CN102943048A

CN102943048A - 高含油量小环藻突变株及其筛选和培养方法

Info

Publication number: CN102943048A
Application number: CN2012105059017A
Authority: CN
Inventors: 黄迎春; 赵进东; 赵驰
Original assignee: College of Biochemical Engineering of Beijing Union University
Current assignee: College of Biochemical Engineering of Beijing Union University
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2032-11-30
Also published as: CN102943048B

Abstract

本发明提供了一种高含油量小环藻突变株Cyclotella menghiniana，其特征在于，它保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年9月5日，保藏编号为CGMCC No.6448。本发明还提供了一种高含油量小环藻突变株的筛选及培养方法。本发明筛选、检测过程中简单，耗时少，易于发现富含油脂的硅藻突变体，可用于筛选各种海水和淡水微藻的富油藻种以及通过各种诱变技术（紫外诱变、化学诱变、激光诱变等）诱变获得的富油微藻突变体。

Description

高含油量小环藻突变株及其筛选和培养方法

技术领域

本发明涉及微藻生物能源领域，具体地说，涉及一种利用超声波诱变产生的高含油量微藻，以及利用超声波诱变筛选该微藻的方法及其培养方法。

背景技术

由于地球上的化石能源储量正日益减少，石油资源很有可能会在短时间内便迅速枯竭。化石能源的蕴藏量并不是无穷无尽的，易于开采和利用的化石能源储量已经所剩无几，剩余储量因为开发难度越来越大，从而失去继续开采的价值。在世界能源消费以石油为主导的情况下，如果能源消费结构仍不变化，那么就会发生新一代的能源危机。煤炭资源虽比石油资源储存量要大，但也不是取之不尽用之不竭的。目前除了煤炭之外，能够大规模利用开发的能源还是很少。虽然太阳能的资源是取之不竭源源不断的，但因其开发利用所耗成本高昂，所以在短时间内仍不可能迅速发展得到广泛应用。

因此人类必须及时找到一种可以代替非再生矿物能源的新能源，从而将注意力转移到新的能源结构上，尽早探索、研究开发利用新能源资源，这样才能让人类的生活在安定和谐的情况下持续发展下去，而生物柴油正好可以将此问题解决。像生物柴油这种可再生的碳中性能源，有利于环境和经济的可持续发展。目前的研究也表明了微藻是能够完全替代化石柴油的唯一生物柴油。生物柴油和化石燃料本质上都来源于光合作用产物。绿色植物进行光合作用,将水、二氧化碳和其他无机物依靠光能合成各种有机物并释放出氧气,动物和微生物才能生长繁殖。各种生物的油脂都是从植物合成的有机物转化来的。任何形式的来自动物、植物和微生物的脂肪酸都能用作生物柴油的原料。因此,油脂含量高的藻种才是制备生物柴油的最重要原料。

利用微藻加工制备生物柴油的关键，一是提高原始藻种的油脂含量，二是通过优化培养尽可能提高微藻细胞的油脂含量。在单细胞微藻的培养过程中,培养基成分、温度、光照强度、pH、培养方式、通气量、盐度等均会影响微藻的生长以及其脂肪酸的含量与组成。温度、光强能影响微藻的光合作用和呼吸作用，从而对其生长及体内生化成分产生影响。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种高含油量微藻突变株，同时提供一种高含油量微藻的筛选方法及培养方法，从而提供一种能够高效获取生物柴油的方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种高含油量小环藻突变株（建议的分类命名为Cyclotella menghiniana），其特征在于，它保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年9月5日，保藏编号为CGMCC No.6448。

一种高含油量小环藻突变株的筛选及培养方法，其特征在于，步骤如下：

a.取对数生长期的小环藻藻液，稀释至10⁴个细胞/mL，在音频70KHz条件下，处理300~450s进行诱变；

b.将诱变后的藻液涂于D1固体培养基上，培养15天后挑取成活的藻落，分别接种于新鲜的D1固体培养基，在24℃、光暗培养时间比14：10、光照培养时光照强度2500lex的条件下继续培养15天；

c.将各藻落进行编号，并依次取少量藻体分别加入100μL的D1液体培养液中；

d.向步骤c得到的各藻液中分别加入0.l mg/mL尼罗红染料0.1μL，静置10min后，利用荧光显微镜观察各藻液中的油脂含量；

e.取油脂含量高的藻株培养在D1液体培养基中大量繁殖，在细胞浓度达到5×10⁶个/mL时，置换新鲜的D1液体培养基，培养5天，然后用油脂富集培养基继续培养60小时，所述的油脂富集培养基为D1液体培养基的配方中去掉氮元素和/或硅元素得到的培养基。

如上所述的方法，优选地，步骤a中所述的诱变时间为350s。

如上所述的方法，优选地，所述的油脂富集培养基为D1液体培养基的配方中去掉NaNO₃和Co(NO₃)₂·6H₂O得到的培养基。

如上所述的方法，优选地，所述的油脂富集培养基为D1液体培养基的配方中去掉NaSiO₃·9H₂O得到的培养基。

如上所述的方法，优选地，所述的油脂富集培养基为D1液体培养基的配方中去掉NaNO₃、Co(NO₃)₂·6H₂O和NaSiO₃·9H₂O得到的培养基。

所述的D1液体培养基的配方为：

试剂名称	工作浓度	母液浓度
			NaNO₃	1mL/L	12g/100mL dH₂O
K₂HPO₄	1mL/L	4g/100mL dH₂O
			MgSO₄·7H₂O	1mL/L	7g/100mL dH₂O
CaCl₂·2H₂O	1mL/L	2g/100mL dH₂O

[0020]

KH₂PO₄	1mL/L	8g/100mL dH₂O
			NaSiO₃·9H₂O	1mL/L	10g/100mL dH₂O
MnSO₄	0.1mL/L	0.2g/100mL dH₂O
			柠檬酸铁	1mL/L	0.5g/100mL dH₂O
H₃BO₃	1mL/L	2.86g/L dH₂O
			MnCl₄.H₂O	1mL/L	1.86g/L dH₂O
ZnSO₄.7H₂O	1mL/L	0.22g/L dH₂O
			NaMoO₄.2H₂O	1mL/L	0.39g/L dH₂O
CuSO₄.5H₂O	1mL/L	0.08g/L dH₂O
			Co(NO₃)₂.6H₂O	1mL/L	0.05g/L dH₂O

所述的D1固体培养基的配方为上述D1液体培养基中加入15-20wt%的琼脂。

本发明的有益效果为：

本发明通过对小环藻进行超声波诱变、筛选得到一种富油脂突变株，并提供了一种高含油量微藻突变株的筛选方法。该方法在筛选、检测过程中操作简单，耗时少，能实现高通量筛选，大大提高筛选的工作效率，减少工艺过程中对原材料浪费，对环境友好。该方法筛选所得突变株含油量高，具有良好的生物柴油开发前景。

附图说明

图1为本发明测定的小环藻（Cyclotella sp.）的超声波致死曲线。

图2为不同培养条件下硅藻含油量的统计图。

图3为尼罗红染色后鉴定油脂的小环藻细胞照片，其中图3a和3b分别展示了采用相差显微镜和荧光显微镜观察诱变前的细胞的情形；图3c和3d分别展示了采用相差显微镜和荧光显微镜观察诱变后富油细胞的情形。

以下结合实施例为本发明作进一步详细的描述。

具体实施方式

本发明提供的高含油量小环藻突变株，它保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年9月5日，保藏编号为CGMCCNo.6448。

本发明提供了一种高含油量小环藻突变株的筛选及培养方法，其具体操作如下：

a.用不同时间（0~500s范围内）超声波处理小环藻细胞后，在显微镜下观察，存活细胞数目随着处理时间的延长而降低。将经过处理后的小环藻液涂平板观察并统计其死亡率，没有处理的藻液涂平板作为阳性对照，得到如图1所示的超声波致死曲线。如图1所示，超声波处理对小环藻（Cyclotella sp.）细胞有致死作用，其半数致死剂量约为210s。

b.取对数生长期的小环藻FACHB-1031藻液，稀释至10⁴个/mL后分组，在音频70KHz条件下，分别处理300s、350s、400s和450s进行诱变。

c.将诱变后的藻液均匀的涂于含D1固体培养基的平皿上，置于25℃培养室中，按照光照与暗培养的时间比为14：10培养15天，挑取诱变株并分别接种于新的含D1固体培养基的平皿上，置于25℃培养室中，继续按照光暗培养时间比14：10培养15天。光照培养时的光照强度为2500lex。

d.将各藻落进行编号，并依次用牙签按顺序刮取少量藻苔加入100μL D1培养液中。

e.向步骤d得到的藻液中加入0.lmg/mL尼罗红染料0.1μL，静置10min后，利用荧光显微镜观察突变藻株的油脂含量。

以其中一株典型的诱变后含油量明显升高的藻体为例，该藻株诱变时间为350s，其诱变前后的显微镜下照片如图3所示。图3a和b分别展示了采用相差显微镜和荧光显微镜观察诱变前的细胞的情形；图3c和d分别展示了采用相差显微镜和荧光显微镜观察诱变后富油细胞的情形。其中在荧光显微镜下，发金黄色荧光的颗粒为中性油脂体（参见申请日同时提交的供参考用的彩图）。

f.取油脂含量高的藻株培养在D1培养液中大量繁殖，在细胞浓度达到5*10⁶个/mL时，置换新鲜的D1培养基培养5天，然后用四种不同的培养基继续培养60小时。

所述四种培养基分别是：

基本培养基：D1培养基；

培养基A：D1培养基的配方中去掉NaNO₃和Co(NO₃)₂·6H₂O；

培养基B：D1培养基的配方中去掉NaSiO₃·9H₂O；

培养基C：D1培养基的配方中去掉NaNO₃，Co(NO₃)₂·6H₂O，NaSiO₃·9H₂O

g.测定细胞的干重，取约100mL（V）藻液经预称重（W₁）的醋酸纤维膜（Φ0.45μm），过滤、洗涤，于真空烘箱中于50℃干燥8小时，称重（W₂），培养液细胞浓度干重（DW，单位g/L）的计算公式为：

DW = \frac{W_{2} - W_{1}}{V}

h.细胞总脂含量测定，将藻体称重后用体积比40/10/20的氯仿/水/甲醇混合溶液浸泡，并超声1小时，将溶液转入250mL分液漏斗中，将下层有机相分离，水相再分别用50mL氯仿，50mL+20mL氯仿/甲醇，50mL氯仿萃取三次，合并有机相。将溶剂减压蒸干，得到暗绿色残余油状物。

i.细胞极性脂和中性脂分离及含量测定：将固体用硅胶色谱柱进行分离，其中中性脂用氯仿洗脱，极性脂用甲醇洗脱。将氯仿和甲醇洗脱液分别减压旋蒸干，并减压下烘干5小时。将所得中性、极性脂物质称重。

结果显示：

（1）突变株经过固体D1培养基上培养置于置于25℃培养室中，光暗培养时间比为14：10，培养25天，之后通过观察其油脂含量筛选高含油藻株，是一种操作简单且有效节约时间的方法。

（2）诱变时间在300~450s之间，均可较为有效地产生高含油藻株，同时可以保证不会产生过多的藻体死亡导致诱变失败。

（3）通过改变培养条件可以大大提高细胞中油脂的含量，尤其是中性脂的含量大大提高。如图2的统计图所示，在基本培养基（即D1培养基）中，总油脂的含量为42.71%，中性脂含28.38%；培养基A中，总油脂的含量为92.56%，中性脂含量达到59.23%，培养基B中，总油脂的含量为92.04%，中性脂含量达到59.24%；培养基C中，总油脂的含量为97.15%，中性脂含量达到64.41%。说明细胞中油脂的含量可以通过改变培养条件而大大提高，在同时去除D1培养基中的氮元素和硅元素时，藻体的产油量最高。

发明人已将采用上述方法得到的高含油量小环藻突变株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址在朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年9月5日，保藏编号为CGMCC No6448。

Claims

1.一种高含油量小环藻突变株，其特征在于，它保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年9月5日，保藏编号为CGMCC No.6448。

2.一种高含油量小环藻突变株的筛选及培养方法，其特征在于，步骤如下：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的诱变时间为350s。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的油脂富集培养基为D1液体培养基的配方中去掉NaNO₃和Co(NO₃)₂·6H₂O得到的培养基。

5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的油脂富集培养基为D1液体培养基的配方中去掉NaSiO₃·9H₂O得到的培养基。

6.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的油脂富集培养基为D1液体培养基的配方中去掉NaNO₃、Co(NO₃)₂·6H₂O和NaSiO₃·9H₂O得到的培养基。