CN101172991B

CN101172991B - 一种从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法

Info

Publication number: CN101172991B
Application number: CN2007101445356A
Authority: CN
Inventors: 付玉杰; 祖元刚; 刘威; 孔羽; 佟美鸿; 张琳; 顾成波; 李双明; 张学科; 张宝友
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2007-11-01
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2027-11-01
Also published as: CN101172991A

Abstract

本发明涉及一种中草药功能性成分的提取纯化方法，目的是要提供一种简便安全经济高效地从木豆枝叶中提取纯化得到单体化合物牡荆苷和异牡荆苷的方法，所采取的技术方案是：以木豆新鲜或干燥枝叶为原料，采用匀浆萃取技术、超声波辅助提取技术、超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、ODS-C₁₈反相中压硅胶柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术相结合，得到纯度均达到90％以上的牡荆苷和异牡荆苷，其提取率分别为0.17％和0.13％以上。本发明所用原料为在农业生产中大都被废弃的新鲜或者干燥木豆枝叶，既不破坏植物生态平衡、不影响农业生产，又能得到高纯度的木豆功能性成分。而且该方法经提取、初步除杂及再纯化，简单易行，目标化合物损失少。适用于工业应用，对产业化生产具有重要意义。

Description

一种从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法

技术领域

本发明涉及从植物中分离纯化功能性成分的一种方法，具体是从木豆的新鲜或干燥枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷。

背景技术

木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]为豆科木豆属一年生或多年生木本植物、常绿灌木。又名鸽子豆、树黄豆等，是一种民间用药。有清凉、消热、解毒、止痛止血、抑菌消炎等功效，民间用于治疗外伤、烧伤、感染、褥疮和抗菌消炎等(刘中秋等，1998；孙绍美等，1995)。此外，木豆提取物制剂在印度、巴西、古巴、墨西哥、南非等国用于治疗感冒、支气管炎、麻疹、痢疾、肝炎、皮肤病、烧伤、溃疡、肿瘤等疾病(Abbiw DK.，1990；Duke JA.et al，1994；Milliken W.，1997；Grover JK.，2002)，疗效显著。我国临床组方用于治疗股骨头坏死等症。木豆中的活性成分包括芹菜素、木犀草素、牡荆苷、异牡荆苷、木豆素、木豆素A、木豆素C、球松素、水杨酸、β-谷甾醇、柚皮素-4′、7-二甲醚和一些挥发油类成分(林励等，1999；Christopher JC.et al，1982；程誌青等，1992)。

在木豆较多的活性组分中，尤以牡荆苷和异牡荆苷含量较高并且活性突出。二者均属于碳苷黄酮，结构稳定，不易被降解；能深入病灶部位，直接发挥药效；亲水性强。其降血压、消炎、抗氧化、抗痉挛、抗菌等活性明显(Prabhakar MC.et al，1981；Agnese AM.et al，2001；Picerno P.，2003；Bramati L.，2003；Hien TV.，2002；王凌云等，2003)。

目前，尚未见到从木豆叶中同时快速提取纯化牡荆苷和异牡荆苷两个同分异构体的报道。已有的提取纯化牡荆苷或异牡荆苷的方法主要是传统的醇提取、柱层析纯化。传统的提纯过程漫长且目标化合物损失较多，采用多次硅胶柱层析，操作步骤繁多且洗脱液以氯仿、丙酮、乙酸乙酯等毒性较大、价格较高的试剂为主。中国专利“白花败酱草中几种高纯度药用物质的快速制备方法”(公开号CN1683386)中采用传统的液液萃取、柱层析和高效逆流色谱制备得到异牡荆苷，此法时间长、有机溶剂用量大，并受到仪器设备的制约。林励(1999年)等采用传统的柱层析方法分离得到牡荆苷和异牡荆苷，历时长，得率低。

综上所述，在利用植物资源分离纯化牡荆苷和异牡荆苷的过程中，主要的影响因素在于提取工艺落后、原料处理和分离过程中普遍存在牡荆苷和异牡荆苷的流失、纯化过程漫长，使得成本升高。因此，有必要寻找一种简便安全经济高效地提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法。本发明旨在建立一种通过多种现代分离纯化技术相结合的方法，实现简单快速、损失少的分离纯化牡荆苷和异牡荆苷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以木豆新鲜或者干燥枝叶为原料，通过匀浆萃取技术、超声波辅助提取技术、超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、ODS-C₁₈反相中压硅胶柱层析分离技术结合低温析晶和重结晶技术，从而大量、快速获得高纯度牡荆苷和异牡荆苷产品的工艺方法。本发明的目的是通过以下方案来达到的：

木豆新鲜或者干燥枝叶经过70～80％乙醇匀浆萃取后，超声波辅助提取，提取液浓缩后加入50～60℃温水超声波振荡絮凝，静止除杂，所得到溶液经乙酸乙酯负压空化混悬液液萃取、大孔吸附树脂法富集和一次ODS-C₁₈反相中压硅胶柱层析后分别得到牡荆苷和异牡荆苷的产品，经过低温析晶和重结晶得到纯度大于90％的纯品。

上述的牡荆苷和异牡荆苷提取纯化方法，其特征在于，取一定量的新鲜或干燥木豆枝叶，加入70～80％乙醇溶液(体积为固体质量的4～8倍)连续匀浆萃取3次，每次0.5～1.5min。然后，超声波辅助提取3次，每次30～45min，温度为35～50℃，第一次提取70～80％乙醇用量为固体质量的8～10倍，第二次用6～8倍，第三次用4～6倍，并可将第三次提取液用于下一批原料的第一次超声波辅助提取。合并提取液，减压浓缩回收乙醇。在浓缩液中加入4～6倍体积的50～60℃温水，置于超声波提取器中，50～60KHz条件下振荡15～25min，静止10～15min，取上清液，以0.04～0.06MPa负压为动力用乙酸乙酯进行负压空化混悬液液萃取3～5次，每次乙酸乙酯用量为体系的1/2。浓缩萃取液至干，得到的固形物用水充分混悬，配置成料液浓度为10～25mg/mL混悬药液。同时将大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将用水混悬的药液通过吸附柱，上样量1～2.5BV，以流速为每小时6～8mL/g树脂、PH＝7条件下过吸附柱。吸附后用水2BV洗杂质，然后用60～70％乙醇6～9BV解吸，收集解吸液，浓缩得浸膏，将浸膏按照质量-体积1∶1(mg∶mL)加入甲醇-乙酸乙酯(体积比1∶1)50℃加热溶解，待冷却至室温得到黄色析出物，干燥后即得目标化合物粗品。

将目标化合物粗品用2～8％甲醇溶解，配制成料液浓度为5～10mg/mL的样品液，上样量2～5BV，0.45μm过滤后注入床体积为50～150mL的ODS-C₁₈反相中压硅胶柱，用水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮或水-乙腈系统梯度洗脱，每个梯度用量为2～6BV，收集洗脱液，每份1/4～1/2BV。用聚酰胺薄膜层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为三氯甲烷∶甲醇＝15∶1～1∶1，显色剂为2％AlCl₃乙醇溶液，紫外波长为254nm和360nm。将相同部分减压浓缩至干，以三氯甲烷和甲醇等溶剂重结晶得到牡荆苷和异牡荆苷单体。

上述方法所涉及的负压空化混悬液液萃取技术，其特征在于：所用溶剂除乙酸乙酯外还包括乙酸甲酯、三氯甲烷、二氯甲烷。回收溶剂后，有机相部分为目标物。该方法是以负压为动力，利用气泡产生的空化效应、湍流效应的一种强化液液萃取工艺。

上述的木豆中牡荆苷和异牡荆苷的提取纯化方法所用的大孔吸附树脂为AB-8型、D101型、AL-9型及NKA系列等。

上述的低温析晶和重结晶技术，其特征在于：重结晶所用的溶剂除三氯甲烷和甲醇外，还包括二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈和乙醇，比例为三氯甲烷(或二氯甲烷、乙酸乙酯)∶甲醇(或丙酮、乙腈、乙醇)＝15∶1～1∶1低温析晶温度为-10℃～20℃。

本发明的优点：

1.本发明以在农业生产中大都被废弃的新鲜或者干燥木豆枝叶为原料，可以在不破坏植物生态平衡、不影响农业生产的基础上，对植物资源进行高效合理的利用。

2.该方法简单易行，周期短，可实现大规模的产业化生产。

3.产品得率高、纯度高。

附图说明

图1为牡荆苷的结构

图2为异牡荆苷的结构

具体实施方案

实施例1

称取1000g木豆干枝叶，加入8倍体积的75％乙醇后，连续匀浆萃取3次，每次1min，然后在35～50℃条件下超声波辅助提取3次(第二次加入75％乙醇量为固体质量的6倍，第三次为4倍)，每次45min，合并三次提取液，减压浓缩至无明显液体流出。

将浓缩液加入60℃温水(4.5L)中，于超声波提取器中30～50KHz条件下振荡15～25min，静止10～15min，取上清，以0.05MPa负压为动力用4L乙酸乙酯进行负压空化混悬液液萃取3次，浓缩萃取液，得到的固形物以8％乙醇温热混悬配制成料液浓度为10mg/mL的样品液，最大上样量为15mg/mL树脂，以流速为每小时8mL/g树脂过大孔吸附树脂柱，用2BV8％的乙醇洗杂质，之后用6BV55％的乙醇洗脱，收集流出液，浓缩得浸膏，将浸膏用甲醇-乙酸乙酯(体积比1∶1)加热溶解，然后冷却得到黄色析出物，干燥后即得目标化合物粗品。

将目标化合物粗品4.76g用5％甲醇溶解，0.45μm过滤后的450mL样品液注入24mm×160mm(床体积约为80mL)的ODS-C₁₈(12nm S-50μm)反相硅胶柱(柱填料为YMC公司产品)。依次用水240mL、10％甲醇240mL、20％甲醇350mL、30％甲醇450mL、35％甲醇450mL、40％甲醇300mL、50％甲醇240mL、100％甲醇240mL梯度洗脱，收集10％～50％甲醇洗脱液，30mL/份。

用聚酰胺薄膜层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为三氯甲烷∶甲醇＝5∶1，显色剂为2％AlCl₃乙醇溶液，紫外波长为254nm和360nm。分别获得2种黄色化合物。化合物1为牡荆苷，提取率为0.1816％，纯度为96％。化合物2为异牡荆苷提取率为0.1436％，纯度为95％。

实施例2

称取新鲜木豆枝叶4.79kg(干重为1kg)，加入6倍体积85％乙醇后，连续匀浆萃取3次，每次1.5min，然后在35～50℃条件下超声波辅助提取3次(第二、三次加入85％乙醇量均为固体质量的4倍)，每次45min，合并三次提取液，减压浓缩至无明显液体流出。

将浓缩液加入50～60℃温水(4.5L)中，于超声波提取器中50～60KHz条件下振荡15～25min，静止10～15min，取上清，以负压为动力用4L乙酸乙酯进行负压空化混悬液液萃取3次，浓缩萃取液，得到的固形物以8％乙醇温热混悬，配制成料液浓度为12mg/mL的样品液，最大上样量为15mg/mL树脂，以流速为每小时8mL/g树脂过大孔吸附树脂柱，用2BV8％的乙醇洗杂质，之后用6BV55％的乙醇洗脱，收集流出液，浓缩得浸膏，将浸膏用甲醇-乙酸乙酯(体积比1∶1)加热溶解，然后冷却得到黄色析出物，干燥后即得目标化合物粗品。

将目标化合物粗品3.69g用5％甲醇400mL溶解，0.45μm过滤后注入16mm×160mm(床体积约为70mL)的ODS-C₁₈(12nm S-50μm)反相硅胶柱(柱填料为YMC公司产品)。依次用水210mL、10％甲醇210mL、20％甲醇300mL、30％甲醇350mL、35％甲醇350mL、40％甲醇210mL、50％甲醇210mL、100％甲醇210mL梯度洗脱，收集10％～50％甲醇洗脱液，30mL/份。

用聚酰胺薄膜层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为三氯甲烷∶甲醇＝5∶1，显色剂为2％AlCl₃乙醇溶液，紫外波长为254nm和360nm。分别获得2种黄色化合物。化合物1为牡荆苷，提取率为0.1793％，纯度为94％。化合物2为异牡荆苷提取率为0.1379％，纯度为92％。

本试验中所用到的标准品购自Sigma公司。

结果定量检测分析采用下表条件：

仪器	Waters高效液相色谱仪(Waters600泵)
		色谱柱	HiQ sil C18W色谱柱(4.6mmΦ×250mm)
柱温	25℃
		流动相	甲醇-水(35∶65，V/V)(牡荆苷，异牡荆苷)
流速	1mL/min
		进样体积	10μL
检测器	Waters2996二极管阵列检测器

Claims

1.一种从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其主要特征在于：木豆新鲜或干燥枝叶经70～80％乙醇匀浆萃取、超声波辅助提取3次，提取液浓缩后加入50～60℃温水，超声波振荡絮凝、静止，所得到上清液经乙酸乙酯负压空化混悬液液萃取法、大孔吸附树脂富集法和一次ODS-C18反相中压硅胶柱层析后得到牡荆苷和异牡荆苷产品，经过低温析晶和重结晶得到纯度大于90％的纯品。

2.按照权利要求1所述的从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其特征在于：木豆枝叶为来源于各品种木豆植株的新鲜或者干燥枝叶。

3.按照权利要求1所述的从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其特征在于：匀浆萃取所用的溶剂为70～80％乙醇，体积为固体质量的4～8倍，连续萃取3次，每次0.5～1.5min，采用70～80％乙醇匀浆时，打破细胞壁的屏障作用，加快了胞内物质向溶剂中的释放。

4.按照权利要求1所述的从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其特征在于：超声波辅助提取所用提取温度为35～50℃，所用的溶剂体积为固体质量的8～10倍，提取时间为30～45min。

5.按照权利要求1所述的从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其特征在于：超声振荡絮凝技术是在提取物浓缩物中加入50～60℃温水的体积为浓缩物的4～6倍，超声波振荡时间为15～25min，频率为50～60KHz，静止时间为10～15min。

6.按照权利要求1所述的从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其特征在于：负压空化混悬液液萃取法所用溶剂为乙酸乙酯，萃取所用的溶剂量为体系的1/2，萃取次数为3～5次，所用压力为0.04～0.06MPa，回收有机溶剂后所得固形物为目标物。

7.按照权利要求1所述的从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其特征在于：大孔吸附树脂富集法所用树脂为D101、AB-8、AL-9或NKA系列大孔吸附树脂中的一种，

该方法中大孔树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，将负压空化混悬液液萃取所得到的固形物用水配制成料液浓度为10～25mg/mL混悬药液，上样量1～2.5BV，以流速为每小时6～8mL/g树脂、pH＝7条件下过吸附柱，吸附后用水2BV洗杂质，然后用60～70％乙醇6～9BV解吸，收集解吸液，浓缩得浸膏，将每毫克浸膏中加入1mL由等体积的甲醇和乙酸乙酯组成的混合液，50℃加热溶解，待冷却至室温得到黄色析出物，干燥后即得目标化合物粗品。

8.按照权利要求1所述的从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其特征在于：ODS-C18反相中压硅胶柱层析技术所用样品为树脂富集后得到的目标化合物粗品，将该粗品用2～8％甲醇溶解，配制成料液浓度为5～10mg/mL的样品液，上样量2～5BV，0.45μm过滤后注入床体积为50～150mL的ODS-C18反相中压硅胶柱，用水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮或水-乙腈系统梯度洗脱，每个梯度2～6BV，收集洗脱液，每份1/4～1/2床体积，用聚酰胺薄膜层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为三氯甲烷∶甲醇＝15∶1～1∶1，显色剂为2％AlCl₃乙醇溶液，紫外波长为254nm和360nm。

9.按照权利要求1所述的从木豆枝叶中提取纯化牡荆苷和异牡荆苷的方法，其特征在于：重结晶所用的溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈和乙醇，所用溶剂比例为(三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯)∶(甲醇、丙酮、乙腈或乙醇)＝15∶1～1∶1，低温析晶温度为-10℃～20℃。