CN112007055A - 一种含虫草素和虫草多糖的虫草提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含虫草素和虫草多糖的虫草提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及食用真菌领域，提供一种含虫草素和虫草多糖的虫草提取物及其制备方法和应用，用于提高虫草提取物的免疫活性。本发明提供的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，包括：将蛹虫草子实体于65℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛；将10~20质量份的蛹虫草粉加入到400~500质量份的PEG/(NH4)2SO4双水相体系中，采用微波辅助提取，得到粗提取液；加入NKA‑Ⅱ树脂10~20质量份，搅拌12~24h，过滤；树脂用去离子水清洗后，再用5~10倍量的30~50%的乙醇溶液清洗2~4次，洗出液为提取液；滤液静置后分相，取下相，加入2~4倍量的乙醇使其沉淀，沉淀物即提取物；将提取物超声分散在提取液中，真空干燥，得到虫草提取物。可以得到高虫草素和虫草多糖含量的虫草提取物。

Description

一种含虫草素和虫草多糖的虫草提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食用真菌领域，具体涉及含虫草素和虫草多糖的虫草提取物及其制备方法和应用。
背景技术
蛹虫草是我国最常见，也是分布最广的虫草菌，有益肺肾、补精髓、止血化痰的功效，现代研究发现有延缓衰老、抗疲劳和耐缺氧，调节免疫系统，抗缺氧、增加心肌营养和血流量等多种作用。目前蛹虫草主要以人工栽培为主，并且达到规模化生产。
虫草素即3`-脱氧腺苷和虫草多糖是虫草属的特有成分，虫草素具有抗病毒、抗癌、降血脂等多种生理活性，虫草多糖也具有很好的免疫调节作用。
发明内容
本发明解决的技术问题为提高虫草提取物的免疫活性，提供含虫草素和虫草多糖的虫草提取物。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，包括：
将蛹虫草子实体于65℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛；
将10~20质量份的蛹虫草粉加入到400~500质量份的PEG/(NH4)2SO4双水相体系中，采用微波辅助提取，得到粗提取液；
加入NKA-Ⅱ树脂10~20质量份，搅拌12~24h，过滤；树脂用去离子水清洗后，再用5~10倍量的30~50%的乙醇溶液清洗2~4次，洗出液为提取液；滤液静置后分相，取下相，加入2~4倍量的乙醇使其沉淀，沉淀物即提取物；
将提取物超声分散在提取液中，真空干燥，得到虫草提取物。
用双水相体系对蛹虫草实体粉末进行处理，得到的粗提取液中含有虫草素和虫草多糖；在用NKA-Ⅱ树脂在粗提取液中搅拌提取，可以显著提高虫草素的提取率；从下相中提取的虫草多糖的纯度更高；二者混合后得到虫草提取物中虫草素和虫草多糖的含量更高。
可以得到高虫草素和虫草多糖含量的虫草提取物。
优选地，所述PEG/(NH4)2SO4双水相体系的制备方法为：
将35%的聚乙二醇6000、25%的(NH4)2SO4、18%的NaCl、22%的去离子水混合均匀，即得PEG/(NH4)2SO4双水相体系。双水相体系可以同时提取虫草多糖和虫草素，有效避免单一提取造成的资源浪费。
优选地，所述沉淀物加少量水溶解后，再加入2倍量的乙醇使其沉淀，得到的沉淀物为提取物。对沉淀物进行纯化处理，可以得到纯度更高的虫草多糖。
优选地，所述微波辅助提取的提取温度为70~80℃，提取时间为60~80min，微波功率为200w。利用微波进行辅助提取，可以进一步提高虫草素和虫草多糖的提取效率。
优选地，所述蛹虫草的培养方法为：
将菌株在室温下放置一周活化，接种到液体培养基上，20℃下培育7d后接种到栽培培养基，所述栽培培养基的接种量为6~10%。
优选地，所述液体培养基包括：葡萄糖20~30质量份，蛋白胨8~15质量份，MgSO40.5~2质量份，KH2PO4 0.1~1质量份，VB1 0.05~0.1质量份，去离子水1~1.5质量份。
优选地，所述栽培培养基为：燕麦仁2~8质量份，糙米8~15质量份，黄豆2~8质量份，莲子8~15质量份，葡萄糖0.5~1质量份，脱脂奶粉0.1~1质量份，去离子水45~50质量份。采用复合杂粮培养基，培养出的蛹虫草可以经双水相体系提取出更多的虫草素和虫草多糖。
优选地，将菌株在室温下放置一周活化，取0.5×0.5cm2接种到液体培养基上。
优选地，所述糙米为发芽糙米，所述发芽糙米的制备方法为：
利用收获在半年内稻谷脱壳后的糙米作为发芽糙米的原料，将糙米用清水冲洗后在5～15℃温度下用浸泡液浸泡2～4小时；浸泡液由萘乙酸0.3%；蛋氨酸 0.1%；CaCl21%；偏钒酸钠0.04%，酒石酸钾钠为0.06%，余量为去离子水，去离子水的重量为糙米的2-4倍；
浸泡过后的糙米在50-60℃条件下使糙米在充满氮气的容器中发芽5～6h，将发芽后的糙米用含有细胞生长素0.5%和水杨酸钠0.4%的去离子水溶液进行水洗，去离子水量为糙米的1-3倍；
将水洗后的糙米用植酸酶在pH 8-9的条件下处理30-50min，酶的用量为7-9 U／mL，处理后的发芽糙米进行微波干燥，在30～35℃温度下干燥2-3h，微波整机功率：450W，磁控管频率,1800-2200MHz，制得水分重量含量为8～10%的发芽糙米。采用发芽糙米的复合培养基，可以有效的促进蛹虫草的生长，提高虫草提取物中虫草素和虫草多糖的含量。
含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，根据上述的制备方法制备的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物。
含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，在抑制肿瘤生长的制药应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：可以得到高虫草素和虫草多糖含量的虫草提取物。
通过一定方式培育得到的虫草中，虫草素、虫草多糖及提取液中的其他成分产生了一定协同效应，可以显著提高虫草提取物的免疫活性。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，包括：
将蛹虫草子实体于65℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛；
将10g的蛹虫草粉加入到400g的PEG/(NH4)2SO4双水相体系中，将35%的聚乙二醇6000、25%的(NH4)2SO4、18%的NaCl、22%的去离子水混合均匀，即得PEG/(NH4)2SO4双水相体系；采用微波辅助提取，得到粗提取液；所述微波辅助提取的提取温度为75℃，提取时间为75min，微波功率为200w；
加入NKA-Ⅱ树脂10g，搅拌24h，过滤；树脂用去离子水清洗后，再用8倍量的40%的乙醇溶液清洗3次，洗出液为提取液；滤液静置后分相，取下相，加入2倍量的乙醇使其沉淀，沉淀物加少量水溶解后，再加入2倍量的乙醇使其沉淀，得到的沉淀物为提取物；
将提取物超声分散在提取液中，真空干燥，得到虫草提取物。所述蛹虫草的培养方法为：蛹虫草［Cordycep s militaris］菌株( Cm－29) 由扬州循天岭生物科技有限公司保藏并提供；
将菌株在室温下放置一周活化，取0.5×0.5cm2接种到液体培养基上，20℃下培育7d后接种到栽培培养基，所述栽培培养基的接种量为8%。所述液体培养基包括：葡萄糖25g，蛋白胨10g，MgSO4 1g，KH2PO4 0.5g，VB1 0.08g，去离子水1000mL。所述栽培培养基为：燕麦仁5g，发芽糙米10g，黄豆5g，莲子10g，葡萄糖0.75g，脱脂奶粉0.5g，去离子水48.75g。
所述发芽糙米的制备方法为：
利用收获在半年内稻谷脱壳后的糙米作为发芽糙米的原料，将糙米20g用清水冲洗后在10℃温度下用浸泡液浸泡3小时；浸泡液由萘乙酸0.3%；蛋氨酸 0.1%；CaCl2 1%；偏钒酸钠0.04%，酒石酸钾钠为0.06%，余量为去离子水，去离子水的重量为50g；
浸泡过后的糙米在50℃条件下使糙米在充满氮气的容器中发芽5h，将发芽后的糙米用含有细胞生长素0.5%和水杨酸钠0.4%的去离子水溶液进行水洗，去离子水量为40g；
将水洗后的糙米用植酸酶在pH 8的条件下处理30-50min，酶的用量为7-9 U／mL，处理后的发芽糙米进行微波干燥，在30℃温度下干燥3h，微波整机功率：450W，磁控管频率，1800-2200MHz，制得水分重量含量为8~10%的发芽糙米。
用双水相体系对蛹虫草实体粉末进行处理，得到的粗提取液中含有虫草素和虫草多糖；在用NKA-Ⅱ树脂在粗提取液中搅拌提取，可以显著提高虫草素的提取率；从下相中提取的虫草多糖的纯度更高；二者混合后得到虫草提取物中虫草素和虫草多糖的含量更高。可以得到高虫草素和虫草多糖含量的虫草提取物。双水相体系可以同时提取虫草多糖和虫草素，有效避免单一提取造成的资源浪费。对沉淀物进行纯化处理，可以得到纯度更高的虫草多糖。利用微波进行辅助提取，可以进一步提高虫草素和虫草多糖的提取效率。采用复合杂粮培养基，培养出的蛹虫草可以经双水相体系提取出更多的虫草素和虫草多糖。
实施例2
含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，包括：
将蛹虫草子实体于65℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛；
将10g的蛹虫草粉加入到400g的PEG/(NH4)2SO4双水相体系中，将35%的聚乙二醇6000、25%的(NH4)2SO4、18%的NaCl、22%的去离子水混合均匀，即得PEG/(NH4)2SO4双水相体系；采用微波辅助提取，得到粗提取液；所述微波辅助提取的提取温度为75℃，提取时间为75min，微波功率为200w；
加入NKA-Ⅱ树脂10g，搅拌24h，过滤；树脂用去离子水清洗后，再用8倍量的40%的乙醇溶液清洗3次，洗出液为提取液；滤液静置后分相，取下相，加入2倍量的乙醇使其沉淀，沉淀物加少量水溶解后，再加入2倍量的乙醇使其沉淀，得到的沉淀物为提取物；
将提取物超声分散在提取液中，真空干燥，得到虫草提取物。所述蛹虫草的培养方法为：
将菌株在室温下放置一周活化，取0.5×0.5cm2接种到液体培养基上，20℃下培育7d后接种到栽培培养基，所述栽培培养基的接种量为8%。所述液体培养基包括：葡萄糖25g，蛋白胨10g，MgSO4 1g，KH2PO4 0.5g，VB1 0.08g，去离子水1000mL。所述栽培培养基为：燕麦仁5g，糙米10g，黄豆5g，莲子10g，葡萄糖0.75g，脱脂奶粉0.5g，去离子水48.75g。
实施例3
实施例3同实施例1不同之处在于，所述糙米为收获在半年内稻谷脱壳后的糙米。所述栽培培养基为：燕麦仁6g，糙米6g，黄豆6g，莲子12g，葡萄糖0.75g，脱脂奶粉0.5g，去离子水48.75g。其余同实施例1。
实施例4
实施例4同实施例1不同之处在于，所述糙米为收获在半年内稻谷脱壳后的糙米。所述栽培培养基为：燕麦仁30g，葡萄糖0.75g，脱脂奶粉0.5g，去离子水48.75g。其余同实施例1。
实施例5
实施例5同实施例1不同之处在于，所述糙米为发芽糙米。所述栽培培养基为：发芽糙米30g，葡萄糖0.75g，脱脂奶粉0.5g，去离子水48.75g。
对比例1
含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，包括：
将蛹虫草子实体于65℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛；
将10g的蛹虫草粉加入到400g的PEG/(NH4)2SO4双水相体系中，将35%的聚乙二醇6000、25%的(NH4)2SO4、18%的NaCl、22%的去离子水混合均匀，即得PEG/(NH4)2SO4双水相体系；采用微波辅助提取，得到粗提取液；所述微波辅助提取的提取温度为75℃，提取时间为75min，微波功率为200w；
将粗提取液静置分相，上相在转速为5000r/min下离心2min，取上层清液，依次用乙酸乙酯和石油醚洗涤后，真空干燥，得到提取液；下相加入2倍量的乙醇使其沉淀，沉淀物加少量水溶解后，再加入2倍量的乙醇使其沉淀，得到的沉淀物为提取物；
将提取物超声分散在提取液中，真空干燥，得到虫草提取物。所述蛹虫草为实施例1中的蛹虫草。
对比例2
含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，包括：
将蛹虫草子实体于65℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛；
将10g的蛹虫草粉加入到400g的PEG/(NH4)2SO4双水相体系中，将35%的聚乙二醇6000、25%的(NH4)2SO4、18%的NaCl、22%的去离子水混合均匀，即得PEG/(NH4)2SO4双水相体系；采用微波辅助提取，得到粗提取液；所述微波辅助提取的提取温度为40℃，提取时间为20min，微波功率为200w；
加入NKA-Ⅱ树脂10g，搅拌24h，过滤；树脂用去离子水清洗后，再用8倍量的40%的乙醇溶液清洗3次，洗出液为提取液；滤液静置后分相，取下相，加入2倍量的乙醇使其沉淀，沉淀物加少量水溶解后，再加入2倍量的乙醇使其沉淀，得到的沉淀物为提取物；
将提取物超声分散在提取液中，真空干燥，得到虫草提取物。
对比例3
含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，包括：
将蛹虫草子实体于65℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛；
将10g的蛹虫草粉加入到200g的去离子水中，沸水加热2h，放冷后用8000r/min离心20min，过滤；滤渣再加入到200g去离子水中，水加热2h，放冷后用8000r/min离心20min，过滤；合并两次的滤液，得到粗提取液；
加入NKA-Ⅱ树脂10g，搅拌24h，过滤；树脂用去离子水清洗后，再用8倍量的40%的乙醇溶液清洗3次，洗出液为提取液；滤液静置后分相，加入2倍量的乙醇使其沉淀，沉淀物加少量水溶解后，再加入2倍量的乙醇使其沉淀，得到的沉淀物为提取物；
将提取物超声分散在提取液中，真空干燥，得到虫草提取物。
对比例4
将实施例1中的提取液烘干，配置成150mg/mL的溶液，采用葡聚糖凝胶G-10纯化，柱色谱的分离条件为：溶液浓度150mg/mL；单次上样量2mL，流速0.5mL/min，每管10min，最终得到虫草素纯品。将虫草素纯品作为虫草提取物。
对比例5
将实施例1中的提取液烘干，配置成150mg/mL的溶液，采用葡聚糖凝胶G-10纯化，柱色谱的分离条件为：溶液浓度150mg/mL；单次上样量2mL，流速0.5mL/min，每管10min，最终得到虫草素纯品。将虫草素纯品溶解，将实施例1中的提取物分散到虫草素溶液中，调整虫草素纯品的添加量，使得最终干燥得到的产物质量同实施例1中虫草提取物的质量相同。
实验例
检测实施例1~3及对比例1~5中的虫草提取物对白血病细胞株的半抑制浓度IC50。
购自中科院细胞库的白血病细胞株K562细胞株，用DMEM完全培养基在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每2天换液一次，培养3天左右1000r/min离心3min，去除上清液，用RPMI1640完全培养基稀释成2×104个/mL的悬浮液，加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL实施例1~3及对比例1~5中的虫草提取物，虫草提取物的浓度为20μg/mL，以20μLPBS作阴性对照。于37℃、含5%的CO2条件下培养3d后加20μLMTT溶液（5mg/mL的MTT）继续培养4h，终止培养，2000r/min离心6min，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10min使结晶物充分溶解。
表1 各实施方式对K562的半抑制浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从表1可以看出实施例1中的虫草提取物对K562半抑制浓度最低，表明其活性最高，对白血病细胞的抑制效果最佳。
实施例2的效果较差，这是由于培养基中未发芽的糙米含量过大，虫草发育不良，虫草素、虫草多糖等的含量也不高，进而对肿瘤细胞抑制效果也较差。
实施例3、4中采用的是培养基中糙米的含量不是很高或不含糙米，虫草素和虫草多糖的含量也较高，可以有效抑制肿瘤细胞的生长，但弱于实施例1，这可能与含有发芽糙米的培养基可以充分促进虫草生长有关，实施例1中的虫草素和虫草多糖的含量更高。
实施例5中只采用发芽糙米作为栽培培养基，效果也较差，虫草生长也较差，进而对肿瘤细胞抑制效果也较差，只有发芽糙米同其他杂粮联合才能有效的促进虫草生长。
对比例1中，提取方式同实施例1有较大的差别，对白血病细胞生长的抑制效果也较差，表明NKA-Ⅱ树脂可以有效的从粗提取液提取虫草素等物质。
对比例2中微波辅助提取的功率同实施例1有较大差别，发明人对微波辅助提取的条件进行了大量试验，发现实施例1中的提取条件可以增加提取物中虫草素和虫草多糖的含量。
对比例3中未采用双水相体系提取，仅采用树脂提取，树脂可以从水提液中提取出虫草素等物质，但提取出的虫草素含量不够高，虫草提取物中的杂质较多。
对比例4中的虫草提取物为纯化后的虫草素。实施例1中的虫草提取物中的虫草素含量高于其他实施例或对比例，但低于对比例4中虫草素含量。表明虫草素含量虽然可以有效抑制白血病细胞的生长，但是虫草素含量高到一定程度后，无法继续有效抑制白血病细胞的生长。
对比例5中用虫草素纯品溶液替代了实施例1中的提取液，虫草素的含量更高，但是对K562的抑制效果并不理想，甚至弱于虫草素纯品。因此实施例1中的虫草素、虫草多糖及提取液中的其他成分产生了一定的协同作用，可以更进一步的抑制K562细胞的生长。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (10)

1.含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的制备方法，其特征在于，包括：
将蛹虫草子实体于65℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛；
将10~20质量份的蛹虫草粉加入到400~500质量份的PEG/(NH4)2SO4双水相体系中，采用微波辅助提取，得到粗提取液；
加入NKA-Ⅱ树脂10~20质量份，搅拌12~24h，过滤；树脂用去离子水清洗后，再用5~10倍量的30~50%的乙醇溶液清洗2~4次，洗出液为提取液；滤液静置后分相，取下相，加入2~4倍量的乙醇使其沉淀，沉淀物即提取物；
将提取物超声分散在提取液中，真空干燥，得到虫草提取物。
2.根据权利要求1所述的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的制备方法，其特征在于，所述PEG/(NH4)2SO4双水相体系的制备方法为：
将35%的聚乙二醇6000、25%的(NH4)2SO4、18%的NaCl、22%的去离子水混合均匀，即得PEG/(NH4)2SO4双水相体系。
3.根据权利要求2所述的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的制备方法，其特征在于，所述沉淀物加少量水溶解后，再加入2倍量的乙醇使其沉淀，得到的沉淀物为提取物。
4.根据权利要求1所述的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的制备方法，其特征在于，所述微波辅助提取的提取温度为70~80℃，提取时间为60~80min，微波功率为200w。
5.根据权利要求1所述的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的制备方法，其特征在于，所述蛹虫草的培养方法为：
将菌株在室温下放置一周活化，接种到液体培养基上，20℃下培育7d后接种到栽培培养基，所述栽培培养基的接种量为6~10%。
6.根据权利要求1所述的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的制备方法，其特征在于，所述液体培养基包括：葡萄糖20~30质量份，蛋白胨8~15质量份，MgSO4 0.5~2质量份，KH2PO40.1~1质量份，VB1 0.05~0.1质量份，去离子水1000~1500质量份。
7.根据权利要求1所述的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的制备方法，其特征在于，所述栽培培养基为：燕麦仁2~8质量份，糙米8~15质量份，黄豆2~8质量份，莲子8~15质量份，葡萄糖0.5~1质量份，脱脂奶粉0.1~1质量份，去离子水45~50质量份。
8.根据权利要求1所述的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的制备方法，其特征在于，将菌株在室温下放置一周活化，取0.5×0.5cm2接种到液体培养基上。
9.含虫草素和虫草多糖的虫草提取物，其特征在于，根据权利要求1~8任一项所述的制备方法制备的含虫草素和虫草多糖的虫草提取物。
10.含虫草素和虫草多糖的虫草提取物的应用，其特征在于，在抑制肿瘤生长的制药应用。
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