CN103417691A

CN103417691A - 一种以柑橘幼子的落果为原料生产柠檬苦素类提取物的方法

Info

Publication number: CN103417691A
Application number: CN2013103678159A
Authority: CN
Inventors: 肖文军; 熊硕; 秦昱; 滕杰
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2013-12-04

Abstract

一种以柑橘幼子的落果为原料生产柠檬苦素类提取物的方法，包括以食用乙醇从柑橘幼子的落果中提取柠檬苦素类粗提物，并将该粗提物以HP-20大孔吸附树脂分离纯化以得到纯度较高的柠檬苦素类提取物。该方法使用食用乙醇安全无毒地提取并分离柑橘幼子的落果中柠檬苦素类物质，真正地实现了安全、有效、经济、快速的柑橘落果资源的高值化利用，使废弃资源得到了充分的利用，充分体现了变废为宝的绿色化学生产理念。

Description

一种以柑橘幼子的落果为原料生产柠檬苦素类提取物的方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化柑橘幼子落果中柠檬苦素类化合物的绿色化学工艺技术，尤指一种采用HP-20大孔吸附树脂分离纯化柑橘幼子落果中柠檬苦素类化合物的绿色方法。

背景技术

柑橘属芸香科柑橘属植物，为世界的第一大水果，2006年我国柑橘种植面积达171.4万hm²，年产量高达1900万吨，分居世界第1位和第2位。每年柑橘生产过程中会产生数以万吨计的落果，落果树可占到总小果树的60%-85%，但柑橘的落果资源很容易被人忽视。如果充分利用柑橘的落果，从中提取并分离纯化柠檬苦素类物质等活性成分，就能充分保证柑橘落果中有效成分的开发利用，并对有效保护环境和提高柑橘综合利用价值有重大意义。因此，从柑橘落果中提取这些活性物质，不仅能变废为宝，提高柑橘的生产价值，造福果农，对于我国柑橘产业的持续发展也具有积极地促进作用。

柠檬苦素类化合物为一类三萜类物质，是植物次生代谢产物，主要存在于芸香科和楝科等植物中，柑橘中的柠檬苦素类化合物是柑橘产生苦味的主要原因之一。自1989年发现柠檬苦素类物质具有激活谷胱甘肽S-转移酶活性的功能以来，人们对其生物活性进行了大量研究，发现柠檬苦素类物质具有抗癌活性、昆虫拒食作用以及镇痛、抗炎、抗焦虑、镇静等作用。

目前，文献报道分离纯化柠檬苦素类物质的方法主要有有机溶剂提取法、重结晶和分布结晶法、硅胶柱层色谱、薄层色谱、大孔吸附树脂法及制备型高效液相色谱法等。有机溶剂提取法是目前国内外制备柠檬苦素类物质使用最广泛的方法，比较容易实现工业化生产。刘君用不同的有机溶剂提取柠檬苦素类物质，发现氯仿的效果最好，其次为丙酮和乙腈。王青山采用浸提脱脂，确定石油醚（60-90℃）为脱脂溶剂，利用丙酮为抽提溶剂进行索氏提取。王青山对香柚种子的丙酮提取物进行结晶法分离，选用二氯甲烷/异丙醇混合体系分离出柠檬苦素晶体。谈宗华利用酶解法提取柠檬籽中柠檬苦素类物质，并将提取液用AB-8树脂柱层析，洗脱液进行硅胶色谱柱层析，可得到含量90%以上的柠檬苦素类物质。何中燕从16种大孔吸附树脂中筛选出了最适合柠檬苦素类物质分离纯化的HPD-722大孔吸附树脂，得到的固形物中柠檬苦素类物质含量>30%，并申请了专利。

虽然，上述方法能够制备得到具有一定纯度和得率的柠檬苦素类提取物，但是由于受到技术手段的限制以及加工过程中使用了大量的有毒有机溶剂或化学制剂，使得产品明显存在安全性欠佳、产品的品质和市场竞争力不足等缺陷。

而大孔吸附树脂分离纯化方法具有工艺简单、再生方便、经济环保、安全绿色等优点，近年来，已经成为众多天然产物分离纯化常用的手段。但是，树脂类型的不同，会对柠檬苦素类物质的吸附与解析效果产生很大的差距，因此筛选出一种对柠檬苦素类物质具有良好吸附与解析效果的树脂具有重大意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种高效、绿色安全、低成本、高得率、高纯度、适用于工业生产的以柑橘幼子的落果为原料生产柠檬苦素类提取物的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种以柑橘幼子的落果为原料生产柠檬苦素类提取物的方法，包括以60%-80%体积浓度的食用乙醇于60-70℃从柑橘幼子的落果中回流提取柠檬苦素类粗提物；其特点是：还包括将上述柠檬苦素类粗提物以HP-20大孔吸附树脂分离纯化：将所述粗提物配制成柠檬苦素类物质浓度为4.0-5.0mg/mL的溶液，将此溶液以2-3.5BV/h的流速通过装有HP-20大孔吸附树脂的层析柱进行吸附及解析分离，待吸附饱和后，先用蒸馏水以3.0-5.0BV/h的流速冲洗树脂至无色，再用70%-80%体积浓度的食用乙醇以2-3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在-0.07～-0.09MPa、45-55℃条件下浓缩，回收食用乙醇，真空冷冻干燥，即可。

上述以60%-80%体积浓度的食用乙醇于60-70℃从柑橘幼子的落果中回流提取柠檬苦素类粗提物是指：取柑橘幼子的落果于50-60℃烘干后粉碎，用60%-80%体积浓度的食用乙醇，按1g落果粉加8-15ml食用乙醇的比例，在60-70℃下回流提取2.0-3.0h，提取次数为1-2次，过滤，所得粗滤液离心（转速为3000-4000r/min、时间为5-15min），取上清液；将上清液在-0.07～-0.09MPa、45-55℃条件下浓缩，回收食用乙醇溶剂，即得粗提物。

本发明方法中，采用经静态吸附与解析筛选出来的HP-20大孔吸附树脂吸附柠檬苦素类物质，对未被大孔吸附树脂吸附部分经减压浓缩回收食用乙醇。对上述步骤中吸附在大孔吸附树脂的柠檬苦素类物质进行洗脱回收时，先用蒸馏水洗至无色，再用70%-80%体积浓度的食用乙醇洗脱柠檬苦素类物质，得到的提取物的纯度和得率都较高。

本方法中使用的HP-20大孔吸附树脂的处理：购买的树脂先用95%体积浓度的乙醇浸泡48h后装柱（中间换一次乙醇），再用95%体积浓度的乙醇冲洗树脂，洗到流出的乙醇不混浊后，最后用蒸馏水洗树脂至流出液无醇味，待用。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、集成采用食用乙醇安全无毒地提取柑橘幼子落果活性成分和采用HP-20大孔吸附树脂分离纯化柑橘落果中的柠檬苦素类物质，不仅能工业化生产安全有效的不同规格的柑橘柠檬苦素类提取物以用于后续的功能产品的研发，而且真正地实现了安全、简便、合理、经济的柑橘落果资源的高值化利用和系列产品的工业化生产，充分体现出绿色化学生产的理念和循环经济的策略。因而，具有理论新颖、技术先进、操作及产品安全、工艺简便、经济可行、环境友好等优点。

2、本发明从不同极性范围的众多树脂中选用HPD400、HPD100、XAD-16、HZ806、AB-8、HPD-T02、HPD722、D101、DM130、LS308、LSA-5、HPD700、LS-300B、HP-20、HPD750和HPD500十六种大孔吸附树脂，从吸附量和解析率的角度全方位地考察该些树脂对柠檬苦素类物质吸附及解吸的水平大小，最终筛选出最优树脂为HP-20。

3、采用天然产物化学及现代化生产技术提取、分离纯化柑橘落果中柠檬苦素类物质，将其制成国际通行的各种纯度规格的柠檬苦素类提取物，为下一步的研究提供绿色环保型原材料，真正做到变废为宝，满足后续研究的需求。

具体实施方式

实施例1

取柑橘幼子的落果于60℃烘干后粉碎，用60%体积浓度的食用乙醇，按1g落果粉加10ml食用乙醇的比例，在70℃下回流提取2.0h，提取次数为1次，纱布初过滤，所得粗滤液用离心机以3600r/min离心沉淀10min，取上清液；将上清液在-0.07MPa、45℃条件下浓缩，回收食用乙醇溶剂，即得柑橘落果柠檬苦素类粗提物。选用已经预处理的HP-20大孔吸附树脂作为该粗提物的分离纯化树脂，将上述粗提物配制成柠檬苦素类物质浓度为4.5mg/mL的溶液。室温下，将此溶液以3.5BV/h的流速通过装有HP-20大孔吸附树脂的层析柱进行吸附分离，共上样10BV，先用5BV的蒸馏水以5.0BV/h的流速冲洗树脂至无色，再用5BV体积浓度为70%的食用乙醇以3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在-0.08MPa、50℃条件下浓缩，回收食用乙醇，真空冷冻干燥，采用Ehrlich试剂反应法测定柠檬苦素类物质的浓度，柠檬苦素类物质的得率为61.09%，纯度为33.66%。

实施例2

取柑橘幼子的落果于50℃烘干后粉碎，用70%体积浓度的食用乙醇，按1g落果粉加8ml食用乙醇的比例，在60℃下回流提取3.0h，提取次数为2次，合并提取液，纱布初过滤，所得粗滤液用离心机以4000r/min离心沉淀5min，取上清液；将上清液在-0.09MPa、55℃条件下浓缩，回收食用乙醇溶剂，即得柑橘落果柠檬苦素类粗提物。选用已经预处理的HP-20大孔吸附树脂作为该粗提物的分离纯化树脂，将上述粗提物配制成柠檬苦素类物质浓度为5.0mg/mL的溶液。室温下，将该溶液以3BV/h的流速通过装有HP-20大孔吸附树脂的分离柱进行吸附分离，共上样9BV，然后用6BV的蒸馏水以4.5BV/h的流速冲洗至无色，再用4BV体积浓度为80%的食用乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在-0.09MPa、55℃条件下浓缩，回收食用乙醇，真空冷冻干燥，采用Ehrlich试剂反应法测定柠檬苦素类物质的浓度，柠檬苦素类物质的得率为60.85%，纯度为36.07%。

实施例3

取柑橘幼子的落果于55℃烘干后粉碎，用80%体积浓度的食用乙醇，按1g落果粉加15ml食用乙醇的比例，在65℃下回流提取2.5h，提取次数为1次，纱布初过滤，所得粗滤液用离心机以3000r/min离心沉淀15min，取上清液；将上清液在-0.08MPa、50℃条件下浓缩，回收食用乙醇溶剂，即得柑橘落果柠檬苦素类粗提物。选用已经预处理的HP-20大孔吸附树脂作为该粗提物的分离纯化树脂，将上述粗提物配制成柠檬苦素类物质浓度为4.0mg/mL的溶液。室温下，将该溶液以2BV/h的流速通过装有HP-20大孔吸附树脂的分离柱进行吸附分离，共上样11BV，然后用4BV的蒸馏水以3BV/h的流速冲洗至无色，再用6BV体积浓度为75%的食用乙醇以2.5BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在-0.07MPa、45℃条件下浓缩，回收食用乙醇，真空冷冻干燥，采用Ehrlich试剂反应法测定柠檬苦素类物质的浓度，柠檬苦素类物质的得率为58.51%，纯度为34.57%。

对比试验1

将柑橘幼子的落果于60℃烘干后粉碎，用体积浓度为60%的食用乙醇，按1g落果粉加10ml食用乙醇的比例，于70℃下回流提取2.0h，提取次数为1次，纱布初过滤，所得粗滤液用离心机以3600r/min进行离心沉淀10min，取上清液；将上清液在-0.07MPa、45℃条件下浓缩，回收食用乙醇溶剂，即得柑橘落果柠檬苦素类粗提物。选用已经预处理的AB-8大孔吸附树脂作为该粗提物的分离纯化树脂，将上述粗提物配制成柠檬苦素类物质浓度为4.5mg/mL的溶液。室温下，将该溶液以3.5BV/h的流速通过装有AB-8大孔吸附树脂的分离柱进行吸附分离，共上样10BV，然后用5BV的蒸馏水以5BV/h的流速冲洗至无色，再用5BV体积浓度为70%的食用乙醇以3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在-0.08MPa、50℃条件下浓缩，回收食用乙醇，真空冷冻干燥，采用Ehrlich试剂反应法测定柠檬苦素类物质的浓度，柠檬苦素类物质得率为40.56%，纯度为22.18%。

对比试验2

将柑橘幼子的落果于60℃烘干后粉碎，用体积浓度为70%的食用乙醇，按1g落果粉加10ml食用乙醇的比例，于70℃下回流提取2.0h，提取次数为1次，纱布初过滤，所得粗滤液用离心机以3600r/min进行离心沉淀10min，取上清液；将上清液在-0.09MPa、45℃条件下减压浓缩，回收食用乙醇溶剂，即得柑橘落果柠檬苦素类粗提物。选用已经预处理的HPD-722大孔吸附树脂作为该粗提物的分离纯化树脂，将上述粗提物配制成柠檬苦素类物质浓度为4.0mg/mL的溶液。室温下，将该溶液以3.5BV/h的流速通过装有HPD-722大孔吸附树脂的分离柱进行吸附分离，共上样10BV，然后用4BV的蒸馏水以5BV/h的流速冲洗至无色，再用5BV体积浓度为70%的食用乙醇以3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在-0.08MPa、50℃条件下浓缩，回收食用乙醇，真空冷冻干燥，采用Ehrlich试剂反应法测定柠檬苦素类物质的浓度，柠檬苦素类物质得率为44.06%，纯度为22.34%。

Claims

1.一种以柑橘幼子的落果为原料生产柠檬苦素类提取物的方法，包括以60%-80%体积浓度的食用乙醇于60-70℃从柑橘幼子的落果中回流提取柠檬苦素类粗提物；其特征在于：还包括将上述柠檬苦素类粗提物以HP-20大孔吸附树脂分离纯化：将所述粗提物配制成柠檬苦素类物质浓度为4.0-5.0mg/mL的溶液，将此溶液以2-3.5BV/h的流速通过装有HP-20大孔吸附树脂的层析柱进行吸附，待吸附饱和后，先用蒸馏水以3.0-5.0BV/h的流速冲洗树脂至无色，再用70%-80%体积浓度的食用乙醇以2-3BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在-0.07～-0.09MPa、45-55℃条件下浓缩，回收食用乙醇，真空冷冻干燥，即可。

2.如权利要求1所述的以柑橘幼子的落果为原料提取柠檬苦素类粗提物的方法，其特征在于：所述以60%-80%体积浓度的食用乙醇于60-70℃从柑橘幼子的落果中回流提取柠檬苦素类粗提物是指：取柑橘幼子的落果烘干、粉碎，用60%-80%体积浓度的食用乙醇，按1g落果粉加8-15ml食用乙醇的比例，在60-70℃下回流提取2.0-3.0h，提取次数为1-2次，过滤，所得粗滤液离心，取上清液；将上清液在-0.07～-0.09MPa 、45-55℃条件下浓缩，回收食用乙醇溶剂，即得粗提物。

3.如权利要求2所述的以柑橘幼子的落果为原料提取柠檬苦素类粗提物的方法，其特征在于：所述离心的转速为3000-4000r/min，时间为5-15min。