CN102391385B - 一种霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法,是将霍山石斛粉碎后加水微波恒温提取,将提取液真空浓缩至相对密度为110-1.30得到浓缩液;向浓缩液中加入乙醇,静置后离心得到沉淀物;将沉淀物加水溶解,在0.35MPa压力下使溶液通过分子量为100KD的超滤膜,收集截留液,然后在0.35MPa压力下使截留液通过分子量为300KD的超滤膜,收集通过液;将收集的通过液真空浓缩并干燥,得到霍山石斛多糖提取物。本发明可以缩短提取时间,在相同提取次数下,粗提物得率可由20%提高到35%左右;纯化后霍山石斛多糖得率可由5%左右提高到10-15%,霍山石斛多糖含量由40%提高到60%以上。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种生物活性多糖的提取、纯化方法,具体地说是一种霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法。
二、背景技术
霍山石斛最早记载于《本草纲目》,现为国家濒危物种保护植物,资源珍稀,药用价值极高,为历代医家所推崇,位列石斛之上品。霍山石斛的主要成分为多糖类,霍山石斛多糖为a-吡喃构型,平均分子量为2.2×104Da,由葡萄糖、甘露糖和半乳糖按31∶10∶8的分子摩尔比组成,此外还含有少量的生物碱及多酚类物质,研究表明多糖成分与霍山石斛的药效有着密切的关系。
天然多糖应用研究现状:
多糖作为药物始于1943年,50年代发现真菌多糖具有抗癌作用,后来又发现地衣、花粉及许多植物均含有多糖类化合物,并进行分离提纯,确定了其化学结构、物理化学性质、药理作用,尤其对多糖类化合物的抗肿瘤和免疫增强作用进行深入研究,到了60年代作为广谱免疫促进剂而引起了医药界的广泛关注,并逐渐认识到多糖及复合物分子具有极其重要的生物功能。1995年3月,亚洲分子生物学组织(AMBO)在日本举办了“糖生物学和糖工程”培训班。越来越多的研究证明,多糖不但能治疗机体免疫系统受到严重损伤的癌症,还能治疗多种免疫缺损疾病,如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌和病毒引起的慢性疾病,以及诸如风湿病之类的自身免疫疾病,有的还能诱导干扰素的产生。同时,作为药物的多糖在治疗肿瘤时,不像一般化疗药物直接杀死生长着的肿瘤细胞活补体、巨噬细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞或加强抗体生成等,以达到抑制和消灭肿瘤细胞的作用,对正常细胞影响很小。如研究表明,紫草和枸杞多糖具有抗突变、抗衰老、增强免疫功能的作用;枸杞多糖等可抵抗自由基过氧化;牛膝、人参多糖可提高小鼠天然杀伤细胞(NKC)的活性,诱生肿瘤坏死因子(TNF);香菇、商陆、松果、柴胡云芝多糖可激活巨噬细胞,从而抑制肿瘤生长;从三七、防风、甘草、刺五加中提取的多糖类化合物能激活网状内皮系统,发挥抗肿瘤作用;灵芝多糖通过活化巨噬细胞和蛋白激酶C(PKC)而发挥免疫增强作用等等。目前,已有部分天然多糖类化合物用于临床,显示出良好疗效,且无骨髓抑制等不良反应,可长期应用,预示了它抗肿瘤方面的良好发展前景。同时,多糖在治疗肿瘤、代谢及感染性疾病等方面的应用仍在不断扩大,给近代肿瘤、艾滋病及其它疾病的治疗开辟了新的方向[1~3]。
天然多糖的分离提纯:
将多糖同低分子有机物、无机盐等成分分离,或是同蛋白质、酯类、木质素等其它高分子量的自然产物分离。这样提取的多糖通常具有多分散性,表现在化学组成、聚合度、分子形状等分布不均一。因此,还要将这种多分散的多糖混合物分离纯化成分布均一的单个多糖组分。这种分离具有相当大的困难,但意义重大。因为初步研究表明,某种多糖的药效活性与其组成、分子结构及分子量水平都密切相关。免疫应答对单糖的化学结构是非特异性的,它主要由分子大小决定而不是单糖的化学结构。由于不同的植物中所含成分不同,从其中提取多糖成分的具体方法有很大差异,但通常都包括水提、醇沉、除脂、除蛋白、脱色、柱分离这些基本步骤。常规提取分离工艺复杂,生产周期长,从而增大了生产成本,使工业化生产和大规模临床应用受到限制。
石斛外壁有一定的纤维组织,所以常规提取方法时间较长,通常每次提取都在4小时以上,且需多次提取,能耗较高,但提取率较低。石斛多糖的纯化方法多采用有机溶剂除杂,工序繁琐,得率较低,不适于工业化生产。目前市场上铁皮石斛等制剂产品提取工艺简单,多采用简单水煎以粗多糖的形式利用,有的直接生药打粉入药,造成制剂作用成份不明确,质量可控性差,生物利用度低,服用量大,药效不显著等弊端,不符合中药现代化的要求。霍山石斛除枫斗初加工产品外,其它类型产品市场几乎空白。所以寻求新的提取、纯化方法对该珍稀物种的开发将起到积极作用。
微波萃取技术作为一种新型的萃取技术,具有加热速度快,加热均匀,节能高效,易于控制,可减少溶剂用量等优点。与常规提取法相比,微波萃取法在选择性与提取时间上都表现出无可比拟的优越性。与传统的乙醇回流提取法相比较,利用微波辅助提取不仅可以提高多糖的提取率,而且可以大大缩短提取时间,具有提高有效成分的提取率和劳动生产率的优点。
膜分离技术是指以选择性透过膜为分离介质,当膜两侧存在某种推动力(如压差、浓度差、电位差等)时,原料侧组分可选择透过膜,从而达到分离提纯的过程。膜分离过程作为一种新型的分离方法,与传统的分离过程如精馏、萃取、重结晶、吸附等相比,具有能耗低、单级分离效率高、可常温操作、无相变及化学变化、选择性高、设备简单、无污染等优点,适于处理热敏性物质和生物活性物质。
将该上述两项技术应用在霍山石斛多糖的制备中在国内外未见报道。
三、发明内容
本发明旨在提供一种霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法,所要解决的技术问题是寻找一种提取、纯化方法能够在缩短提取时间、避免有机溶剂繁琐萃取的前提下,获得较高纯度的生物活性多糖。
本发明解决技术问题采用如下技术方案:
本发明霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法的特点在于按以下步骤操作:
(1)微波提取:将霍山石斛粉碎成粗粉,向所得粗粉中加入粗粉质量10-30倍的水,于30-100℃微波恒温提取1-30分钟,提取1-4次;
(2)浓缩:合并步骤(1)得到的提取液,于真空度-0.06~-0.08MPa、温度≤80℃的条件下真空浓缩至相对密度为1.10-1.30(60℃)得到浓缩液;
(3)醇沉:向步骤(2)得到的浓缩液中加入95vt%(体积百分浓度,下同)乙醇,静置12-24小时后离心得到沉淀物;
(4)膜过滤:将步骤(3)得到的沉淀物用沉淀物质量20-50倍的60-80℃水溶解,在0.35MPa压力下使溶液通过分子量为100KD的超滤膜,收集截留液,然后在0.35MPa压力下使截留液通过分子量为300KD的超滤膜,收集通过液;
(5)干燥:将步骤(4)收集的通过液于真空度-0.06~-0.08MPa、温度≤80℃的条件下浓缩,然后在温度≤60℃的条件下真空干燥,得到霍山石斛多糖提取物。
本发明霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法的特点也在于:步骤(1)中微波恒温提取时微波的频率为2450MHz或915MHz、功率为500-15000W。
本发明霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法的特点也在于:步骤(3)中乙醇的加入量为所述浓缩液体积的1-5倍,使得含醇量达到50%-80%(体积百分比)。
与已有技术相比,本发明的有益效果体现在:
1、本发明方法可以将提取时间由每次4小时以上缩短到每次30分钟以内,在相同提取次数下,粗提物得率可由20%提高到35%左右。纯化后霍山石斛多糖得率可由5%左右提高到10%~15%,霍山石斛多糖含量由40%提高到60%以上。
2、本发明与现有技术相比,可有效保持多糖结构的稳定、完整,不至于失活,同时显著降低了能耗和生产成本。
3、本发明采用膜技术对具有生物活性的多糖进行选择性分离、纯化,避免了有机溶剂萃取及有机溶剂残留,适于规模化工业生产。
用本发明方法制备的生物活性多糖提取物,多糖含量大于60%,质量收率介于6%~15%之间。
四、附图说明
图1是葡萄糖标准曲线。
图2是霍山石斛多糖的分子量分布图。
图3是本发明提取纯化方法的工艺流程图。
五、具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述,这些描述并不是要对本发明内容作出限定。本领域的技术人员应理解,对本发明内容的技术特征所作的等同替换,或相应的改进,仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1:
1、微波提取:将霍山石斛30g粉碎成粗粉,向所得粗粉中加入600mL水,于2450MHz频率、功率500W、60℃微波恒温提取30min,提取4次,合并4次提取液;
2、浓缩:将步骤1得到的提取液在真空度-0.07~-0.08MPa,温度≤70℃的条件下浓缩至相对密度为1.15(60℃)得到浓缩液;
3、醇沉:向步骤2得到的浓缩液中加入95vt%(体积百分浓度,下同)乙醇得到混合液,混合液中乙醇的体积百分浓度为80vt%,静置24小时后于4000转/分钟转速下离心得到沉淀物4.3g;
4、膜过滤:向步骤3得到的沉淀物中加入100mL 60℃水使沉淀溶解,在0.35MPa压力下使溶液通过分子量为100KD的超滤膜,收集截留液,然后在0.35MPa压力下使截留液通过分子量为300KD的超滤膜,收集通过液;
5、干燥:将步骤4收集的通过液于真空度-0.06~-0.08MPa、温度≤80℃的条件下浓缩至相对密度1.31(60℃),然后在真空度-0.06~-0.08MPa、温度≤60℃的条件下真空干燥4小时,得到霍山石斛多糖提取物3.6g。
按照多糖含量测定方法测定,多糖含量为76.6%。对提取物进行薄层色谱鉴别,结果显示:供试品色谱中在与葡萄糖、甘露糖、半乳糖对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点。表明该多糖提取物含有霍山石斛多糖特征性成分。
对比例1:
取霍山石斛30g,粉碎成粗粉,加入600mL水于100℃水浴回流提取4小时,提取4次,合并4次提取液,真空浓缩(真空度-0.07~-0.08MPa,温度≤70℃)至相对密度为115(60℃)得浓缩液,向浓缩液中加入95vt%乙醇得到混合液,混合液中乙醇的体积百分含量为80vt%乙醇,静置24小时后于4000转/分钟转速下离心,得沉淀2.1g。按照多糖含量测定方法测定,多糖含量为40.5%。
通过对实施例1和对比例1的比较可以看出:本发明提取方法与现有技术相比,在相同提取次数下,提取时间由16小时减少到了2小时,大大减少了能耗,降低了生产成本。多糖得率由7%提高到了12%,提高了71.4%;多糖含量由40.5%提高到76.6%,提高了89.1%。
实施例2:
1、微波提取:将霍山石斛30g粉碎成粗粉,向所得粗粉中加入450mL水,于2450MHz频率、功率560W、80℃微波恒温提取10min,提取4次,合并4次提取液;
2、浓缩:将步骤1得到的提取液在真空度-0.07~-0.08MPa,温度≤70℃的条件下浓缩至相对密度为1.19(60℃)得到浓缩液;
3、醇沉:向步骤2得到的浓缩液中加入95vt%乙醇得到混合液,混合液中乙醇的体积百分浓度为80vt%,静置24小时后于4000转/分钟转速下离心得到沉淀物4.6g;
4、膜过滤:向步骤3得到的沉淀物中加入10mL 60℃水使沉淀溶解,在0.35MPa压力下使溶液通过分子量为100KD的超滤膜,收集截留液,然后在0.35MPa压力下使截留液通过分子量为300KD的超滤膜,收集通过液;
5、干燥:将步骤4收集的通过液于真空度-0.06~-0.08MPa、温度≤80℃的条件下浓缩至相对密度1.30(60℃),然后在真空度-0.06~-0.08MPa、温度≤60℃的条件下真空干燥4小时,得到霍山石斛多糖提取物3.0g。
按照多糖含量测定方法测定,多糖含量为78.2%。对提取物进行薄层色谱鉴别,结果显示供试品色谱中在与葡萄糖、甘露糖、半乳糖对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点。
本发明生物活性多糖含量测定:参照《中国药典》2010年版中多糖测定方法,采用硫酸-苯酚法,具体方法如下:
1、标准曲线的制备:
精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖14mg,置100mL量瓶中,加适量水溶解,稀释至刻度,摇匀,制成每毫升含140μg对照品溶液。分别精密量取对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL置具塞试管中,加水至2mL,再加入质量浓度5%的苯酚溶液1mL,摇匀,然后加入硫酸(质量浓度95%-98%)6mL,摇匀,置40℃水浴20min,取出,随后置冰水浴中冷却5min,取出。以相应的试剂为空白样,通过紫外分光光度法在488nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
拟合葡萄糖标准曲线得到线性回归方程y=0.04415x+0.00861,相关系数为0.9985。式中y为吸光度,x为葡萄糖浓度(mg·mL-1),标准曲线见图1。
2、样品测定:
取待测样品2mL,测定吸光度,根据回归方程计算多糖含量。
多糖的药理活性与其初级结构、高级结构、分子量、溶解度、粘度有着密切的关系,多糖分子的多级结构又与其分子量有着直接的关系,一般分子量为100~200kDa的高分子多糖呈现较强的活性。多糖的生物活性与其分子量有着直接关系,而膜分离技术正是利用其不同的孔径截留不同分子量物质的新型分离技术。
本发明对霍山石斛多糖分子量的分布进行了测定。根据文献【4】霍山石斛多糖为a-吡喃构型,平均分子量为2.2×104Da,由葡萄糖、甘露糖和半乳糖按31∶10∶8的分子摩尔比组成。
本发明在35℃、0.35MPa条件下选用截留分子量分别为400kDa、200kDa、100kDa、10kDa的滤膜对霍山石斛水溶液依次进行超滤,将多糖水溶液分为4段,测定每段的多糖含量,结果见图2。由图2可知,超滤后分子量>400kDa的石斛多糖约占总糖的20.2%,分子量在300-200kDa之间的石斛多糖占40.1%,分子量在200-100kDa之间的石斛多糖占26.5%,分子量<10kDa的寡糖和单糖约占13.2%。分子量为100-300kDa的石斛多糖具有较强活性,因此,选择分子量为100-300kDa的石斛多糖作为活性多糖制品进行后续实验。
对提取物进行薄层色谱鉴别。取多糖提取物约100mg,用10mL体积浓度为5%的硫酸100℃水解6小时,用质量浓度为1%的氢氧化钠溶液中和剩余硫酸,作为供试品溶液。另取葡萄糖、甘露糖、半乳糖对照品,分别加水制成每1mL含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版附录VI B)试验,吸取上述溶液各5ul,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇∶甲醇∶乙酸乙酯∶冰醋酸∶水的体积比为12.5∶4.5∶5∶1.5∶1.5的混合溶剂为展开剂,展开,取出,晾干,喷以体积浓度10%的硫酸乙醇溶液。结果:供试品色谱中在与葡萄糖、甘露糖、半乳糖对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点。表明该多糖提取物含有霍山石斛多糖特征性成分。
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Claims (2)
1.一种霍山石斛中生物活性多糖的提取、纯化方法,其特征在于按以下步骤操作:
(1)微波提取:将霍山石斛粉碎成粗粉,向所得粗粉中加入粗粉质量10-30倍的水,于30-100℃微波恒温提取1-30分钟,提取1-4次;微波恒温提取时微波的频率为2450MHz或915MHz、功率为500-15000W;
(2)浓缩:合并步骤(1)得到的提取液,于真空度-0.06~-0.08MPa、温度≤80℃的条件下真空浓缩至相对密度为1.10-1.30得到浓缩液;
(3)醇沉:向步骤(2)得到的浓缩液中加入乙醇,静置12-24小时后离心得到沉淀物;
(4)膜过滤:将步骤(3)得到的沉淀物用沉淀物质量20-50倍的60-80℃水溶解,在0.35MPa压力下使溶液通过分子量为100KD的超滤膜,收集截留液,然后在0.35MPa压力下使截留液通过分子量为300KD的超滤膜,收集通过液;
(5)干燥:将步骤(4)收集的通过液于真空度-0.06~-0.08MPa、温度≤80℃的条件下浓缩,然后在温度≤60℃的条件下真空干燥,得到霍山石斛多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的提取、纯化方法,其特征在于:步骤(3)中乙醇的加入量为所述浓缩液体积的1-5倍。
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