CN103467551B - 一种虫草素和虫草多糖及其制备方法 - Google Patents
一种虫草素和虫草多糖及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种虫草素和虫草多糖及其制备方法，该虫草素和虫草多糖是先对虫草废弃培养基进行热水提，然后用NKA-II树脂进行吸附和分离，分别得到虫草素和虫草多糖，该制备方法简单，虫草素和虫草多糖的提取率高。
Description
技术领域
本发明涉及食用真菌领域，具体的说涉及一种虫草素和虫草多糖及其制备方法。
背景技术
蛹虫草是我国最常见，也是分布最广的虫草菌，有益肺肾、补精髓、止血化痰的功效，现代研究发现有延缓衰老、抗疲劳和耐缺氧，调节免疫系统，抗缺氧、增加心肌营养和血流量等多种作用。目前蛹虫草主要以人工栽培为主，并且达到规模化生产。蛹虫草食药用部位为其子实体，其栽培用的培养基为麦粒培养基和蛹虫草的菌丝体的混合物，由于没有找到合适的利用方法，如何处理成为企业和农户的一个负担。我国年产千吨蛹虫草，每年废弃的培养基达到万吨以上。
虫草素即3’-脱氧腺苷和虫草多糖是虫草属的特有成分，虫草素具有抗病毒、抗癌、降血脂等多种生理活性，虫草多糖也具有很好的免疫调节作用。研究发现废弃培养基中的虫草素含量和虫草多糖并不低于子实体或菌丝体，是非常好的提取虫草素和虫草多糖的价廉物美的材料，如加以综合利用，变废为宝，价值相当可观，将会带来很好的经济效益，同时也将对虫草资源的充分利用带来很好的促进作用。
目前常用的虫草素和虫草多糖提取后将两者进行分离需要进行柱层析，工艺较复杂，因此需要寻找更好的提取率高、成本低和易于工艺化生产的虫草素和多糖同时兼得的工艺。
发明内容
本发明提供了一种虫草素和虫草多糖，该虫草素和虫草多糖是先对虫草废弃培养基进行热水提，然后用NKA-II树脂进行吸附和分离，分别得到虫草素和虫草多糖。
具体的说，本发明的虫草素和虫草多糖是通过如下方法制备得到的：
将虫草废弃培养基用90-100℃水提取，得到粗提液；
粗提液中加入NKA-II树脂，12-24小时后，过滤将树脂与提取液分开；树脂用去离子水清洗后，加入30-50%乙醇溶液2-4小时，浓缩得到富含虫草素的浓缩液；经树脂吸附后的提取液经浓缩得到富含虫草多糖的浓缩液。
本发明还提供了制备上述虫草素和虫草多糖的方法，该方法为：
将虫草废弃培养基用90-100℃水提取，得到粗提液；
粗提液中加入NKA-II树脂，12-24小时后，过滤将树脂与提取液分开；树脂用去离子水清洗后，加入30-50%乙醇溶液2-4小时，浓缩得到富含虫草素的浓缩液；经树脂吸附后的提取液经浓缩得到富含虫草多糖的浓缩液。
本发明在粗提液中加入树脂，一步就达到分离虫草素和虫草多糖的效果，这种方法快捷简便，而且虫草素和虫草多糖基本没有损失。通过简单的工艺可使最终虫草素产品的纯度达到20%以上，虫草多糖纯度达到38%以上。
具体实施方式
实施例1虫草素和虫草多糖的提取
将蛹虫草废弃培养基(培养基的初始配方为麦粒和水)用粉碎机粉碎成粉末，1Kg粉末加入20L水，沸水加热2h，放冷后用离心机8000转离心20分钟，滤渣重复上述步骤再提取一次，合并两次提取的离心液，获得含虫草素和虫草多糖的粗提液。
虫草素和虫草多糖多糖的分离
虫草素和虫草多糖的粗提液加入1kg的NKA-II树脂(天津海光化工公司)，搅拌过夜。然后通过过滤将树脂与粗提液分开，树脂用10倍体积的去离子水清洗3次，弃去清洗液，树脂再用5倍体积的50%乙醇溶液清洗2次，50%的乙醇溶液清洗后的溶液经浓缩得到富含虫草素的浓缩液。经树脂吸附后的粗提液经浓缩得到富含虫草多糖的浓缩液。
富含虫草素和虫草多糖浓缩液的干燥。
富含虫草素的浓缩液在-80度冷冻24小时后，放入冷冻干燥机冻干；富含虫草多糖的浓缩液，加入3倍体积的95%乙醇沉淀，沉淀于真空干燥机干燥；最终得到虫草素和虫草多糖。
实施例2虫草素和虫草多糖的含量测定。
虫草素含量测定方法为HPLC法，色谱条件为：Waters2695型高效液相色谱仪，色谱柱：日本YMC公司的YMCAQ-C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：甲醇：纯水=10：90；流速1mL/min；柱温40°C，waters2847紫外检测器，检测波长为259nm，进样量10μL。
精确称取实施1中的虫草素产品0.1g，加入10％的乙醇50mL，溶解后经0.45um膜过滤，HPLC色谱检测虫草素含量，测定结果为虫草提取物干燥后虫草素含量为20.25%。
虫草多糖测定采用苯酚硫酸法，精确称取实施1中的虫草多糖产品0.1g，加水50mL,充分溶解后过滤，稀释50倍后用苯酚硫酸法在490nm下测定多糖含量，测定结果为虫草多糖提取物多糖含量为38.22%。
实施例3虫草素和虫草多糖的活性测定。
购自中科院细胞库的白血病细胞株K562细胞株，用DMEM完全培养基在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每2～3天换液一次，培养3天左右1000r/min离心3min，去除上清液，用RPMI1640完全培养基稀释成2×104个/mL的悬浮液，加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μLPBS作阴性对照。于37℃、含5%的CO2条件下培养3d后加20μlMTT溶液（5mg/ml的MTT）继续培养4h，终止培养，2000r/min离心6min，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10min使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。抑制率计算公式如下：抑制率（％）＝[1-[(OD样品孔-OD调零孔)/（OD对照孔-OD调零孔）]]×100%。
通过测定发现虫草素产品具有很好的抑制K562肿瘤细胞增殖的作用，其抑制肿瘤的IC50为20ug/mL。
购自中科院细胞库的RAW264.7细胞用DMEM完全培养基在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，待细胞培养至铺满培养瓶瓶底80～90%时，用0.25％胰酶溶液消化，混悬液于1000rpm离心3min，收集细胞，用无色1640完全培养基稀释细胞至5×105个/mL，每孔180μL加入到96孔细胞培养板中，并加入20μL虫草多糖样品，每个样品设置3个复孔，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养24h，每孔吸取细胞培养上清液100μL，加入50μLGriess试剂(碧云天公司)，Griess法测定巨噬细胞NO释放量。
通过测定发现虫草多糖产品在100ug/mL时具有很好的激活巨噬细胞RAW264.7产生NO的作用。
Claims (1)
1.一种制备虫草素和虫草多糖的浓缩液的方法，该方法为：
将虫草废弃培养基用90-100℃水提取，得到粗提液；
粗提液中加入NKA-II树脂，12-24小时后，过滤将树脂与提取液分开；树脂用去离子水清洗后，加入30-50％乙醇溶液2-4小时，浓缩得到富含虫草素的浓缩液；经树脂吸附后的提取液经浓缩得到富含虫草多糖的浓缩液。
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