CN103709152A - 一种葛根素的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葛根素的分离纯化方法。本发明提供了一种葛根素的分离纯化方法，其包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根素提取物进行分离纯化得到葛根素即可；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行。本发明的葛根素的分离纯化方法步骤简单、分离时间短、分离能力强、分离到的葛根素纯度高（HPLC纯度大于99%）、回收率高（大于65%），具有良好的市场开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种葛根素的分离纯化方法。
背景技术
葛根为豆科植物葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根，习称野葛，系常用中药，具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒之功效。葛根含有多种有效成分，异黄酮类化合物是葛属植物的主要成分之一，其中葛根素（Puerarin）是本属植物的主要有效成分。葛根素的药理作用十分广泛，具有降血脂，抗炎，抗心律失常、对心肌缺血的保护作用、肾保护、抗氧化、抗缺血再灌注损伤、抗肝缺血再灌注损伤、抗酒精中枢抑制、调控骨代谢、降血糖、利尿等作用。
随着葛根素的药理作用的研究深入，葛根素的分离纯化也越来越受到人们的重视。目前葛根素纯化方法主要有：大孔吸附树脂法、柱层析、酸水解有机溶剂萃取法及金属离子络合法等。如专利CN1154849A采用正丁醇萃取后经三氧化二铝柱脱色得到纯度97%以上的葛根素产品；专利CN1927876A经过离子交换大孔树脂层析再经过大孔树脂层析可以获得葛根素含量很高的葛根素提取物；专利CN1398872A通过大孔吸附树脂及硅胶柱层析可得到高纯度葛根素。葛根素的化学结构式如下式所示：
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中葛根素的分离方法步骤繁琐、分离时间长、分离能力差、分离到的葛根素纯度差、回收率低等缺陷而提供了一种葛根素的分离纯化方法。本发明的葛根素的分离纯化方法步骤简单、分离时间短、分离能力强、分离到的葛根素纯度高（HPLC纯度大于99%）、回收率高（大于65%），具有良好的市场开发前景。
本发明提供了一种葛根素的分离纯化方法，其包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根素提取物进行分离纯化得到葛根素即可；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行。
本发明中，所述的高速离心分配色谱仪优选厂家为法国RousseletRobatel型号为FCPC A或FCPC C的高速离心分配色谱仪。
本发明中，所述的高速离心分配色谱仪的转速优选1800r/min～2300r/min。
本发明中，所述的三元溶剂体系中乙酸乙酯、正丁醇和水的体积比优选（3～8）：2：（6～10），进一步优选2：1：3。
本发明中，所述的高速离心分配色谱法优选将高速离心分配色谱法所采用的三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相，上层溶液为流动相。进一步优选将固定相和流动相用过滤后超声备用，所述的过滤优选采用微孔滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为0.3μm～0.5μm，所述的超声的时间优选15min～30min。所述的超声的频率优选16KHz～28KHz。
本发明中，所述的高速离心分配色谱法，优选将葛根素提取物溶解于上述固定相和流动相形成的混合溶液中，过滤后上样；所述的固定相和流动相形成的混合溶液中所述的流动相与所述的固定相的体积比优选1：1～1：5。所述的过滤优选采用微孔滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为0.3μm～0.5μm。
本发明中，所述的葛根素提取物可以为采用普通超声提取法、循环超声提取法或者回流提取法得到的葛根素提取物。
本发明中，所述的葛根素提取物的纯度可以为11%～18%，所述的纯度是指葛根素的质量占葛根素提取物总质量的百分比。
本发明中，所述的高速离心分配色谱仪的流速为2.0mL/min～7.0mL/min，优选2.0mL/min～3.0mL/min；所述的流速是指每分钟内通过的流动相的体积。
本发明中，所述的高速离心分配色谱仪的上样浓度优选10mg/mL～30mg/mL；所述的上样浓度是指葛根素提取物的质量与流动相的体积的比例。
本发明中，所述的葛根素分离纯化方法，优选包括以下步骤：
步骤1：将三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动相；将葛根素粗品溶解于固定相与流动相的混合溶液中，形成葛根素提取物的溶液；
步骤2：高速离心分配色谱仪在descending模式下充满固定相；转换成ascending模式，后再将流动相泵入离心分配色谱仪内；待体系平衡完毕后，由进样阀注入步骤1中制得的葛根素提取物的溶液，然后根据检测器图谱接收目标组分即可。
步骤1中，优选将所述的固定相和流动相过滤后经超声处理后再用；所述的过滤优选通过微滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为0.45μm。所述的超声的频率优选16KHz～28KHz，所述的超声的时间优选15min～30min。
步骤1中，所述的三元溶剂体系中优选流动相与固定相的体积比为1：1～1：5。
步骤2中，所述的在高速离心分配色谱仪在descending模式下充满固定相，优选在高流速和低转速下进行，所述的高流速优选流速在5mL/min～10mL/min；所述的低转速优选转速在600r/min～800r/min。
步骤2中，所述的转换成ascending模式，后再将流动相泵入色谱柱中，转换成ascending模式后优选提高转速至1800r/min～2300r/min。
步骤2中，优选在接收目标组分后还包括除去溶剂，干燥得到葛根素单体的步骤。所述的除去溶剂优选在减压条件下进行，所述的除去溶剂的压强优选-0.01MPa～0.08MPa，所述的除去溶剂的温度70℃～75℃。所述的干燥条件优选在减压条件下进行，所述的干燥压强优选0.07MPa～0.09MPa，所述的干燥温度60℃～65℃。
步骤2中，所述的高速离心分配色谱仪是指本领域中常规的转速为0～3000r/min的高速离心分配色谱仪，优选转速1500～3000r/min的高速离心分配色谱仪。
葛根素提取物及本发明的分离纯化方法得到的葛根素用高效液相色谱进行分析检测，所述高效液相色谱的色谱条件为：Capcell Pak C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；以甲醇：水=25：75（v/v）的混合溶剂为流动相；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长：250nm。结果表明，本发明的分离纯化方法能够制得纯度99%以上的葛根素单体。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的葛根素分离纯化方法步骤简单、分离时间短、分离能力强、分离到的葛根素纯度高（HPLC纯度大于99%）、回收率高（大于65%）、环境友好，具有良好的市场开发前景。
附图说明
图1为葛根素提取物的高效液相色谱图。
图2为经本发明的实施例2分离纯化后得到的葛根素的高效液相色谱-二极管阵列检测图。
图3为高速离心分配色谱分离纯化葛根素色谱图。
图4为高速逆流色谱分离纯化葛根素色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
（1）葛根素粗提物的制备
称取50g粉碎的野葛根（过20目筛），加入40%乙醇下循环超声提取2次，每次30min，过滤，减压回收并干燥至恒重得葛根素粗提物，经检测葛根素质量百分含量在16%～18%，所述的质量百分含量是指葛根素的质量占葛根素提取物总质量的百分比。
（2）溶剂系统的准备
将乙酸乙酯、正丁醇和水按体积比2：1：3混合，置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动相，将固定相和流动相用微滤膜过滤后超声15min备用。
（3）回收率计算公式
回收率=分离的得到的葛根素单体的质量/进样样品中含有的葛根素的总质量×100%
实施例1
将纯度为16.3%的葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/固定相=1/4）中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；高速离心分配色谱仪中在descending模式下以流速8.0mL/min，转速600r/min充满固定相；转换成ascending模式，提高转速至2200r/min后再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱（见图3）接收目标组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩；设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥，制得葛根素单体，HPLC纯度为99.4%，回收率66%。
高效液相色谱法进行纯度检测：对分离纯化前的葛根素粗提物和制得的葛根素单体用高效液相色谱分析，所述的高效液相色谱的色谱条件为：Capcell Pak C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；以甲醇：水=25：75（v/v）的混合溶剂为流动相；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长：250nm。结果见图1和图2。
表1实施例1高速离心分配色谱分离纯化葛根素结果
| 条件 | 葛根素纯度（HPLC） | 葛根素回收率 |
| HPLC | 16.3% | \ |
| 高速离心分配色谱 | 99.4% | 66% |
实施例2
将纯度为16.1%的葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/固定相=1/4）中，制成浓度为20mg/mL的样品溶液，孔径为0.45μm的微滤膜过滤后备用；高速离心分配色谱仪中在descending模式下以流速8.0mL/min，转速800rpm充满固定相；转换成ascending模式，提高转速至1800rpm后再将流动相以2mL/min的流速泵入色谱仪；待体系平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱（见图3）接收目标组分，在压强-0.01MPa，温度70℃下进行浓缩，设定压强0.08MPa，温度65℃进行干燥后，制得葛根素单体，纯度为99.6%，回收率65%。
表2实施例2高速离心分配色谱分离纯化葛根素结果
| 条件 | 葛根素纯度（HPLC） | 葛根素回收率 |
| HPLC | 16.1% | \ |
| 高速离心分配色谱 | 99.6% | 65% |
对比实施例1：不同溶剂体系与本发明的溶剂体系对葛根素分离效果比较
采用实施例1中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为16.3%葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/固定相=1/4）中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；采用乙酸乙酯/正丁醇/乙醇/水（4:0.6:0.6:5）为溶剂体系，转速2200r/min，流速2.0mL/min，按照实施例1中的步骤进行高速离心分配色谱分离纯化制备得到葛根素，其结果为：纯度为95.6%，回收率50%。具体结果见表3。
表3不同溶剂体系对葛根素分离效果的影响
对比实施例2：不同浓度葛根素提取物的上样浓度与本发明的葛根素提取物的上样浓度对葛根素分离效果的比较。
采用实施例1中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为16.3%的葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/固定相=1/4）中，分别制成浓度为35mg/mL和40mg/mL的样品溶液，0.45μm微滤膜过滤后备用；采用乙酸乙酯/正丁醇/水（2:1:3）溶剂体系，转速2200r/min，流速2.0mL/min，按照实施例1中的步骤进行高速离心分配色谱分离纯化制备得到葛根素，其结果分别为：纯度93.4%，回收率41%；纯度93.35%，回收率35%，具体结果见表4。
表4不同葛根素提取物上样浓度对葛根素分离效果的影响
| 葛根素提取物上样浓度 | 葛根素纯度（HPLC） | 回收率 |
| 10mg/mL | 99.4% | 66% |
| 35mg/mL | 93.4% | 41% |
| 40mg/mL | 93.35% | 35% |
对比实施例3：采用高速逆流色谱分离仪纯化葛根素与本发明的高速离心分配色谱分离仪纯化葛根素作对比。
采用实施例1中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为16.3%的葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/固定相=1/4）中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，孔径为0.45μm的微滤膜过滤后备用；以8mL/min的流速将固定相充满高速逆流色谱仪中，将转速调节为800r/min，在tail-to-head模式下，以2mL/min的流速泵入流动相，待平衡后，由进样阀注入浓度为10mg/mL的样品溶液，然后根据检测器图谱（见图4）接收目标成分，经检测葛根素HPLC纯度低于90%，回收率50%，具体结果见表5。
表5高速离心分配色谱法与高速逆流色谱法分离纯化葛根素效果对比
| 葛根素纯度（HPLC）% | 分离时间（min） | 回收率% | |
| 高速离心分配色谱法 | >99% | 20 | >60 |
| 高速逆流色谱法 | <90% | 38 | 50 |
Claims (12)
1.一种葛根素的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱法对葛根素提取物进行分离纯化得到葛根素即可；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行。
2.如权利要求1所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的高速离心分配色谱仪为厂家为法国Rousselet Robatel，型号为FCPC A或FCPC C的高速离心分配色谱仪。
3.如权利要求1所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的高速离心分配色谱仪的转速为1800r/min～2300r/min。
4.如权利要求1所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的三元溶剂体系中乙酸乙酯、正丁醇和水的体积比为（3～8）：2：（6～10），优选2：1：3。
5.如权利要求1所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的高速离心分配色谱法采用的三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相，上层溶液为流动相。
6.如权利要求5所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的固定相和流动相过滤后超声备用，所述的超声的频率为16KHz～28KHz。
7.如权利要求5所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的高速离心分配色谱法，将葛根素提取物溶解于所述的固定相和流动相形成的混合溶液中，过滤后上样；所述的固定相和流动相形成的混合溶液中所述的流动相与所述的固定相的体积比优选1：1～1：5。
8.如权利要求1所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的葛根素提取物为采用普通超声提取法、循环超声提取法或者回流提取法得到的葛根素提取物；所述的葛根素提取物的纯度为11%～18%，所述的纯度是指葛根素的质量占葛根素提取物总质量的百分比。
9.如权利要求1所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的高速离心分配色谱仪的流速为2.0mL/min～7.0mL/min，优选2.0mL/min～3.0mL/min。
10.如权利要求1所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的高速离心分配色谱仪的上样浓度为10mg/mL～30mg/mL；所述的上样浓度是指葛根素提取物的质量与流动相的体积的比例。
11.如权利要求1所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：所述的
葛根素分离纯化方法，包括以下步骤：
步骤1：将三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动相；将葛根素提取物溶解于固定相与流动相的混合溶液中，形成葛根素提取物的溶液；
步骤2：高速离心分配色谱仪在descending模式下充满固定相；转换成ascending模式，后再将流动相泵入色谱柱；待体系平衡完毕后，由进样阀注入步骤1中制得的葛根素提取物的溶液，然后根据检测器图谱接收目标组分即可。
12.如权利要求11所述的葛根素的分离纯化方法，其特征在于：步骤2中，所述的在高速离心分配色谱仪在descending模式下充满固定相，在高流速和低转速下进行，所述的高流速是指流速在5mL/min～10mL/min；所述的低转速是指转速在600r/min～800r/min；
步骤2中，所述的转换成ascending模式，后再将流动相泵入色谱柱中，转换成ascending模式后提高转速至1800r/min～2300r/min。
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