CN101161325A - 常压加长两段层析柱系统及其在葛根素糖基化衍生物分离制备中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种常压加长两段层析柱系统及其在葛根素糖基化衍生物分离制备中的应用。所说的常压加长两段层析柱系统，是在一根普通层析柱后面，有一个可拆卸的外接加长层析柱，所说的外接加长层析柱，由柔性管材制成。利用该系统分离葛根素糖基化衍生物混合液，可有效地将葛根素与糖基葛根素相互分离，分离产物纯度达到90％以上，产品回收率达到80％以上。本发明提供的常压加长两段柱层析系统极大地增加了柱层析理论塔板数和分离效率，有效地解决了糖基化葛根素与葛根素的分离工艺，并且具有制作简单、成本低廉、实用性强的优点。

Description

常压加长两段层析柱系统及其在葛根素糖基化衍生物分离制备中的应用

技术领域

本发明涉及一种层析柱系统，具体是常压加长两段层析柱系统及其在葛根素糖基化衍生物分离制备中的应用。

背景技术

葛根素(puerarin)，4′，7-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮(8-C-β-D-Glucopyranosyl-7，4′-hydroxy-Isoflavone)(结构如式A)，临床上被广泛应用于心脑血管系统疾病(如心绞痛、心肌梗死、心律失常、冠心病、心力衰竭、椎-基底动脉供血不足、高黏血症、高血压、脑血栓、脑水肿等)、糖尿病、眼底疾病(如视网膜动脉栓塞、单纯性青光眼)、突发性耳聋、急性酒精中毒、拟菊酯类农药中毒及肿瘤的治疗。但存在如下缺点：1)体内消除速率快，临床使用剂量较大，口服生物利用度低；2)水溶解度低，注射制剂大多含有助溶剂以增加制剂的稳定性，但助溶剂的使用易产生一定的毒副作用，致使用药安全性降低。为了改善葛根素的水溶性，进而改善其药理活性、提高其生物利用度，我们利用氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans)CGMCC 1788所含糖基化酶对葛根素进行糖基化修饰，获得了葛根素-7-O-葡萄糖苷(结构如式B)。

葛根素-7-O-葡萄糖苷水溶性明显提高，在体内存留时间延长，血管舒张活性有所改善，有望开发成为新的葛根素药物。但葛根素经氧化微杆菌静息细胞转化后得到的转化液成分复杂，其中含有糖基化葛根素，葛根素，磷酸盐，蔗糖，菌体代谢产物等。特别是葛根素与糖基化葛根素结构相似，分离比较困难。采用现有的葛根素纯化常用的大孔吸附树脂普通层析柱层析法并不能有效地将转化产物与葛根素相分离。

发明内容

为了有效提高层析柱的分离因素和塔板数，本发明提供了一种常压加长两段层析柱系统，以有效增加层析柱的理论塔板数，结果显示大大提高了层析的分离效率，从而达到了从葛根素转化液中分离制备糖基化葛根素的目的。

本发明所述的常压加长两段层析柱系统，其特征在于，在普通层析柱的后面，有一个可拆卸的外接加长层析柱，所说的外接加长层析柱，由柔性管材制成。在使用时，采用普通湿法装柱法向普通层析柱和外接加长层析柱中分别装填预处理好的树脂。填充外接加长层析柱时，先将该柱从高处垂下使该柱伸展，分批装填树脂直到填满自然沉降压实，然后将外接加长层析柱盘旋起来备用。层析时，用平衡溶液将层析柱系统充分平衡后，将外接加长层析柱与普通层析柱分离，将含待分离物质的混合物溶液先流过普通层析柱进行吸附，然后用平衡溶液洗涤普通层析柱去除未吸附物质，将外接加长层析柱接到普通层析柱出口处，用洗脱液开始洗脱，分部收集洗脱液并检测，将相同洗脱峰的收集液合并。利用该法采用大孔吸附树脂分离葛根素糖基化衍生物混合液，用低浓度的乙醇梯度洗脱，可有效地将葛根素与糖基葛根素相互分离，分离产物纯度达到90％以上，产品回收率达到80％以上。

上述常压加长两段层析柱系统中，所说的外接加长层析柱是由一根柔性管材制成，其材质可以是聚乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯等各种塑料管，也可以是乳胶管，硅胶管，橡胶管等，但必须要有足够的柔软性，能够随意盘绕卷曲；其长度至少要达到与外接加长柱相连的普通层析柱的2倍以上，实际长度依据分离物质需要确定；其直径可与相连的普通层析柱相同，也可比相连的普通层析柱略粗或略细。

上述的常压加长两段柱层析系统在装填树脂时，需要将普通层析柱和外接加长层析柱分开，采用普通湿法装柱法分别向普通层析柱和外接加长层析柱填入预处理好的树脂；填充外接加长层析柱时，先将该柱从高处垂下使柱充分伸展，分批装填树脂直到填满自然沉降压实，然后将外接加长层析柱盘旋起来备用。

上述的常压加长两段柱层析系统所装填的树脂可以是极性或非极性吸附剂，如硅胶，氧化铝，大孔树脂，活性炭，硅藻土；可以是疏水性吸附剂，如Phenyl-Sepharose；可以是离子交换树脂，如amberlite系列离子交换树脂、dowex系列离子交换树脂、duolite系列离子交换树脂，asmit系列离子交换树脂、diaion系列离子交换树脂、ionac系列离子交换树脂、allassion系列离子交换树脂。

上述的常压加长两段柱层析系统在层析时，需要将外接加长层析柱与普通层析柱分离，将含待分离物质的混合物溶液先流过普通层析柱进行吸附，接着用平衡溶液洗涤普通层析柱去除未吸附物质后，再将外接加长层析柱接到普通层析柱出口处，进行洗脱分部收集。

上述的常压加长两段柱层析系统用于分离葛根素糖基化衍生物混合液时，向普通层析柱和外接加长层析柱内所装填的树脂是大孔树脂，平衡溶液是双蒸水，洗脱溶液是5-30％的乙醇溶液，或由0-15％乙醇与20-35％乙醇组成的乙醇梯度浓度溶液。

本发明提供的常压加长两段柱层析系统极大地增加了柱层析理论塔板数和分离效率，有效地解决了糖基化葛根素与葛根素的分离工艺，并且具有制作简单、成本低廉、实用性强的优点。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1.常压加长两段柱层析系统示意图。其中1、普通层析柱；2、外接加长层析柱。

图2葛根素糖基化衍生物层析图谱(A)普通层析柱，(B)常压加长两段层析柱系统

图3.HPLC分析图谱，(A)葛根素转化液，稀释20倍。(B)峰I层析收集液。(C)峰II层析收集液。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：如图1，采用一根玻璃层析柱(50cm×2.5cm I.D)作为普通层析柱1，外接加长层析柱2由一根长8米直径1.5厘米的聚氯乙烯塑料软管制成。将先后用1mol的盐酸、1mol的氢氧化钠、50％的乙醇、95％的乙醇处理过的AB-8型大孔树脂浸泡在水中，进行装柱。将普通层析柱与外接加长层析柱分别装柱。普通层析柱的填充采用常规湿法装柱法即可。外接加长层析柱填装时，先将外接加长层析柱从高处垂下来，使外接加长层析柱伸展，装满与普通层析柱相同的AB-8型大孔树脂。然后使该柱继续悬挂3小时，并使水不停地流过该柱，使树脂压实后，再次补满树脂。然后将外接加长层析柱取下盘旋起来放到合适的地方。依次用细管将以下装置连接：梯度混合仪，蠕动泵，普通层析柱，外接加长层析柱，紫外检测器，自动部分收集器。

用2000mL水流过该装置，然后将普通层析柱与外接加长层析柱分开，将200ml葛根素转化液(其葛根异黄酮总浓度约为5mg/ml)经过滤纸过滤后，流过普通层析柱，流速1.5mlmin^-1。然后用2000mL水流过普通层析柱，流速1.5ml min^-1，此时将普通层析柱与外接加长层析柱相连。用10％-25％乙醇线型梯度洗脱，75小时后换成30％乙醇继续洗脱直到110小时，1.5ml min^-1流速。流出液用紫外检测仪254nm波长下检测并记录(图2B.)。流出液用自动部分收集器收集。洗脱完成后合并相同分离峰组分。其中峰I收集了1215ml，峰II收集了1575ml。用HPLC检测每个收集峰和初始混合液，并与标准曲线比对得到如下结果：其中峰I为糖基化葛根素，其纯度97.9％浓度为373μg ml^-1，回收率88.1％。峰II为葛根素，其纯度为98.7％，浓度为246μg ml^-1，回收率为87.0％，(图3)。同时我们也用普通层析柱做了对照实验，其分离情况见图2A。

实施例2.加长两段层析柱系统连接及装柱方法同实施例1。用2000ml水流过该装置，然后将普通层析柱与外接加长层析柱分开，将200ml葛根素转化液(其葛根异黄酮总浓度约为5mg/ml)经过滤纸过滤后，流过普通层析柱，流速2ml min^-1。然后用2000mL水流过普通层析柱，流速2ml min^-1，此时将普通层析柱与外接加长层析柱相连。用20％乙醇洗脱，2mlmin^-1流速。流出液用紫外检测仪254nm波长下检测并记录。流出液用自动部分收集器收集。洗脱完成后合并相同分离峰组分。用HPLC检测每个收集峰和初始混合液，并与标准曲线比对得到如下结果：糖基化葛根素，其纯度96.6％，回收率86％。葛根素，其纯度为99.1％，回收率为92％。

实施例3.采用一根玻璃层析柱(75cm×3.5cm I.D)作为普通层析柱，外接加长层析柱由一根长10米，直径2.4厘米的塑料软管制成。层析柱的填充及层析柱系统的连接方法同实施例1。用5升左右水流过该装置，然后将普通层析柱与外接加长层析柱分开，将600ml葛根素转化液(其葛根异黄酮总浓度约为5mg/ml)经过滤纸过滤后，流过普通层析柱，流速约5ml min^-1。然后用约5升水流过普通层析柱，流速约5ml min^-1，此时将普通层析柱与外接加长层析柱相连。用20％乙醇洗脱，5ml min^-1流速。流出液用紫外检测仪254nm波长下检测并记录。流出液用自动部分收集器收集。洗脱完成后合并相同分离峰组分，可达到以下分离结果：糖基化葛根素，其纯度可达90.2％，回收率约为85％。葛根素，其纯度可达90.6％，回收率约为86％。

本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。

Claims (5)

1.一种常压加长两段层析柱系统，其特征在于，在一根普通层析柱的后面，有一个可拆卸的外接加长层析柱，所说的外接加长层析柱，由柔性管材制成。

2.根据权利要求1所说的常压加长两段层析柱系统，其特征在于，所说的柔性管材是塑料管、乳胶管、硅胶管或橡胶管。

3.根据权利要求1所说的常压加长两段层析柱系统，其特征在于，所说的外接加长层析柱的长度是普通层析柱的2倍以上。

4.权利要求1所说的常压加长两段层析柱系统在葛根素糖基化衍生物分离制备中的应用。

5.权利要求4所说的应用，具体是：在普通层析柱和外接加长层析柱内装填大孔树脂，用适量水平衡常压加长两段层析柱系统，然后将普通层析柱与外接加长层析柱分开；将过滤后的葛根素转化液流过普通层析柱使所含葛根素及其糖基化衍生物吸附到树脂柱上；用适量水流过普通层析柱洗去未吸附的杂质；然后将普通层析柱与外接加长层析柱相连，用5-30％的乙醇溶液或由1-15％乙醇与20-35％乙醇组成的乙醇梯度浓度溶液洗脱；流出液分部收集检测，合并相同洗脱峰组分。分离产物糖基葛根素纯度达到90％以上，产品回收率达到80％以上。

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