CN115784956A - 一种采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，属于天然产物提取分离技术领域，经细胞破碎、萃取、结晶等过程实现高纯叶黄素晶体的制备。本发明以绿色、可设计性强、萃取容量大、稳定性好的离子液体为细胞破碎剂和萃取剂，减少了有机溶剂的用量，且流程简单、耗时短、萃取剂可回收、提取效率和产品纯度高。本发明解决了现有叶黄素提取工艺复杂、有毒有害有机溶剂用量多的问题，工艺简单，具有大规模工业化生产潜力。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取分离技术领域，具体涉及一种采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法。
背景技术
叶黄素属于类胡萝卜素，广泛存在于蔬菜、花卉等植物以及一些藻类生物中。叶黄素具有多烯环氧结构，其分子结构中含有大量的共轭双键，可以用来保护视力、延缓眼睛的老化、缓解视疲劳和预防白内障，并且具有抗氧化、提高免疫力、抗衰老的生物学效应。叶黄素在医药和保健品、食品和饲料、化妆品及水产养殖行业等方面有着广阔的应用前景，需求量与日俱增。
由于化学合成收率低，目前，叶黄素的商业化生产主要以万寿菊花瓣为原料，但万寿菊种植受地域、季节等条件限制。万寿菊中叶黄素主要以叶黄素酯的形式存在，浓度在17-570mg/100g之间，叶黄素或叶黄素酯需要经过多个步骤从万寿菊花瓣中提取。尽管绿色蔬菜、部分种子(如玉米)和水果中也含有叶黄素，但含量较低，不能作为大规模生产的替代材料。与万寿菊相比，一些微藻叶黄素含量较高(5-10mg/g)，是叶黄素生产的一种有前景的替代原料。与万寿菊相比，利用微藻生产叶黄素还有如下优点：(1)微藻的生长速度是陆生植物的5-10倍，大大减少了对土地和水的使用；(2)微藻的培养不受季节限制，一年四季都可养殖；(3)微藻中的叶黄素以游离态出现。因此，从藻类中提取叶黄素具有较高的研究价值。
从微藻中提取叶黄素需要先破坏其细胞壁。常用的细胞破碎技术有机械法(如珠磨、脉冲电场和高压均质)和非机械法(如超声、微波、酸/碱处理和酶)，存在成本高、能耗高、易产热或废水多等问题。其中，珠磨法被认为是一种有效和温和的微藻细胞破碎技术。然而，该技术易将细胞破碎为非常小的颗粒，从而形成稳定的乳剂，影响下游提取和分离工艺。叶黄素的提取大多使用有机溶剂如正己烷、氯仿、丙酮、四氢呋喃等，存在提取效率低、有机溶剂消耗多、环境污染、产品溶剂残留高等问题。如申请公布号CN111925309 A的专利将浒苔或小球藻低温破碎，经复合酶酶解、复合酶灭活、质量体积比1:100(w/v)的氯仿、正己烷、乙醇、四氢呋喃、石油醚等有机溶剂提取叶黄素，提取率在83.37％～97.36％之间。该工艺步骤多，有机溶剂消耗量大，复合酶成本高，且未重复使用。申请号CN103772253 A的叶黄素提取工艺采用丙酮、四氢呋喃等毒性较大的有机溶剂，而申请号CN105669510 A的方法中叶黄素收率最高仅能达到0.032％，皂化时间6小时，费效比低。
因此，针对传统微藻细胞破碎方法和提取方法的缺陷，开发一种操作简单、能耗低、环境友好、萃取效率高的新方法具有较大的商业价值和实用性。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，能够解决现有技术工艺操作复杂、能耗高或须使用价格高昂的复合酶、有机溶剂用量大、提取效率和产品纯度较低的技术问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，包括：以新鲜微藻为原料，以表面活性离子液体的乙醇溶液为细胞破碎剂和萃取剂，进行细胞破碎、萃取，收集萃取液，在低温下结晶析出叶黄素晶体，经过滤、水洗、冻干，制得目标产物叶黄素。
优选地，所述微藻采用普通小球藻、索罗金小球藻、原始小球藻、极微小球藻、嗜酸小球藻、嗜酸微藻或盐生杜氏藻。
优选地，所述离子液体是由阴离子和阳离子组成的室温熔融盐；其中：
阳离子为具有长链烷基取代基的咪唑、吡啶、吡咯烷、哌啶、季铵或季磷类阳离子；阴离子为四氟硼酸根、六氟磷酸根、双三氟甲磺酰亚胺根、硫氰酸根、高氯酸根、硝酸根、氯离子、溴离子或碘离子。
进一步优选地，所述长链烷基取代基为C6～C12的直链烷烃中的一种。
优选地，含有离子液体的乙醇溶液中离子液体的摩尔浓度为5％～50％。
进一步优选地，含有离子液体的乙醇溶液中离子液体的摩尔浓度优选为10％～30％。
优选地，细胞破碎处理时间为0.5～2h，萃取时间为0.5～2h，且细胞破碎和萃取均在25～80℃下进行，细胞破碎和萃取操作重复进行1～5次后收集萃取液。
优选地，新鲜微藻与含有表面活性离子液体的乙醇溶液的用量比为1kg：(5～80)L。
优选地，在-10～5℃下静置处理12～20h，结晶析出叶黄素晶体。
优选地，冻干是在-40～-50℃下真空冷冻干燥处理。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的从微藻中提取叶黄素的方法，以表面活性离子液体的乙醇溶液同时作为细胞破碎剂和萃取剂，离子液体是一种由体积较大的不对称有机阳离子和体积较小的无机/有机阴离子组成的在室温下呈熔融态的盐，具有优异的溶解性，能够破坏或渗透不同的细胞，包括微藻。表面活性化合物是由亲水性和疏水性部分组成的两亲性化合物，对亲水性和疏水性化合物都具有很高的亲和力。与非表面活性离子液体相比，表面活性离子液体对构成细胞壁的生物分子和目标生物分子有更强的增溶作用，表面活性离子液体和细胞膜磷脂分子之间的结构相似性更易引起细胞破坏。因此，表面活性离子液体具有更高的细胞破坏或渗透能力和生物分子提取能力。另外，与水不同，乙醇对疏水性叶黄素的溶解度更高，对亲水性蛋白和多糖的溶解度低。以表面活性离子液体的乙醇溶液为叶黄素萃取剂提高了体系对叶黄素的选择性，降低了后续分离的难度和工作量。因此，本发明既避免了成本较高的复合酶的使用，又提高了萃取效率，又减少了毒性较大的有机溶剂的用量，全程使用的有机溶剂只有乙醇，降低了环境危害，保证了本方法提纯的叶黄素产品的安全性。本发明的提取方法中细胞破碎处理和萃取处理可以“一锅法”完成，将产品收率提高到0.4％以上。此工艺既可以节省时间、简化步骤，又可以缩减成本、提高收率，适合工业化大规模生产。
附图说明
图1为本发明的“一锅法”提取藻类中叶黄素的工艺流程图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
参见图1，本发明公开的一种采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，包括：以新鲜微藻为原料，以表面活性离子液体的乙醇溶液为细胞破碎剂和萃取剂，进行细胞破碎、萃取，收集萃取液，在低温下结晶析出叶黄素晶体，经过滤、水洗、冻干，制得目标产物叶黄素。
实施例1
以1kg新鲜普通小球藻藻株为原料，以1-己基-3-甲基咪唑溴盐乙醇溶液(摩尔浓度为10％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：10(kg/L)，30℃下细胞破碎1h，萃取2h，静置过滤得萃取相，重复两次。萃取相在-10℃下静置14h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-40℃真空冷冻干燥，得到8.5g叶黄素晶体，纯度为85.5％，收率为0.73％。
实施例2
以1kg新鲜索罗金小球藻藻株为原料，以1-十二烷基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐乙醇溶液(摩尔浓度20％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：20(kg/L)，35℃下细胞破碎2h，萃取2h，静置过滤得萃取相，重复三次。萃取相在5℃下静置12h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-45℃真空冷冻干燥，得到9.61g叶黄素晶体，纯度为84.7％，收率为0.81％。
实施例3
以1kg新鲜极微小球藻藻株为原料，以N-辛基-N-甲基哌啶双三氟甲磺酰亚胺盐的乙醇溶液(摩尔浓度为15％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：30(kg/L)，40℃下细胞破碎1h，萃取2h，静置过滤得萃取相，重复两次。萃取相在0℃下静置17h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-50℃真空冷冻干燥，得到5.3g叶黄素晶体，纯度为84.1％，收率为0.46％。
实施例4
以1kg新鲜嗜酸小球藻藻株为原料，以N-庚基吡啶乙基硫酸盐的乙醇溶液(摩尔浓度为30％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：10(kg/L)，35℃下细胞破碎2h，萃取2h，静置过滤得萃取相，重复三次。萃取相在-10℃下静置18h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-40℃真空冷冻干燥，得到6.55g叶黄素晶体，纯度为82.5％，收率为0.54％。
实施例5
以1kg新鲜嗜酸微藻藻株为原料，以1-己基-2,3-二甲基咪唑六氟磷酸盐的乙醇溶液(摩尔浓度为20％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：70(kg/L)，45℃下细胞破碎1h，萃取2h，静置过滤得萃取相，重复三次。萃取相在-10℃下静置16h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-40℃真空冷冻干燥，得到7.31g叶黄素晶体，纯度为80.3％，收率为0.59％。
实施例6
以1kg新鲜原始小球藻藻株为原料，以三丁基己基溴化膦盐的乙醇溶液(摩尔浓度为30％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：50(kg/L)，50℃下细胞破碎2h，萃取1h，静置过滤得萃取相，重复三次。萃取相在-10℃下静置12h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-40℃真空冷冻干燥，得到8.35g叶黄素晶体，纯度为79.5％，收率为0.66％。
实施例7
以1kg新鲜盐生杜氏藻藻株为原料，以十二烷基三甲基氯化铵盐的乙醇溶液(摩尔浓度为10％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：30(kg/L)，65℃下细胞破碎2h，萃取2h，静置过滤得萃取相，重复三次。萃取相在5℃下静置15h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-40℃真空冷冻干燥，得到8.22g叶黄素晶体，纯度为81.7％，收率为0.67％。
实施例8
以1kg新鲜索罗金小球藻藻株为原料，以1-辛基-3-甲基咪唑双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐的乙醇溶液(摩尔浓度为20％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：40(kg/L)，25℃下细胞破碎1h，萃取1h，静置过滤得萃取相，重复三次。萃取相在4℃下静置20h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-40℃真空冷冻干燥，得到7.55g叶黄素晶体，纯度为83.6％，收率为0.63％。
实施例9
以1kg新鲜极微小球藻藻株为原料，以N-己基吡啶双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐的乙醇溶液(摩尔浓度为25％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：10(kg/L)，35℃下细胞破碎1h，萃取1h，静置过滤得萃取相，重复三次。萃取相在-10℃下静置15h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-40℃真空冷冻干燥，得到4.83g叶黄素晶体，纯度为87.5％，收率为0.42％。
实施例10
以1kg新鲜嗜酸微藻藻株为原料，以1-癸基-3-甲基咪唑硝酸盐的乙醇溶液(摩尔浓度为30％)为细胞破碎剂和萃取剂，控制物料的质量体积比为1：30(kg/L)，30℃下细胞破碎2h，萃取2h，静置过滤得萃取相，重复三次。萃取相在-5℃下静置18h，过滤得到叶黄素晶体，滤饼用水冲洗后，-40℃真空冷冻干燥，得到5.78g叶黄素晶体，纯度为80.15％，收率为0.46％。
对比例1
以新鲜普通小球藻藻株为原料，以正己烷为萃取剂，按质量体积比1:50加入藻株中，35℃下萃取2h，重复三次，静置过滤得萃取相；萃取相蒸发浓缩之后，得到叶黄素油膏；将油膏水洗、冻干后得到叶黄素晶体，纯度为50.4％，收率为0.21％。
对比例2
以新鲜嗜酸小球藻藻株为原料，以乙酸乙酯为萃取剂，按质量体积比1:60加入藻株中，40℃下萃取4h，重复三次，静置过滤得萃取相；萃取相蒸发浓缩之后，得到叶黄素油膏；将油膏水洗，冻干后得到叶黄素晶体，纯度为60.7％，收率为0.25％。
上述萃取相过滤后可回收利用，可见离子液体可以代替传统有机溶剂作为萃取剂，且萃取剂可以反复使用，不仅缩短萃取时间，收率提高至0.8％以上，可以节约大量成本，叶黄素晶体的纯度也较高。因此本发明可以弥补传统方法使用毒性大的有机溶剂、危害环境的缺点，并可以缩减成本，适合工业化大规模生产。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，包括：以新鲜微藻为原料，以表面活性离子液体的乙醇溶液为细胞破碎剂和萃取剂，进行细胞破碎、萃取，收集萃取液，在低温下结晶析出叶黄素晶体，经过滤、水洗、冻干，制得目标产物叶黄素。
2.根据权利要求1所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，所述微藻采用普通小球藻、索罗金小球藻、原始小球藻、极微小球藻、嗜酸小球藻、嗜酸微藻或盐生杜氏藻。
3.根据权利要求1所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，所述离子液体是由阴离子和阳离子组成的室温熔融盐；其中：
阳离子为具有长链烷基取代基的咪唑、吡啶、吡咯烷、哌啶、季铵或季磷类阳离子；阴离子为四氟硼酸根、六氟磷酸根、双三氟甲磺酰亚胺根、硫氰酸根、高氯酸根、硝酸根、氯离子、溴离子或碘离子。
4.根据权利要求3所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，所述长链烷基取代基为C6～C12的直链烷烃中的一种。
5.根据权利要求1所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，含有离子液体的乙醇溶液中离子液体的摩尔浓度为5％～50％。
6.根据权利要求5所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，含有离子液体的乙醇溶液中离子液体的摩尔浓度优选为10％～30％。
7.根据权利要求1所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，细胞破碎处理时间为0.5～2h，萃取时间为0.5～2h，且细胞破碎和萃取均在25～80℃下进行，细胞破碎和萃取操作重复进行1～5次后收集萃取液。
8.根据权利要求1所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，新鲜微藻与含有表面活性离子液体的乙醇溶液的用量比为1kg：(5～80)L。
9.根据权利要求1所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，在-10～5℃下静置处理12～20h，结晶析出叶黄素晶体。
10.根据权利要求1所述的采用表面活性离子液体从微藻中提取叶黄素的方法，其特征在于，冻干是在-40～-50℃下真空冷冻干燥处理。
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