CN103467352B - 一种灵菌红素提取纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提取纯化灵菌红素的方法,用于从生产灵菌红素的固态发酵物料中分离并纯化出灵菌红素,其特征在于,具有以下步骤:将固态发酵物料进行真空干燥制得提取原料;以提取溶剂与含水溶剂分别对提取原料进行浸提1-2小时并浓缩两次提取液;合并两次浓缩液,再次浓缩并离心,分别收集上清液和沉淀;上清液以等体积的乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯相,蒸干溶剂得到灵菌红素粗提物;将灵菌红素粗提物与沉淀合并,加入0.5~2倍质量的硅胶,然后两次以硅胶轴向压缩柱梯度洗脱进行纯化,依次得到灵菌红素次纯品和灵菌红素高纯品。
Description
技术领域
本发明涉及药物中间体的提取工艺,尤其是一种从固态发酵物料中提取和纯化灵菌红素的方法。
背景技术
灵菌红素(prodigionsin)是一族天然红色素的总称,通常具有由三个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构,属于生物碱。自然界中产灵菌红素的菌株主要是粘质沙雷氏菌(Serratiamarcecens),此外还有一些放线菌(例如:Streptomycescoelicolor)、以及海洋细菌(例如:Hahellachejuensis、Pseudoalteromonasdenitrificans)。
近年来,许多学者研究发现,灵菌红素家族化合物是一类非常有潜力的抗癌待选药物,对许多癌细胞(如肺癌、结肠癌、肾癌以及乳腺癌)都具有良好的细胞凋亡作用,而对正常细胞的毒性非常低;除了诱导细胞凋亡,灵菌红素能够抑制癌细胞的浸润转移作用。此外,灵菌红素可以抑制磷酸化反应、激活细胞酪氨酸激酶,并且通过与细胞表面受体结合,阻断γ链的信号转换,从而显示出免疫抑制活性。灵菌红素已经成为抗癌等新药研发的热点。
相对于普通硅胶柱层析,利用动态轴向压缩柱系统纯化灵菌红素,效率高,单针上样量大,分离纯化时间短;选择的溶剂可以使用分析级或者工业级试剂,价格低廉,更好的降低成本,有利于工业化生产。目前灵菌红素及其类似物的发酵主要以液态发酵为主,发酵水平较低,总体来说还不能满足工业化需求。由于灵菌红素主要为胞内产物,只有少量的分泌在发酵液中,因此,从发酵液中回收灵菌红素程序较为复杂,溶剂和能耗较高,这也是限制灵菌红素产业化的一个瓶颈。公开号为CN102002469A(发明名称:生产灵菌红素的菌株及其方法)、CN102277323A(发明名称:高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)Sm-128菌株及其应用)、CN101392227B(发明名称:一种粘质沙雷氏菌及其生产的灵菌红素)等专利文献公开了一系列粘质沙雷氏菌发酵生产灵菌红素的方法,并没有涉及灵菌红素的提取工艺。专利CN102311981A(发明名称:制备提纯灵菌红素的方法)、CN1884483A(发明名称:生产灵菌红素的海洋细菌菌株及其生产灵菌红素的方法)等专利文献公开了一系列液态发酵法生产、提取纯化灵菌红素的方法,并没有涉及固态发酵物料中灵菌红素的提取纯化工艺。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的,目的在于提供一种从固态发酵物料中提取纯化灵菌红素的方法。为了实现这一目的,本发明采取了以下技术方案。
一种提取纯化灵菌红素的方法,用于从生产灵菌红素的固态发酵物料中分离并纯化出灵菌红素,其特征在于,具有以下步骤:将固态发酵物料进行真空干燥制得提取原料;以一定重量比将提取溶剂与提取原料在容器中混合,保持温度在40℃-50℃之间,浸提1-2小时,移出并过滤容器中的液体得到第一提取液,于50℃-70℃减压浓缩至无液体挥发,得到第一浓缩液;以一定重量比将含水溶剂加入容器,保持温度在40℃-50℃之间,浸提1-2小时,移出并过滤容器中的液体得到第二提取液,于50℃-70℃减压浓缩至无液体挥发,得到第二浓缩液;合并第一浓缩液和第二浓缩液,并于45℃-60℃减压浓缩至无液体挥发,制备得到灵菌红素浓缩液;将灵菌红素浓缩液离心,分别收集上清液和沉淀;向上清液中加入与上清液等体积的乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯相,60℃下减压浓缩,蒸干溶剂得到灵菌红素粗提物;将灵菌红素粗提物与沉淀合并,加入0.5~2倍质量的硅胶,充分搅拌后干燥,制备得到灵菌红素干浓缩物;将灵菌红素干浓缩物加入硅胶轴向压缩柱,以体积比1:1~1:4的正己烷-乙酸乙酯混合液和纯乙酸乙酯梯度洗脱,收集并合并红色洗脱组分,减压浓缩蒸干溶剂得到灵菌红素次纯品;将灵菌红素次纯品与0.5~2倍质量的硅胶混合,继续用硅胶轴向压缩柱纯化,以体积比1:3~1:5的正己烷-乙酸乙酯混合液和纯乙酸乙酯进行梯度洗脱,按时间分批收集洗脱组分,利用高效液相色谱检测各批洗脱组分,并将纯度高的洗脱组分合并,减压浓缩除去溶剂得到灵菌红素高纯品。
发明的作用与效果
本发明工艺简单,安全可靠,灵菌红素的提取率达到90%以上;与液态发酵提取技术相比,本方法提取溶剂消耗少,能耗低,提取损失小。采用动态轴向压缩柱系统纯化灵菌红素,产品分离效率高,溶剂消耗少,产品质量容易控制,纯化系统为密闭系统,操作环境污染小。
具体实施方式
下面以实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。在实施本发明的过程中,采用杭州惠合机械设备有限公司生产的多功能提取罐进行提取;硅胶轴向压缩柱梯度洗脱时,每个梯度使用洗脱液40-60L。另外,以如下条件进行高效液相色谱(HPLC)检测:HPLC仪器为Agilent1200Series;色谱柱为SepaxBio-C18(3μm,4.6mm×150mm);流速为0.6mL/min;检测波长为535nm;流动相A为水/三氟乙酸(TFA)=100/0.1,流动相B为乙腈/三氟乙酸(TFA)=100/0.09;柱温为28℃;进样量为10μL。其中,HPLC洗脱梯度如下:0-15min,流动相B25-90%;15-15.5min,流动相B90-25%;15.5-21min,流动相B25%。
<实施例1>
(1)灵菌红素固态发酵物料经过50℃真空干燥制得的提取原料,装入多功能提取罐中;
(2)灵菌红素浓缩液制备
第一次向多功能提取罐中加入3倍重量比的乙醇回流提取1小时,提取过程中温度保持在40℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩至无乙醇挥发,回收乙醇;
第二次向多同能提取罐中加入3倍重量比的70%乙醇溶液回流提取1小时,提取过程中温度保持在40℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇;
合并两次提取的浓缩液,并于45℃-60℃减压浓缩至无乙醇挥发出,制备得到灵菌红素浓缩液。
(3)灵菌红素干浓缩物制备。将灵菌红素浓缩液8000r/min离心10min,收集沉淀;向上清中加入1倍体积的乙酸乙酯,进行分配萃取,收集乙酸乙酯相,60℃下减压浓缩得到灵菌红素粗提物,与前述沉淀合并,加入1倍的硅胶,充分搅拌后干燥,得到灵菌红素干浓缩物;
(4)利用动态轴向压缩柱系统对灵菌红素进行纯化制备。
分离纯化条件是:采用10μm球形硅胶轴向压缩柱,直径250mm,填料高度1000mm,洗脱液采用正己烷-乙酸乙酯混合液,正己烷-乙酸乙酯的体积比为1:1、1:3、1:4和纯乙酸乙酯梯度洗脱;流速为250mL/min;收集红色组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素次纯品,次纯品纯度≥80%。
将灵菌红素次纯品继续用动态轴向压缩柱系统纯化,梯度洗脱条件:正己烷与乙酸乙酯体积比1:3、1:4、1:5和纯乙酸乙酯梯度洗脱,流速为250mL/min;分布收集红色部分并用HPLC检测洗脱组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素高纯品,高纯品纯度≥95%。
<实施例2>
(1)灵菌红素固态发酵物料经过50℃真空干燥制得的提取原料,装入多功能提取罐中。
(2)灵菌红素浓缩液的制备。
第一次向多功能提取罐中加入4倍重量比的乙醇回流提取1.5小时,提取过程中温度保持在45℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇。
第二次向多同能提取罐中加入4倍重量比的80%乙醇溶液回流提取1.5小时,提取过程中逐渐加热温度保持在45℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇。
合并两次提取的浓缩液,并于45℃-60℃减压浓缩至无乙醇挥发出,制备得到灵菌红素浓缩液。
(3)灵菌红素干浓缩物的制备。
将灵菌红素浓缩液8000r/min离心10min,收集沉淀;向上清中加入1倍体积的乙酸乙酯,进行分配萃取,收集乙酸乙酯相,60℃下减压浓缩得到灵菌红素粗提物,与前述沉淀合并,加入1.5倍的硅胶,充分搅拌后干燥,得到灵菌红素干浓缩物;
(4)利用动态轴向压缩柱系统对灵菌红素进行纯化制备。
分离纯化条件是:采用10μm球形硅胶轴向压缩柱,直径250mm,填料高度1000mm,洗脱液采用正己烷-乙酸乙酯混合液,正己烷-乙酸乙酯的体积比为1:1、1:3、1:4和纯乙酸乙酯梯度洗脱;流速为300mL/min;收集红色组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素次纯品,次纯品纯度≥80%。
将灵菌红素次纯品继续用动态轴向压缩柱系统纯化,梯度洗脱条件:正己烷与乙酸乙酯体积比1:3、1:4、1:5和纯乙酸乙酯梯度洗脱,流速为300mL/min;分布收集红色部分并用HPLC检测洗脱组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素高纯品,高纯品纯度≥95%。
<实施例3>
(1)灵菌红素固态发酵物料经过50℃真空干燥制得的提取原料,装入多功能提取罐中。
(2)灵菌红素浓缩液的制备。
第一次向多功能提取罐中加入5倍重量比的乙醇回流提取2小时,提取过程中温度保持在50℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇。
第二次向多同能提取罐中加入5倍重量比的90%乙醇溶液回流提取2小时,提取过程中温度保持在50℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇。
合并两次提取的浓缩液,并于45℃-60℃减压浓缩至无乙醇挥发出,制备得到灵菌红素浓缩液。
(3)灵菌红素干浓缩物的制备。
将灵菌红素浓缩液8000r/min离心10min,收集沉淀;向上清中加入1倍体积的乙酸乙酯,进行分配萃取,收集乙酸乙酯相,60℃下减压浓缩得到灵菌红素粗提物,与前述沉淀合并,加入2倍的硅胶,充分搅拌后干燥,得到灵菌红素干浓缩物。
(4)利用动态轴向压缩柱系统对灵菌红素进行纯化制备。
分离纯化条件是:采用10μm球形硅胶轴向压缩柱,直径250mm,填料高度1000mm,洗脱液采用正己烷-乙酸乙酯混合液,正己烷-乙酸乙酯的体积比为1:1、1:3、1:4和纯乙酸乙酯梯度洗脱;流速为330mL/min;收集红色组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素次纯品,次纯品纯度≥80%。
将灵菌红素次纯品继续用动态轴向压缩柱系统纯化,梯度洗脱条件:正己烷与乙酸乙酯体积比1:3、1:4、1:5和纯乙酸乙酯梯度洗脱,流速为330mL/min;分布收集红色部分并用HPLC检测洗脱组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素高纯品,高纯品纯度≥95%。
<实施例4>
(1)灵菌红素固态发酵物料经过50℃真空干燥制得的提取原料,装入多功能提取罐中。
(2)灵菌红素浓缩液的制备。
第一次向多功能提取罐中加入4倍重量比的甲醇回流提取1.5小时,提取过程中温度保持在45℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇。
第二次向多同能提取罐中加入4倍重量比的含水80%甲醇溶液回流提取1.5小时,提取过程中温度保持在45℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇。
合并两次提取的浓缩液,并于45℃-60℃减压浓缩至无乙醇挥发出,制备得到灵菌红素浓缩液。
(3)灵菌红素干浓缩物的制备。
将灵菌红素浓缩液8000r/min离心10min,收集沉淀;向上清中加入1倍体积的乙酸乙酯,进行分配萃取,收集乙酸乙酯相,60℃下减压浓缩得到灵菌红素粗提物,与前述沉淀合并,加入1.5倍的硅胶,充分搅拌后干燥,得到灵菌红素干浓缩物。
(4)利用动态轴向压缩柱系统对灵菌红素进行纯化制备。
分离纯化条件是:采用10μm球形硅胶轴向压缩柱,直径250mm,填料高度1000mm,洗脱液采用正己烷-乙酸乙酯混合液,正己烷-乙酸乙酯的体积比为1:1、1:3、1:4和纯乙酸乙酯梯度洗脱;流速为300mL/min;收集红色组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素次纯品,次纯品纯度≥80%。
将灵菌红素次纯品继续用动态轴向压缩柱系统纯化,梯度洗脱条件:正己烷与乙酸乙酯体积比1:3、1:4、1:5和纯乙酸乙酯梯度洗脱,流速为300mL/min;分布收集红色部分并用HPLC检测洗脱组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素高纯品,高纯品纯度≥95%。
<变形例>
分别以异丙醇、丙酮或乙腈中的一种代替实施例4中的甲醇,其他条件不变,分别进行灵菌红素的提取和纯化,得到灵菌红素高纯品,高纯品纯度≥95%。
<实施例5>
(1)灵菌红素固态发酵物料经过50℃真空干燥制得的提取原料,装入多功能提取罐中。
(2)灵菌红素浓缩液的制备。
第一次向多功能提取罐中加入3倍重量比的乙醇回流提取1小时,提取过程中温度保持在40℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇。
第二次向多同能提取罐中加入3倍重量比的70%乙醇溶液回流提取1小时,提取过程中温度保持在40℃,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟。移出并过滤提取液,于50℃-70℃减压浓缩无乙醇挥发,回收乙醇。
合并两次提取的浓缩液,并于45℃-60℃减压浓缩至无乙醇挥发出,制备得到灵菌红素浓缩液。
(3)灵菌红素干浓缩物制备。
将灵菌红素浓缩液8000r/min离心10min,收集沉淀;向上清中加入1倍体积的乙酸乙酯,进行分配萃取,收集乙酸乙酯相,60℃下减压浓缩得到灵菌红素粗提物,与前述沉淀合并,加入0.5倍的硅胶,充分搅拌后干燥,得到灵菌红素干浓缩物。
(4)利用动态轴向压缩柱系统对灵菌红素进行纯化制备。
分离纯化条件是:采用10μm球形硅胶轴向压缩柱,直径250mm,填料高度1000mm,洗脱液采用正己烷-乙酸乙酯混合液,正己烷-乙酸乙酯的体积比为1:1、1:3、1:4和纯乙酸乙酯梯度洗脱;流速为280mL/min;收集红色组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素次纯品,次纯品纯度≥80%。
将灵菌红素次纯品继续用动态轴向压缩柱系统纯化,梯度洗脱条件:正己烷与乙酸乙酯体积比1:3、1:4、1:5和纯乙酸乙酯梯度洗脱,流速为280mL/min;分布收集红色部分并用HPLC检测洗脱组分,合并后减压浓缩出去溶剂得到灵菌红素高纯品,高纯品纯度≥95%。
具体实施方式的有益效果
本发明的具体实施方式工艺简单、稳定,安全可靠,提取溶剂消耗少,能耗低,提取损失小,灵菌红素的提取率达到90%以上。采用动态轴向压缩柱系统纯化灵菌红素,不仅产品分离效率高,溶剂消耗少,产品质量容易控制,纯化系统为密闭系统,操作环境污染小,而且产品纯度皆不低于95%。
以上,仅为本发明的一种具体实施方式而已,并非用来限定本发明的实施范围,即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰,都应为本发明的技术范畴。
Claims (5)
1.一种提取纯化灵菌红素的方法,用于从生产灵菌红素的固态发酵物料中分离并纯化出灵菌红素,其特征在于,具有以下步骤:
将所述固态发酵物料进行真空干燥制得提取原料;
以一定重量比将提取溶剂与所述提取原料在容器中混合,保持温度在40℃-50℃之间,回流提取1-2小时,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟,移出并过滤所述容器中的液体得到第一提取液,于50℃-70℃减压浓缩至无液体挥发,得到第一浓缩液;
以一定重量比将含水溶剂加入所述容器,保持温度在40℃-50℃之间,回流提取1-2小时,每隔15分钟将提取液用循环泵由下至上循环15分钟,移出并过滤所述容器中的液体得到第二提取液,于50℃-70℃减压浓缩至无液体挥发,得到第二浓缩液;
合并所述第一浓缩液和所述第二浓缩液,并于45℃-60℃减压浓缩至无液体挥发,制备得到灵菌红素浓缩液;
将所述灵菌红素浓缩液离心,分别收集上清液和沉淀;
向所述上清液中加入与所述上清液等体积的乙酸乙酯进行萃取,收集乙酸乙酯相,60℃下减压浓缩,蒸干溶剂得到灵菌红素粗提物;
将所述灵菌红素粗提物与所述沉淀合并,加入0.5~2倍质量的硅胶,充分搅拌后干燥,制备得到灵菌红素干浓缩物;
将所述灵菌红素干浓缩物加入硅胶轴向压缩柱,以体积比1:1~1:4的正己烷-乙酸乙酯混合液和纯乙酸乙酯梯度洗脱,收集并合并红色洗脱组分,减压浓缩蒸干溶剂得到灵菌红素次纯品;
将所述灵菌红素次纯品与0.5~2倍质量的硅胶混合,继续用所述硅胶轴向压缩柱纯化,以体积比1:3~1:5的正己烷-乙酸乙酯混合液和纯乙酸乙酯进行梯度洗脱,按时间分批收集洗脱组分,利用高效液相色谱检测各批所述洗脱组分,并将纯度高的所述洗脱组分合并,减压浓缩除去溶剂得到灵菌红素高纯品,
其中,所述溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈中的一种,
所述含水溶剂为含水10-30%的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或乙腈溶液,
所述硅胶轴向压缩柱为10μm球形硅胶压缩柱,所述压缩柱的直径为250μm,填料高度为1000mm。
2.根据权利要求1所述的提取纯化灵菌红素的方法,其特征在于:
其中,所述容器为杭州惠合机械设备有限公司生产的多功能提取罐。
3.根据权利要求1所述的提取纯化灵菌红素的方法,其特征在于:
其中,在减压浓缩制备所述第一浓缩液和所述第二浓缩液时,回收挥发出来的溶剂。
4.根据权利要求1所述的提取纯化灵菌红素的方法,其特征在于:
其中,制备所述灵菌红素干浓缩物时使用的干燥技术为冷冻干燥、50℃真空干燥以及50℃烘干中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的提取纯化灵菌红素的方法,其特征在于:
其中,当梯度洗脱时,洗脱液流速为250-330ml/min,每个梯度的洗脱液的量为40-60L。
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