CN102351782A - 一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明主要涉及一种从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇的方法，大大地提高1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇得率和纯度。提出了一整套从桑叶分离提取得到高纯度的1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇，采用醇回流提取，膜过滤，浓缩，萃取，活性碳脱色后，通过控制结晶和重结晶条件分别得到1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇纯品。整个分离过程中对环境条件和设备要求不高，分离时间最短，纯度最高，对原材料的综合利用率最高；另外，分离材料易得便宜，分离操作过程简单，易控制，采用结晶和重结晶，纯化效率高，使用试剂无毒安全，成本低。
Description
所属技术领域：
本发明涉及一种从桑叶中快速提取分离1-脱氧野尻霉素、白藜芦醇的工艺技术，属于生物分离工程的技术领域。
背景技术
我国桑树资源及产量均居世界首位，全国各地均有栽培。目前大部分地区将桑作为饲用栽培，每年入冬后随着冬蚕饲养减少，大量桑叶都被废弃。桑叶味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏风清热、平肝明目的功效；在药理上具有抗炎、降血糖、降血脂、利尿等作用，这些药理活性归功于桑叶中的1-脱氧野尻霉素(DNJ)、白黎芦醇等成分，因而研究桑叶中的这两种成分的提取技术具有重要意义。
DNJ是一种哌啶生物碱，化学名称是3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，其分子式是C6H13NO4(结构式见图1)。作为葡萄糖的类似物，其环上的氮原子取代了原来的氧原子，由于结构上的相似性使得DNJ可以伪装成许多糖类酶促水解反应中的底物，竞争性抑制参与反应的糖苷酶活性，从而降低血液中葡萄糖的含量。糖苷酶可以催化许多生物反应，如糖蛋白翻译后的处理、碳水化合物的消化和糖聚合体的溶酶体代谢等。白黎芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，有顺、反两种构型，其中反式是稳定结构，而且生物活性更加广泛。近些年来，国内外很多学者对DNJ和白藜芦醇的生物学功能进行了深层研究，结果表明DNJ作为糖苷酶抑制剂表现出优秀的抑制肿瘤转移、降血糖、抗炎、抗病毒等药理活性；白藜芦醇具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化等多方面有益于人体健康的生物活性。
图1脱氧野尻霉素和葡萄糖的结构
到目前为止，已在多种植物中发现了白藜芦醇，如葡萄科的葡萄属、蛇葡萄属，豆科的落花生属，百合科的藜芦属，蓼科的蓼属等植物如虎杖、何首乌、葡萄、花生等。目前白藜芦醇主要从虎杖、葡萄皮和某些豆类中提取，来源极为有限。中国四川出产的中药虎杖中以甙的形式存在的白藜芦醇含量，理论值为葡萄皮的200倍。因此，公开号为CN99115156.9、CN01126769.0、CN03147908.1的中国专利介绍了一种从中药虎杖中提取白藜芦醇的工艺的方法，是将虎杖根粉碎，用乙醇提取；过大孔树脂柱，减压浓缩，萃取得白藜芦醇精品。这些专利都是以虎杖根为原材料进行提取白藜芦醇，目前由于虎杖资源溃乏，价格从原来的1元/kg涨到了3.5元/kg。原材料的成本急剧上涨，98％白藜芦醇的价格从1600元/kg上涨到了2800元左右/kg。
公开号为CN200510040625.1的中国专利介绍了一种从花生根提取白藜芦醇的生产方法，是将花生根粉碎，用乙醇提取；过大孔树脂柱，减压浓缩，萃取得白藜芦醇精品。虽然能缓解虎杖资源溃乏，但是白藜芦醇在花生中含量很低，成本比用虎杖根提取白藜芦醇的价格还要高，不利于工业化生产。
随着植物科学技术的发展，人们陆续在桑、野拓草、风信子、桔梗科植物中发现了1-脱氧野尻霉素，并且以桑叶中的1-脱氧野尻霉素含量最高。在已公开的中国专利200710060127.2、200810236144.1、200710067498.3中涉及到提取分离1-脱氧野尻霉素，但在分离过程中都用到了丙酮、氯仿、正己烷、二乙胺等有毒、易燃的有机溶剂。由于1-脱氧野尻霉素和白黎芦醇主要应用于药品和食品行业，采用这些专利方法提取的1-脱氧野尻霉素和白黎芦醇产品对人类健康不利；另外在中国专利200910192542.2中虽没有引入有毒试剂进行分离纯化，使用絮凝剂进行絮凝沉淀时间很长，1-脱氧野尻霉素和白黎芦醇在此过程中易损失，不利于提高其产率，再者所采用的工艺过程复杂，生产条件要求高，产率低，不利于降低生产成本。
1-脱氧野尻霉素在桑叶中含量最高，而且白藜芦醇和白藜芦醇甙在桑叶中也有一定含量，取材方便，分布广泛，价格便宜。因而，对桑进行综合深加工意义非凡，探索从桑中同时提取1-脱氧野尻霉素和白藜芦醇，其意义相当远大。
发明内容
本发明采用的技术方案包括：干燥过后的桑叶经用水提、过滤、脱色后用树脂吸附、乙醇洗脱，干燥后制得DNJ纯品；桑叶水提后残渣经用乙醇溶液提取、过滤、减压浓缩、萃取、脱色结晶制得白藜芦醇纯品。
因此，本发明提供一种从桑叶提取DNJ和白藜芦醇的方法，步骤包括：
(1)粉碎干燥桑叶，并将桑叶、水按重量(kg)/体积比(L)＝1∶7-15进行混合，加热回流提取；
(2)过滤除渣后，减压浓缩；
(3)将浓缩液进行活性碳脱色，将脱色后溶液上KLFC-150大孔吸附树脂柱，使用乙醇浓度为30-80％，梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩到一定体积后室温过夜结晶和重结晶，得DNJ纯品。
(4)将水提后的桑叶残渣与70％乙醇按重量(kg)/体积比(L)＝1∶5-10进行混合，加热回流提取；
(5)过滤除渣后，减压浓缩至无乙醇味；
(6)将浓缩液用2-3倍体积的乙酸乙酯萃取，分离乙酸乙酯层并进行浓缩，直至获得干燥物；
(7)加入70％乙醇进行加热溶解，然后加入活性碳进行脱色；
(8)向脱色后的溶液加入95％乙醇将溶液的乙醇浓度调至43％，室温过夜结晶，得白藜芦醇纯品。
在一个实施方案中，步骤2和5的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤。其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。
在一个实施方案中，步骤4中所加入的70％乙醇、桑叶残渣，其体积(L)/重量(kg)比＝5-10∶1。
在另一个实施方案中，步骤4中不加入70％乙醇，只加入活性碳脱色，再进行浓缩直至获得干燥物。
在另一个实施方案中，步骤6中乙酸乙酯萃取次数为3次。
在另一个实施方案中，步骤8中乙醇终浓度为43％。
技术效果：
1、本发明方法中所用的原料、设备均为常见的普通原料、设备，避免了工业化生产过程中对于昂贵原材料、仪器的依赖，大大地降低了生产成本；
2、桑树种植容易，扦插、籽播均可，产量高、价格低，来源方便，后续资源有保障。使用桑叶作为虎杖等药材的替代，既大大提高了桑叶的利用效率，提高桑叶的附加值，又摆脱了对于虎杖等药材的依赖，完全缓解了市场对虎杖等药材的大量需求，同时又能对废弃桑叶充分利用，保护了虎杖等药用资源。
3、本发明方法操作简单，极大的降低了DNJ和白藜芦醇的生产成本，简化了生产过程。
4、本发明所用的试剂均为无毒、廉价、量产的化学试剂，整个过程中可利用成熟的试剂回收常规技术，这极大地降低了向环境排放废弃物。
附图说明：
图1：桑叶提取液中白藜芦醇的HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
图2：白藜芦醇标准品的HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
图3：桑叶提取液中DNJ的HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
图4：DNJ标准品的HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1：
粉碎干燥桑叶100kg，加入水700L，86℃加热回流提取2h，提取液经三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤后，减压浓缩至100L，加50kg颗粒活性碳进行脱色30min，脱色后溶液使用KLFC-150大孔吸附树脂进行分离，先使用纯水的洗脱杂质，然后使用30％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至50L，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到205g DNJ样品。
桑叶水提后残渣用70％乙醇500L，80℃加热回流提取2h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至60L(无乙醇味)，然后浓缩液用150L乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯层进行浓缩至50L，加5kg颗粒活性碳进行脱色30min，脱色后溶液再用95％的乙醇41L，将溶液的乙醇浓度调至43％，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到430g白藜芦醇样品。
检测设备为Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱为Hypersil ODS(250mm×4.6mm，5μ)，白藜芦醇的检测条件：流动相为35％乙腈的水溶液、检测波长为303nm、流速为1ml/min、进样量为20μL；DNJ经衍生试剂进行衍生后的液相色谱检测条件：流动相为乙腈与0.1％醋酸体积比11/16、检测波长为254nm、流速为1ml/min、进样量为20μL。DNJ样品的纯度为98.73％、白藜芦醇样品的纯度为98.87％，结果如图1、图2、图3、图4所示。
实施例2：
粉碎干燥桑叶200kg，加入水1600L，86℃加热回流提取2h，提取液经三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤后，减压浓缩至180L，加90kg颗粒活性碳进行脱色30min，脱色后溶液使用KLFC-150大孔吸附树脂进行分离，先使用纯水的洗脱杂质，然后使用30％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至90L，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到421g DNJ样品。
桑叶水提后残渣用70％乙醇1150L，80℃加热回流提取2h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至110L(无乙醇味)，然后浓缩液用170L乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯层进行浓缩至95L，加8kg颗粒活性碳进行脱色30min，脱色后溶液再用95％的乙醇78L，将溶液的乙醇浓度调至43％，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到885g白藜芦醇样品。按实施例1的检测方法进行检测DNJ样品和白藜芦醇样品，DNJ样品的纯度为98.17％，白藜芦醇样品的纯度为98.45％。
实施例3：
粉碎干燥桑叶400kg，加入水3400L，86℃加热回流提取2h，提取液经三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤后，减压浓缩至350L，加80kg颗粒活性碳进行脱色30min，脱色后溶液使用KLFC-150大孔吸附树脂进行分离，先使用纯水的洗脱杂质，然后使用30％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至160L，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到830g DNJ样品。
桑叶水提后残渣用70％乙醇2500L，80℃加热回流提取2h，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤，减压浓缩至60L(无乙醇味)，然后浓缩液用150L乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯层进行浓缩至180L，加5kg颗粒活性碳进行脱色30min，脱色后溶液再用95％的乙醇148L，将溶液的乙醇浓度调至43％，缓慢降低温度到室温结晶24h，得到白藜芦醇样品。按实施例1的检测方法进行检测DNJ样品和白藜芦醇样品，DNJ样品的纯度为99.03％，白藜芦醇样品的纯度为98.66％，结果如表1所示。
Claims (5)
1.本发明提供一种从桑叶提取DNJ和白藜芦醇的方法，步骤包括：
(1)粉碎干燥桑叶，并将桑叶、水按重量(kg)/体积比(L)＝1∶7-15进行混合，加热回流提取；
(2)过滤除渣后，减压浓缩；
(3)将浓缩液进行活性碳脱色，将脱色后溶液上KLFC-150大孔吸附树脂柱，使用乙醇浓度为30-80％，梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩到一定体积后室温过夜结晶和重结晶，得DNJ纯品。
(4)将水提后的桑叶残渣与70％乙醇按重量(kg)/体积比(L)＝1∶5-10进行混合，加热回流提取；
(5)过滤除渣后，减压浓缩至无乙醇味；
(6)将浓缩液用2-3倍体积的乙酸乙酯萃取，分离乙酸乙酯层并进行浓缩，直至获得干燥物；
(7)加入70％乙醇进行加热溶解，然后加入活性碳进行脱色；
(8)向脱色后的溶液加入95％乙醇将溶液的乙醇浓度调至43％，室温过夜结晶，得白藜芦醇纯品。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤2和5的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤。其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤4中所加入的70％乙醇、桑叶残渣，其体积(V)/重量(kg)比＝15-10∶1。
4.根据权利要求1或2的方法，其中步骤6中乙酸乙酯萃取次数为3次。
5.根据权利要求1或2的方法，其中步骤8中乙醇终浓度为43％。
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