CN105193865A - 一种降血脂虫草培养基提取物的制备方法 - Google Patents
一种降血脂虫草培养基提取物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及食用菌领域,具体涉及一种降血脂虫草培养基提取物的制备方法,虫草培养基用用沸水提取,收集上清液;上清液过XDA-200B树脂柱,95%乙醇洗脱部分为即得到降血脂虫草培养基提取物。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌提取领域,具体的说涉及一种降血脂虫草培养基提取物的制备方法。
背景技术
蛹虫草(Cordycepsmilitaris),又名北冬虫夏草,是麦角菌科虫草属真菌。具有益肺肾、补精髓、止血化痰的功效,现代研究发现有延缓衰老、抗疲劳和耐缺氧,调节免疫系统,抗缺氧、增加心肌营养和血流量等多种作用。目前蛹虫草人工栽培的培养基中为麦粒培养基和蛹虫草的菌丝体的混合物,其中含虫草素、多糖等多种活性成分。研究发现收获子实体后的培养基具有降血脂作用,开发降血脂的提取物将对虫草资源的充分利用带来很好的促进作用。
提取虫草素的方法有大孔树脂提取法、超临界法、阴阳离子交换树脂提取法等。但超临界法对于设备的投资巨大,阴阳离子交换法需要用HCl和氨水等调节pH值,极易残留,不利于食品安全,同时得率太低;另外,现有的方法大多步骤复杂,成本高,对原材料造成很大的浪费,不能用于工业化生产。就以上问题,已经有专利文献公开了改进工艺。
现有技术CN101157712B(200710170485.9,一种虫草素的分离纯化方法)公开了如下内容:该方法包括如下步骤:①虫草素的粗提:将蛹虫草固体干燥培养基粉碎,加入10倍重量的水中,浸泡10-60min后,加热至100℃并保持1-3h,过滤;滤渣重复上述步骤,再提取1次,合并滤液,滤液静置过夜;②粗提物的提纯:将上述滤液过大孔吸附树脂柱,使树脂对提取液中的虫草素进行充分吸附:先用10%乙醇洗脱除去部分水溶性杂质,再用50%乙醇洗脱,并收集50%乙醇部分进行浓缩干燥;③虫草素的进一步纯化:将上述获得的样品用水溶解后,过C18柱,用水洗脱,收集水相部分,浓缩,置4℃静置析晶;④虫草素纯品的制备:用蒸馏水重结晶3-6次,获得虫草素纯品。
现有技术CN103601812A(201310592568.2利用大孔吸附树脂从蛹虫草中提取虫草素及虫草多糖的方法)公开了:本发明方法将蛹虫草子实体(虫草素含量在0.2-0.5%)干燥至5%以下的含水量,用10-30目的筛网进行粉碎,其中粉碎粒度以20目最佳。将粉碎后的原料,以水为提取溶剂,料水比是1:5-20,提取温度50-70℃,每次提取时间是2-10h。将得到的提取液用浓缩到比重为1.1-1.5g/cm3的稠膏,其中浓缩温度控制在50-70℃,真空度在-0.005至-0.009Mpa,加2-5倍稠膏体积的乙醇,静置过夜取上清液备用,得醇沉物,干燥即粗虫草多糖。对上清液进行稀释处理,以备进行大孔吸附树脂纯化。上柱时控制上样溶液虫草素质量浓度为0.6-2.0mg/mL、上样体积2-10BV、上样流速1-3BV/h;解吸溶剂为20-50%乙醇水溶液(优选25%)、洗脱流速2-5BV/h、所用解吸溶剂体积4-10BV。将洗脱下来的洗脱液在压力为-0.005Mpa至-0.009Mpa、温度为50-70℃的状态下进行浓缩,将其浓缩至稠膏状态,然后将其干燥后得到虫草素含量15%以上的虫草素干膏。
现有技术CN(102558264B(201210014073.7提取蛹虫草中虫草素和虫草多糖的方法)公开了:本发明所提出的提取蛹虫草中虫草素和虫草多糖的方法于包括以下步骤:水提:将蛹虫草培养基粉放入提取罐中,向提取罐中加入质量是蛹虫草培养基粉质量12-18倍的水,在水温为55-58℃的环境下热回流提取,然后对提取液进行过滤后再减压浓缩;醇提:向减压浓缩的提取液中加入是其6-10倍的食用酒精,然后利用离心机分离出上清液和沉淀物;柱提上清液:首先对上清液进行浓缩,回收酒精,再将浓缩液加入到树脂柱内,并采用蒸馏水进行洗脱,将洗脱液收集后进行浓缩,对浓缩液喷雾干燥后即可获得虫草素;柱提沉淀物:首先对沉淀物放入容器中,然后依次用食用酒精、丙酮、乙醚对其进行清洗,再对清洗后的沉淀物进行干燥,再向经干燥过的沉淀物中加入8-12倍的水,加热溶解后去除其内的蛋白质,再进行一次浓缩,然后再加入2.5-3.5倍食用酒精进行醇沉,对醇沉后的沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚冲洗,将冲洗后的沉淀物进行干燥,所得干燥物即为虫草多糖。在水提步骤中,如果水的温度高于58℃,虫草素就易分解;如果水的温度低于55℃,不易使虫草素溶解。
现有技术CN(101928316A201010235132.4一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法)公开了:一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将北冬虫夏草固体培养基残基粉碎后置于容器内,用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基进行提取;提取剂流出后用大孔树脂进行吸附,然后流回装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器循环提取;提取时间为10~20hr;所述的大孔树脂为非极性大孔树脂;北冬虫夏草固体培养基残基、提取剂和大孔树脂的用量比为1kg:1~20L:0.3~0.5L;提取剂为水;(2)用洗脱剂洗脱大孔树脂,得到洗脱液;洗脱速度为0.5~2BV/hr;北冬虫夏草固体培养基残基与洗脱剂的用量比为1kg:1~2L;洗脱剂为10~50%体积浓度的乙醇水溶液;(3)取洗脱液浓缩和结晶,分离固体得到虫草素粗品;(4)将虫草素粗品洗涤和重结晶,得到高纯度片状虫草素晶体。
现有技术CN102070690B(201010566708.5一种同时制备腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法)公开了:一种同时制备腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法,蛹虫草提取物,经树脂柱分离及制备高效液相色谱两步高效纯化,同时获得纯度大于98%的腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷三种化学对照品,其具体步骤如下:1)树脂柱分离除杂:蛹虫草菌丝体,乙醇溶液提取,提取液进行树脂柱分离,先以水、10%乙醇溶液洗脱除去杂质,然后以体积分数在15%-25%之间的任一乙醇溶液洗脱,收集相应乙醇洗脱物,浓缩干燥得红色浸膏;2)制备高效液相色谱精制:红色浸膏用低浓度甲醇溶液溶解,微孔滤膜过滤,反相高效液相制备色谱分离,以甲醇-水溶液为洗脱体系,紫外检测器260nm监测,分别收集制备图谱中三个主要的色谱峰,相应流份干燥即可得到纯度大于98%的三个对照品,其外观为白色粉末。
现有技术CN101928316A(201010235132.4一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法)公开了:虫草素含量的测定方法(高效液相色谱法)如下:(1)标准品溶液的配制准确称取2.5毫克虫草素标准品,用纯净水加热溶解后定容到10毫升,冷却至室温备用。(2)色谱条件C18色谱柱(150mm*4.6mm);流动相为甲醇∶水=15∶85;流速1.0ml/min;柱温40℃;检测波长258nm。
现有技术CN102070690B(201010566708.5一种同时制备腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法)公开了:红色浸膏用体积分数为15%甲醇水溶液溶解,配置成150mg/ml的供试品溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤;制备型高效液相柱填料品牌为ChromatorexC18键合相填料;粒径为10μm,柱长20cm、直径7.5cm;进样体积为10ml,以体积浓度15%甲醇-水溶液为洗脱体系,流速控制在160ml/min,紫外检测器260nm检测,分别收集保留时间分别为8.2-8.7min(腺苷)、10.3-10.9min(虫草素)和14.8-15.2min(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份,以上三种高纯流份干燥即可得到纯度大于98%的相应对照品,其外观为白色粉末。
发明内容
本发明首先提供了一种降血脂虫草培养基提取物的制备方法,该方法包括如下步骤:
虫草培养基用100℃水提取,水提液中加入过XDA-200B树脂,树脂用去离子水清洗后,加入95%乙醇溶液洗脱,乙醇部分浓缩得到虫草培养基中树脂吸附部分。
具体的说,本发明的一种虫草提取物的制备方法,包括如下步骤:
1)虫草培养基的提取:蛹虫草培养基中加入8-12倍重量的蒸馏水中,煮沸并保持微沸1-3h,离心收集沉淀;沉淀加入8-12倍重量的蒸馏水,煮沸并保持微沸1-3h,离心,收集上清液;
2)树脂吸附:上清液过XDA-200B树脂柱(10cm×100cm),流速20-50mL/min,并用2-5倍柱体积的蒸馏水冲洗;
3)乙醇洗脱:向树脂柱中加入95%乙醇,冲洗2-3个柱体积,收集乙醇部分,浓缩,冻干得到蛹虫草树脂吸附部分。
本发明制备得到的虫草树脂吸附部分得率约为2%,虫草素达到8%以上。制备得到的虫草培养基提取物中树脂吸附部分具有很好的降血脂活性,具体可用于降血脂保健品类等。本发明的虫草培养基提取物的制备方法是一种简便、高效、成本低、得率高、适合规模化生产的方法。
本发明的虫草优选为蛹虫草。
虫草素含量的检测:
1、样品制备:精密称取蛹虫草培养基提取物0.1g,置于10ml具塞试管中,精确加入超纯水10mL,密塞,摇匀,超声提取60min,冷却至室温,补足失重,摇匀,10000r/min离心3min,取上清液,过0.22μm微孔滤膜,滤液供HPLC分析用。
对照品的制备:取虫草素对照品,用超纯水配成每1mL含0.1mg虫草素的溶液,并稀释成5个系列浓度的标准品溶液。
2、色谱分析条件:选用月旭公司AQ-C18(4.6×250mm,5μm)为分析柱,以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长:259nm,柱温:30℃,进样量:10μL,
洗脱程序:
甲醇(A)-水(B):
0→10min,0%A;
10→15min,A:0%→5%;
15→30min,A:5%→20%;
30→35min,A:20%→25%;
35→36min,A:25%→0%;
36→45min,0%A。
3、虫草培养基提取物中虫草素含量测定
根据标准品的峰面积与浓度的标准曲线,相对应计算虫草培养基提取物中虫草素的含量。
虫草素含量的检测:
1、样品制备:精密称取蛹虫草0.1g,置于10ml具塞试管中,精确加入超纯水10mL,密塞,摇匀,超声提取60min,冷却至室温,补足失重,摇匀,10000r/min离心3min,取上清液,过0.22μm微孔滤膜,滤液供HPLC分析用。
对照品的制备:取虫草素对照品,用超纯水配成每1mL含0.1mg虫草素的溶液,并稀释成5个系列浓度的标准品溶液。
2、色谱分析条件:选用月旭公司AQ-C18(4.6×250mm,5μm)为分析柱,以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长:259nm,柱温:30℃,进样量:10μL,
洗脱程序:
甲醇(A)-水(B):
0→10min,0%A;
10→15min,A:0%→5%;
15→30min,A:5%→20%;
30→35min,A:20%→25%;
35→36min,A:25%→0%;
36→45min,0%A。
3、蛹虫草中虫草素含量测定
根据标准品的峰面积与浓度的标准曲线,相对应计算蛹虫中虫草素的含量。
提取工艺优选过程:
现有技术CN101157712B公开了实施例1:
1.虫草素的粗提:以3Kg蛹虫草麦粒培养基为原料,粉碎成粗粒,加入10倍重量的水中,常温浸泡60min,加热至微沸,保持此温度60min,过滤。滤渣重复上述步骤,再提取一次,合并滤液。
2.虫草培养基粗提物的提纯:将静置过夜后的提取液上清过NKA-II型大孔树脂,使树脂对提取液中的虫草素进行充分吸附。先用10%乙醇洗脱大孔树脂,除去部分杂质,再用50%乙醇洗脱,并收集该部分浓缩冻干备用(得7g样品,虫草素纯度达40%),
与现有技术CN101157712B相比,本发明优化了大孔树脂的洗脱工艺:树脂用去离子水清洗后,加入95%乙醇溶液洗脱,因此,提高了得率得到有效的提高,从0.2%提高到2%。
本发明制备得到的蛹虫草树脂吸附部分得率约为2%,虫草素达到8%以上。
降血脂蛹虫草培养基提取物的剂型,采用本领域的常用赋形剂或载体,与降血脂蛹虫草培养基提取物制备药物、保健品、或功能性食品。
降血脂蛹虫草培养基提取物的片剂:降血脂蛹虫草培养基提取物10mg,淀粉87g,硬脂酸镁2g
制备工艺:取降血脂蛹虫草培养基提取物过100目筛,加淀粉、硬脂酸镁混合均匀,制成颗粒,干燥,压片,即得。
降血脂蛹虫草培养基提取物的胶囊:降血脂蛹虫草培养基提取物10mg,淀粉87g,硬脂酸镁2g
制备工艺:取降血脂蛹虫草培养基提取物过100目筛,加淀粉、硬脂酸镁混合均匀,制成颗粒,干燥,装胶囊,即得。
降血脂蛹虫草培养基提取物的冻干粉:
降血脂蛹虫草培养基提取物2.0g,乙二胺四乙酸二钠4.0g,加水定容至1000mL;制备工艺:降血脂蛹虫草培养基提取物分散在水中,在超声或搅拌条件下将乙二胺四乙酸二钠加入,使成澄清透明溶液;补加水定容至足量;经0.22μM微孔滤膜过滤,冷冻干燥得到。
具体实施方式:
实施例1:
1、蛹虫草培养基的提取:以沈阳聚鑫生物有限公司栽培的蛹虫草子实体采收后的培养基为原料,称取1Kg,加入20000mL蒸馏水,加热至沸腾,保持微沸120分钟,9700g离心20min。沉淀重复上述步骤,再提取1次,9700g离心20min,合并上清液。
2、上清液过XDA-200B树脂柱(10cm×100cm),流速20mL/min,并用3倍柱体积的蒸馏水冲洗。
3、乙醇洗脱:向树脂柱中加入95%乙醇,冲洗2个柱体积,收集乙醇部分,浓缩,冻干得到蛹虫草树脂吸附部分。
制备所得树脂吸附部分得率为2.0%,虫草素含量为8.3%。
实施例2:
虫草素含量的检测:
1、样品制备:精密称取实施例1的蛹虫草培养基提取物0.1g,置于10ml具塞试管中,精确加入超纯水10mL,密塞,摇匀,超声提取60min,冷却至室温,补足失重,摇匀,10000r/min离心3min,取上清液,过0.22μm微孔滤膜,滤液供HPLC分析用。
对照品的制备:取虫草素对照品,用超纯水配成每1mL含0.1mg虫草素的溶液,并稀释成5个系列浓度的标准品溶液。
2、色谱分析条件:选用月旭公司AQ-C18(4.6×250mm,5μm)为分析柱,以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长:259nm,柱温:30℃,进样量:10μL,
洗脱程序:
甲醇(A)-水(B):
0→10min,0%A;
10→15min,A:0%→5%;
15→30min,A:5%→20%;
30→35min,A:20%→25%;
35→36min,A:25%→0%;
36→45min,0%A。
3、虫草培养基提取物中虫草素含量测定
根据标准品的峰面积与浓度的标准曲线,相对应计算虫草培养基提取物中虫草素的含量。
实施例3:
1.实验方法
雄性SD大鼠40只,普通饲料喂养1周,大鼠禁食不禁水12h后,眼眶后静脉丛取血,分离血清,按试剂盒方法测定血清总胆固醇,根据总胆固醇高低分为8组,每组10只。正常组用普通饲料喂养,其余3组用高脂饲料(2%胆固醇、0.5%猪胆盐、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶,基础饲料87.3%)喂养,连续喂养6周。高脂喂养的同时分别按10ml/kg体重经口给予虫草培养基提取物和辛伐他汀,模型组和正常组给予等量的蒸馏水,连续42日,每日一次,于给药后第14、28d即大鼠禁食不禁水12小时后,眼眶后静脉丛取血,分离血清,按试剂盒方法测定血清胆固醇。第42日,即大鼠禁食不禁水12h后,股动脉取血,再颈椎脱臼处死大鼠,解剖大鼠,分离血清测定胆固醇、甘油三酯。
2.统计学处理:
所有实验数据均以表示,采用t检验进行组间比较,P<0.05认为有统计学差异。
3.结果
如表1所示,与正常组相比,大鼠食饵性高脂血症模型组的血清总胆固醇(TC)极明显升高(P<0.01)。第42天时,与模型组相比,虫草培养基提取物200mg/kg和辛伐他汀15mg/kg均极明显降低血清TC(P<0.01)。可见,培养基提取物可以极明显降低食饵性高脂血症大鼠的血清TC,作用和辛伐他汀相当。
表1虫草培养基提取物对食饵性高脂血症大鼠血清TC的影响(mmol/L)
##:P<0.01vs正常组*:P<0.05,**:P<0.01vs模型组
如表2所示,与大鼠食饵性高脂血症模型组相比,与模型组相比,虫草培养基提取物200mg/kg和辛伐他汀15mg/kg均极明显降低血清甘油三酯和游离脂肪酸(P<0.01)。
表2虫草培养基提取物对食饵性高脂血症大鼠血清TG和游离脂肪酸的影响
##:P<0.01vs正常组**:P<0.01vs模型组
实施例4:
降血脂蛹虫草培养基提取物的剂型
降血脂蛹虫草培养基提取物的片剂:降血脂蛹虫草培养基提取物10mg,淀粉87g,硬脂酸镁2g
制备工艺:取实施例1的降血脂蛹虫草培养基提取物过100目筛,加淀粉、硬脂酸镁混合均匀,制成颗粒,干燥,压片,即得。
降血脂蛹虫草培养基提取物的胶囊:降血脂蛹虫草培养基提取物10mg,淀粉87g,硬脂酸镁2g
制备工艺:取实施例1的降血脂蛹虫草培养基提取物过100目筛,加淀粉、硬脂酸镁混合均匀,制成颗粒,干燥,装胶囊,即得。
降血脂蛹虫草培养基提取物的冻干粉:
降血脂蛹虫草培养基提取物2.0g,乙二胺四乙酸二钠4.0g,加水定容至1000mL;
制备工艺:降血脂蛹虫草培养基提取物分散在水中,在超声或搅拌条件下将乙二胺四乙酸二钠加入,使成澄清透明溶液;补加水定容至足量;经0.22μM微孔滤膜过滤,冷冻干燥得到。
实施例5:
降血脂蛹虫草培养基提取物的片剂中的虫草素含量的检测虫草素含量的检测:
1、样品制备:精密称取降血脂蛹虫草培养基提取物的片剂0.01g,置于10ml具塞试管中,精确加入超纯水10mL,密塞,摇匀,超声提取60min,冷却至室温,补足失重,摇匀,10000r/min离心3min,取上清液,过0.22μm微孔滤膜,滤液供HPLC分析用。
对照品的制备:取虫草素对照品,用超纯水配成每1mL含0.1mg虫草素的溶液,并稀释成5个系列浓度的标准品溶液。
2、色谱分析条件:选用月旭公司AQ-C18(4.6×250mm,5μm)为分析柱,以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长:259nm,柱温:30℃,进样量:10μL,
洗脱程序:
甲醇(A)-水(B):
0→10min,0%A;
10→15min,A:0%→5%;
15→30min,A:5%→20%;
30→35min,A:20%→25%;
35→36min,A:25%→0%;
36→45min,0%A。
3、虫草培养基提取物中虫草素含量测定
根据标准品的峰面积与浓度的标准曲线,相对应计算:降血脂蛹虫草培养基提取物的片剂中虫草素的含量。
实施例6:
降血脂蛹虫草培养基提取物的胶囊中的虫草素含量的检测
虫草素含量的检测:
1、样品制备:精密称取胶囊内容物0.1g,置于10ml具塞试管中,精确加入超纯水10mL,密塞,摇匀,超声提取60min,冷却至室温,补足失重,摇匀,10000r/min离心3min,取上清液,过0.22μm微孔滤膜,滤液供HPLC分析用。
对照品的制备:取虫草素对照品,用超纯水配成每1mL含0.1mg虫草素的溶液,并稀释成5个系列浓度的标准品溶液。
2、色谱分析条件:选用月旭公司AQ-C18(4.6×250mm,5μm)为分析柱,以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长:259nm,柱温:30℃,进样量:10μL,
洗脱程序:
甲醇(A)-水(B):
0→10min,0%A;
10→15min,A:0%→5%;
15→30min,A:5%→20%;
30→35min,A:20%→25%;
35→36min,A:25%→0%;
36→45min,0%A。
3、虫草培养基提取物中虫草素含量测定
根据标准品的峰面积与浓度的标准曲线,相对应计算:降血脂蛹虫草培养基提取物的胶囊中虫草素的含量。
Claims (4)
1.一种虫草降血脂提取物的制备方法,该方法包括如下步骤:
虫草培养基用用沸水提取,收集上清液;上清液过XDA-200B树脂柱,95%乙醇洗脱部分为即得到虫草培养基提取物。
2.根据权利要求1所述的一种虫草培养基提取物的制备方法,包括如下步骤:虫草培养基的提取:虫草培养基中加入8-12倍重量的蒸馏水中,煮沸并保持微沸1-3h,离心收集上清液;
大孔树脂吸附:上清液过XDA-200B树脂柱(10cm×100cm),流速20-50mL/min,并用2-5倍柱体积的蒸馏水冲洗;
乙醇洗脱:向树脂柱中加入95%乙醇,冲洗2-3个柱体积,收集乙醇部分,浓缩,冻干得到虫草树脂吸附部分。
3.根据权利要求1或2的虫草培养基提取物用于制备降血脂活性的组合物。
4.根据权利要求1或2的虫草培养基提取物的制备方法,该方法包括如下步骤:
色谱分析条件:选用C18为分析柱,以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长:259nm,柱温:30℃,进样量:10μL,
洗脱程序:
甲醇(A)-水(B):
0→10min,0%A;
10→15min,A:0%→5%;
15→30min,A:5%→20%;
30→35min,A:20%→25%;
35→36min,A:25%→0%;
36→45min,0%A。
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CN201510586385.9A Pending CN105193865A (zh) | 2015-09-15 | 2015-09-15 | 一种降血脂虫草培养基提取物的制备方法 |
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CN (1) | CN105193865A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108633616A (zh) * | 2018-05-11 | 2018-10-12 | 江苏圣福来生态农业有限公司 | 一种提高蛹虫草中活性物质含量的培养种植方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN1298742A (zh) * | 2000-12-06 | 2001-06-13 | 陈星� | 一种虫草素的提纯方法 |
CN1539429A (zh) * | 2003-10-27 | 2004-10-27 | 中国医学科学院药物研究所 | 3’-脱氧腺苷在制备降血脂药物中的应用 |
CN101157712A (zh) * | 2007-11-16 | 2008-04-09 | 上海市农业科学院 | 一种虫草素的分离纯化方法 |
CN101574144A (zh) * | 2008-05-07 | 2009-11-11 | 中国医学科学院药物研究所 | 3′-脱氧腺苷减肥、胰岛素增敏和改善脂代谢的用途 |
CN103467551A (zh) * | 2013-09-22 | 2013-12-25 | 上海市农业科学院 | 一种虫草素和虫草多糖及其制备方法 |
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2015
- 2015-09-15 CN CN201510586385.9A patent/CN105193865A/zh active Pending
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Title |
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