CN103211857B - 落花生茎叶中生物碱的提取分离和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种落花生茎叶生物碱的提取分离和纯化工艺，其工艺包括，落花生茎叶的收割、阴干、粉碎；落花生茎叶粉末与氯仿按1:20-60混合；然后进行⁶⁰Co-γ辐照源常温辐照，剂量为1-20kGy；调酸碱进行萃取后，用甲醇溶解；不同极性大孔树脂吸附、用20%-60%甲醇（pH2.7-7.0）进行梯度洗脱，所得目标生物碱合并；产品冷冻干燥后真空包装。与其他提取纯化方法相比，本发明的制备工艺，主要采用⁶⁰Co-γ辐照与溶剂萃取相结合的方法进行提取，操作简单、生物碱损失小。采用本发明所述的方法制备落花生茎叶生物碱，得率高、成本低、易于推广。

Description

落花生茎叶中生物碱的提取分离和纯化方法

技术领域

本发明涉及一种农产品辐射加工方法，也涉及一种农副产物加工方法，具体的，涉及一种落花生茎叶中生物碱的提取、分离和纯化的方法。

背景技术

落花生茎叶为豆科植物落花生属落花生（ArachishypogaeaL.）的茎叶，落花生茎叶茎高30～70厘米，匍匐或直立；双数羽状复叶互生，长圆形至倒卵圆形，长2.5～5.5厘米，宽1.4～3厘米。一直以来，花生茎叶被丢弃或晒干焚烧，较少深加工和利用，造成相当严重的资源浪费和环境负担。2011年中国花生播种面积为470万公顷，总产量约为1620万吨。大面积的花生种植为我们提供优质花生产品的同时，也亟需我们为花生茎叶等秸秆农副产物找到高值转化的出口。多项研究表明落花生茎叶具有宁神降压、促进睡眠的功效，是具有高值转化潜力的农副产品。

在落花生茎叶有效物质提取技术方面，我们传统用的浸渍法、渗漉法、煎煮法、热回流提取法等，对植物的天然活性成分破坏很大。超声波提取法似乎是目前较常用的有效提取方法，但本发明的研究结果显示，运用⁶⁰Co-γ辐照源低剂量常温辐照与溶剂萃取相结合的方法，更容易促进有效物质溶出，提高有效物质得率。辐照技术在产品保鲜加工、灭菌，高分子材料降解等多个领域得到研究和发展，其原理是高能射线作用于物质时，能够打断分子间的连接键，从而使物质发生降解。本发明使用低剂量⁶⁰Co-γ辐照源常温辐射，可促进花生茎叶溶液中功能物质的溶出，但不进行分子间连接键的打断，其总生物碱得率均高于超声波提取法，为我们的分离纯化提供了基础和保障。

本发明以落花生茎叶为研究对象，通过用⁶⁰Co-γ辐照源低剂量常温辐照与溶剂萃取相结合的方法促进花生茎叶功能成分的溶出，选择性地提取目标化合物，并通过层析系统进行分离纯化，最终获得花生茎叶生物碱。本发明研究了⁶⁰Co-γ辐照源低剂量常温辐照技术和溶剂提取的方法相结合提取功能物质的可行性，为落花生茎叶中总生物碱的提取、分离和纯化提供了新颖高效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种落花生茎叶中总生物碱的提取、分离和纯化的方法。与其它的方法相比，本方法最主要的特点是采用⁶⁰Co-γ辐照源低剂量常温辐照与溶剂萃取相结合的方法进行提取，操作简单、不破坏功能成分、生物碱损失小。

本发明的技术方案为：

一种落花生茎叶中生物碱的提取分离和纯化的方法，采用⁶⁰Co-γ辐照源常温辐照提取并且采用大孔树脂纯化。

具体的，包括以下步骤：

（1）原料预处理：新鲜落花生茎叶采摘后，阴干、粉碎、过筛（优选40目），得落花生茎叶粉末，备用；

（2）辐照提取：落花生茎叶粉末和氯仿混合，装袋封口，⁶⁰Co-γ辐照源常温辐照；

（3）酸碱分离：辐照后的溶液用0.5mol/L的HCl调节pH值，萃取，分离氯仿层；水相用NaOH溶液调节至pH为lO.5，氯仿再次萃取，合并两次萃取氯仿层，蒸干氯仿后，用60%-80%（v/v）甲醇或60%-95%（v/v）的乙醇溶解并定容，得到含生物碱的醇溶液；

（4）大孔树脂纯化：将含生物碱的醇溶液定量取出并减压蒸干后，残留物用0.5mol/L的HCl溶解后，再用NaOH溶液调节pH至lO.5，将溶液移入装有大孔树脂的层析柱，分别采用lOOmL不同pH、不同浓度的醇溶液梯度洗脱，洗脱液进紫外分光光度计检测，合并目标生物碱；

（5）干燥：采用冷冻干燥；

（6）粉碎后真空包装。

优选的，所述的步骤（1）中，控制阴干的落花生茎叶含水8-25%；阴干的落花生茎叶中，碳水化合物10-30%，蛋白质8-20%。

优选的，所述的步骤（2）中，落花生茎叶粉末和氯仿按1:20-60（w/v）混合；辐照吸收剂量为1-20kGy（优选5kGy）。

优选的，所述的步骤（3）中，优选使用60%甲醇（v/v）或者70%乙醇（v/v）溶解并定容。

优选的，所述的步骤（4）中，大孔树脂选自HPD100、D-101、AB-8、HPD722、NKA-9、HPD600；进一步优选为AB-8。

优选的，所述的步骤（4）中，分别采用lOOmlpH2.7-pH7.0不同pH、20%-60%不同浓度（v/v）的醇溶液梯度洗脱。

优选的，所述的步骤（5）中，冷冻干燥22h。

本发明的有益效果：本发明的落花生茎叶生物碱的制备方法，将⁶⁰Co-γ辐照源低剂量辐照与溶剂萃取相结合，常温提取、操作简单、生物碱损失小。采用本发明所述的方法制备的落花生茎叶生物碱，纯度高、生产时间短、成本低、易于推广。

附图说明

图1辐照剂量对生物碱提取效果的影响

图2不同浓度甲醇分离液对生物碱紫外吸收峰的影响

图3不同浓度乙醇分离液对生物碱紫外吸收峰的影响

图4大孔树脂的种类对生物碱静态吸附率的影响

图5落花生茎叶生物碱的洗脱峰值图

具体实施方式

下面通过实例进一步说明本发明的技术内容和效果。

实施例1

辐照剂量对生物碱提取效果的影响

供试溶液的制备：称取2.00g落花生茎叶粉末置于包装袋中，加入三氯甲烷80ml，封口，⁶⁰Co-γ常温辐照剂量1-18kGy（对照组超声波法是25°C超声提取2小时），然后抽滤，上清液用三氯甲烷定容至100ml，取1ml于25ml容量瓶中，用三氯甲烷定容，备用。

标准曲线的绘制及样品的测定：精密称取20mg盐酸小檗碱标准品，加少量水超声溶解，转移至50ml容量瓶中，加水定容至刻度，取1ml置于10ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得0.04mg/ml标准品溶液。精密吸取标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，加三氯甲烷至5ml，加入溴甲酚绿缓冲液和0.2mol/LNaOH溶液各1ml，振摇1min，静置30min，取澄清的三氯甲烷液在415nm波长处进行测定。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。得标准曲线为y=17.834x+0.0006，R²=0.9999。取待测液1.0ml，加三氯甲烷至5ml，加溴甲酚绿缓冲液和0.2mol/mlNaOH溶液各1ml，振摇1min，静置30min，取澄清的三氯甲烷液，以空白做参比，415nm处测其吸光度。根据标准曲线计算其浓度。总生物碱含量可以由公式:

总生物碱（%）=(c×b×v)×100%/m       (公式1)

计算。c-根据标曲得到的生物碱浓度（mg/ml）；b-稀释倍数；v-待测液总体积；m-样品质量。结果见表1。

表1不同提取方式及辐照剂量下获得的总生物碱含量

由表1和图1，总体上，低剂量辐照法比超声波法提取的总生物碱含量要高。总生物碱的含量随着辐照剂量的增加，先上升后下降。在辐照剂量为5kGy时达到最高，总生物碱含量可达7.970±0.117%，与超声波法提取结果相比，差异极显着（p＜0.001）。辐照剂量高于5kGy后，总生物碱含量下降，可见辐照剂量越高对生物碱的破坏越大。因此辐照5kGy提取落花生茎叶总生物碱，效果最好。

实施例2

大孔树脂的种类对生物碱静态吸附率的影响

树脂的预处理:型号为HPD100、D-101、AB-8、HPD722、NKA-9、HPD600的六种大孔树脂分别用蒸馏水浸泡24h，倾去上层杂质，用95%乙醇浸泡过夜后用乙醇反复清洗，直到倾出的乙醇溶液清澈无浑浊。将醇洗后的树脂用蒸馏水反复清洗，直到完全无乙醇味为止。

称取预处理过的6种树脂各4.0g装入100ml容量瓶中，按40(大孔吸附树脂/g):1(生物碱/g)加入生物碱0.1g，用50ml甲醇溶解后置于振荡器上振荡，加快树脂吸附。振荡1h放置48h后，测定溶液中生物碱在323nm和415nm处的吸光度变化，静态吸附率A可以由公式:

静态吸附率（%）=[(A₀-A)×100%]/A₀       (公式2)

计算。公式2中，A₀一吸附前溶液中生物碱吸光度；A一吸附后溶液中生物碱吸光度。6种树脂的物理结构参数及其吸附结果见表2。

表2不同大孔树脂对应的生物碱静态吸附率结果

由表2和图2可知，NKA-9的静态吸附率较低，其它各种树脂的差别不大。根据结果，静态吸附1h后，AB-8吸附后溶液在323nm处吸光度最低，静态吸附率最高，说明吸附效果最好。在静态吸附48小时后，吸收峰323nm消失，在波长为415nm时，AB-8的静态吸附后溶液的吸附率依然较高，效果最好。结果表明，AB-8适合于分离纯化生物碱类物质，故选择AB-8树脂为下一步层析用树脂。

实施例3

不同洗脱液对生物碱紫外吸收峰的影响

5kGy辐照后的样品，旋转蒸发去除氯仿，分别加入60%、70%、80%甲醇和60%、70%、80%、95%乙醇于离心管中，置于超声仪中，25°C下超声2h后离心（3000r/min，10min）。取上清液待测。

紫外分光光度计全波长扫描：取样品上清液各0.5ml于7支离心管中，用各分离剂稀释20倍至10ml，摇匀后进紫外分光光度计进行200-800nm的全波长扫描（参比液为各分离剂稀释液），以观察最大吸收峰的波长及吸光值。所得结果见表3和图3-图4。

表3不同洗脱液分离出的生物碱的吸光值结果

根据表3和图3图4结果，以甲醇和乙醇为洗脱液，最大吸收峰的波长集中在323-326nm。60%甲醇或者70%乙醇为洗脱液时获得落花生茎叶总生物碱的吸光值较高，说明其洗脱效果较好。考虑到乙醇的易挥发性，我们采用60%甲醇进行下一步提纯。此外从图4可以看出，生物碱的吸收波长除了在232-326nm外，在415nm处也有吸收峰，虽然氯仿作为洗脱液其吸收波长也为415nm，但氯仿的毒性较大，所以在生物碱的纯化时不采用。

实施例4

不同pH、浓度的甲醇溶液对生物碱洗脱的影响

装柱：取洁净层析柱（规格：40×1.6cm），用玻璃棒将AB-8与95%乙醇（超声除气泡）混合物分多次导流入层析柱，避免出现气泡。树脂预处理：装柱后静置2h，用蒸馏水淋洗过夜，至洗出液无乙醇味，且洗出液与乙醇混合后无浑浊。上样：取生物碱粗分离物，用0.5mol/LHCL溶解后定容至100ml，再用NaOH调pH为10.5后上样，上样后静置2h。洗脱：考虑到蒸馏水与60%甲醇（pH2.7）之间的过渡，我们采用20%甲醇（pH7.0）、40%甲醇（pH7.0）、60%甲醇（pH4.0）、60%甲醇（pH3.5）、60%甲醇（pH2.7）各100ml进行梯度洗脱。接样及检测：洗脱液用小管收集后，全波长扫描检测，合并峰值较高的检测液，即为纯化后的生物碱。

表4不同pH、浓度的甲醇溶液的洗脱结果

样品管编号	波长（nm）
		3-9	324-326
10-15	330
		16-53	298-304

根据表4和图5结果，洗脱60分钟即53管以后的洗脱产物曲线峰值很小，即生物碱含量很小，所以忽略不计；落花生茎叶生物碱的吸收峰集中在298-304nm和324-326nm。

Claims (7)

1.一种落花生茎叶中生物碱的制备方法，其特征在于，采用⁶⁰Co-γ辐照源常温辐照提取并且采用大孔树脂纯化，包括以下步骤：

（1）原料预处理：新鲜落花生茎叶采摘后，阴干、粉碎、过筛，得落花生茎叶粉末，备用；

（2）辐照提取：落花生茎叶粉末和氯仿混合，装袋封口，⁶⁰Co-γ辐照源常温辐照；

（3）酸碱分离：辐照后的溶液用0.5mol/L的HCl调节pH值，萃取，分离氯仿层；水相用NaOH溶液调节至pH为10.5，氯仿再次萃取，合并两次萃取氯仿层，蒸干氯仿后，用60%-80%（v/v）甲醇或60%-95%（v/v）的乙醇溶解并定容，得到含生物碱的醇溶液；

（4）大孔树脂纯化：将含生物碱的醇溶液定量取出并减压蒸干后，残留物用0.5mol/L的HCl溶解后，再用NaOH溶液调节pH至10.5，将溶液移入装有大孔树脂的层析柱，分别采用100mL不同pH、不同浓度的醇溶液梯度洗脱，洗脱液进紫外分光光度计检测，合并目标生物碱；

（5）干燥：采用冷冻干燥；

（6）粉碎后真空包装。

2.如权利要求1所述的一种落花生茎叶中生物碱的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，控制阴干的落花生茎叶含水8-25%；阴干的落花生茎叶中，碳水化合物10-30%，蛋白质8-20%。

3.如权利要求1所述的一种落花生茎叶中生物碱的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，落花生茎叶粉末和氯仿按1:20-60（w/v）混合；辐照吸收剂量为1-20kGy。

4.如权利要求1所述的一种落花生茎叶中生物碱的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，优选使用60%甲醇（v/v）或者70%乙醇（v/v）溶解并定容。

5.如权利要求1所述的一种落花生茎叶中生物碱的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，大孔树脂选自HPD100、D-101、AB-8、HPD722、NKA-9、HPD600。

6.如权利要求1所述的一种落花生茎叶中生物碱的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，分别采用100mlpH2.7-pH7.0不同pH、20%-60%不同浓度（v/v）的醇溶液梯度洗脱。

7.如权利要求1所述的一种落花生茎叶中生物碱的制备方法，其特征在于，所述的步骤（5）中，冷冻干燥22h。

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