佳提取工艺为：采用浓度为50％乙醇回流，柑橘落果粉与乙醇的重量体积比为1∶50(W/V)，乙醇回流温度为70℃，共计提取3次，每次提取2h。其提取率分别为：柠檬苦素0.22％、辛弗林0.49％和橙皮苷2.45％。利用HPLC定量测得这三种活性成分的粗品纯度分别为29.94％，56.49％和91.41％。
Claims (4)
1.一种从柑橘落果中提取天然活性产物的方法，其步骤包括：
(1)将柑橘落果清洗干净，于80℃下烘干后粉碎过20-100目分析筛，得预处理柑橘落果粉；
(2)称取2.0-3.0g预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1∶40-1∶50，于40-50℃水浴中加热回流8h，挥干石油醚后再于100-105℃下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；
(3)将步骤(2)所得的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量/体积比为1∶10-1∶50，乙醇浓度为50-90％，于40-80℃下回流提取1-3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；
(4)将步骤(3)所得的浓缩液按体积比为1∶2-1∶3加入氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75℃，趁热过滤，再用0.1mol/L的盐酸调节pH至3-4进行沉淀，得到橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；
(5)将步骤(4)的氯仿层溶液旋干，按体积比为1∶2-1∶3加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50℃，真空度为800mmHg条件下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；
(6)将步骤(5)的结晶过滤后的丙酮溶液旋干，按体积比为1∶2-1∶3加入二氯甲烷溶解，过滤，将获得的二氯甲烷溶液按体积比为1∶2加入异丙醇，混匀后在4℃下结晶得到柠檬苦素粗品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的预处理柑橘落果粉的粉碎粒度为50-70目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的回流温度为60-75℃，所述的脱脂后的柑橘落果粉与乙醇的重量/体积比为1∶40-1∶50，乙醇的浓度为52-60％，每次提取时间为2h。
4.根据权利要3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的回流温度为70℃，所述的脱脂柑橘落果粉与乙醇的重量/体积比为1∶50，所述乙醇的浓度为50％。
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