CN106434353A - 一种微藻的培养方法及其应用 - Google Patents

一种微藻的培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种微藻的培养方法及其应用，通过在微藻的培养过程中，去除废水中的钴离子及氮和磷。本发明的微藻培养方法为在贴壁培养装置中接种微藻，通入CO2气体、光照以及含有培养液的废水，废水来自工业废水，富含大量的金属离子钴以及氮和磷。本发明培养的微藻可作为汽油、柴油和航空燃料的原料。通过本发明提供的微藻培养方法，不仅能够去除废水中的钴离子及氮和磷，在一定高钴浓度下，微藻的油脂产量也得到了相应的提高。本发明为废水中金属离子的去除、微藻生物燃料的产业化提供了一种可行的新技术。

Description

一种微藻的培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及环境工程及生物能源技术领域，尤其涉及一种微藻的培养方法及其应用。
背景技术
随着能源消耗的日益增长，石油、煤炭等不可再生资源的耗竭，以及全球环境气候恶化的加剧，能源、资源与环境问题已成为影响人类社会可持续健康发展的首要因素，开发利用“绿色”可再生资源作为燃料变得极为迫切与重要。理想的化石能源替代品需要具备高能量密度、低吸湿性、低挥发性、可再生性及与现存发动机设备和运输设施相兼容等特性。从生物能源替代化石能源的角度，烃类燃料比脂肪酸甲酯更接近于传统化石燃料，而且烃类燃烧后产热值高，对大气CO2含量无净增加，是一种非常有潜力的可再生能源。微藻因其光合效率高、相对含油量高、固碳效率高及综合利用价值高等优势，被认为是最具发展潜力的生物质资源之一。
除了传统能源面临枯竭，水体污染也严重威胁着社会的发展与人类的健康，金属污染因其危害大、治理难等特点成为工业废水治理过程中的一大难题。2015年新实施的环保法明确指出在进行农业生产用水灌溉时，应当采取措施，防止重金属和其他有毒有害物质污染环境，因此治理工业废水中的金属污染问题成为净化废水的关键。钴(Co2+)是我国比较稀缺的矿产资源之一，然而随着科技的进步和人类生活环境的恶化，以及核技术的开发利用，钴污染也随之而来。当钴离子浓度较高时会对植物产生毒害作用，危害人类健康。目前对于废水中Co2+的去除比较常见的方法是物理-化学技术，如化学沉淀、溶剂萃取、离子交换及膜分离等去除废水中的金属，这些技术由于金属去除不完全、昂贵的设备及大量的试剂和能量需求等原因而难以应用。
专家提倡通过微藻培养，不仅可以净化环境污水，还能产生生物燃料，解决传统能源枯竭引发的危机。以藻类净化为首的生物学方法，可克服传统的物理-化学方法缺陷成为金属废水污染净化或恢复的研究热点。然而，前人研究表明通过传统的液体悬浮培养藻类净化金属废水，藻细胞的生长受到抑制，生物产率较低。如公开号为CN 103305425A的中国发明专利申请公开了一种通过光照调节提高布朗葡萄藻烃产量的方法，该方法是通过在布朗葡萄藻生长过程中，根据布朗葡萄藻的浓度逐步增加光强，避免在布朗葡萄藻浓度较低时过高光强对细胞造成损伤，维持光照在适宜布朗葡萄藻细胞生长的条件，使得生物量迅速积累，至细胞生长到对数期后期时，调整光照至较高的水平，在适宜烃合成的条件下继续培养，使得细胞在此阶段大量积累烃类物质以及其他脂质。但该方法只能提高布朗葡萄藻的烃产量，不能解决水体污染问题。
微藻在培养过程中需要消耗培养液、营养盐及CO2等，因此导致微藻生物能源的成本居高不下。另外一方面，也有研究人员通过传统的液体悬浮培养方式用经过二次处理的生活污水培养微藻，结果发现生活污水中的氮和磷含量减小，同时有毒重金属元素砷、铬、镉等的浓度有所降低，但遗憾的是微藻生物产率很低，经济效益不佳，很难产业化推广应用。
因此，亟需寻找一种微藻培养方法，通过该方法不仅能够解决传统能源危机对人类带来的不便，还能解决水体污染对人类带来的健康影响。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种微藻的培养方法，该方法是在贴壁培养装置中接种微藻，通入CO2气体、光照以及含有培养液的废水，所述的培养液的配方为：
KNO3 0.1～0.6g/L MgSO4.7H2O 0.1～0.5g/L
CaCl2.2H2O 0.02～0.08g/L Na2EDTA 0.01～0.03g/L
K2HPO4 0.04～0.07g/L H3BO3 2.1～2.9mg/L
MnSO4.H2O 1.1～1.8mg/L ZnSO4.7H2O 0.1～0.4mg/L
Na2MoO4.2H2O 0.03～0.08mg/L CuSO4.5H2O 0.5～1.0mg/L
Co(NO3)2.6H2O 0.09mg/L
优选地，所述培养液的配方为：
KNO3 0.3～0.5g/L MgSO4.7H2O 0.2～0.4g/L
CaCl2.2H2O 0.03～0.06g/L Na2EDTA 0.01～0.02g/L
K2HPO4 0.04～0.06g/L H3BO3 2.3～2.7mg/L
MnSO4.H2O 1.3～1.6mg/L ZnSO4.7H2O 0.1～0.3mg/L
Na2MoO4.2H2O 0.04～0.06mg/L CuSO4.5H2O 0.6～0.8mg/L
Co(NO3)2.6H2O 0.09mg/L
其中，所述的废水来自工业废水。
其中，所述的废水中含有大量的金属离子钴以及氮和磷。
其中，所述的废水中，钴的浓度为0.1～50mg/L，氮的浓度为50～400mg/L，磷的浓度为20～100mg/L。
优选地，钴的浓度为0.5～10mg/L，氮的浓度为100～300mg/L，磷的浓度为40～80mg/L。
进一步优选地，
钴的浓度为1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L，5mg/L，6mg/L，7mg/L，8mg/L，9mg/L；
氮的浓度为120mg/L，150mg/L，180mg/L，200mg/L，250mg/L，280mg/L；
磷的浓度为50mg/L，55mg/L，60mg/L，65mg/L，70mg/L，75mg/L。
其中，所述的微藻选自布朗葡萄藻、海绿球藻、纤细角毛藻、间囊藻和菱形藻中的一种或任意几种的组合。
其中，所述微藻的培养条件为：
CO2的浓度为0.5％～3％；
光照时间为12～24h；
光照强度为80-120μmolm-2s-1；
培养的温度为18～28℃；
培养的时间为6～12d。
优选地，所述微藻的培养条件为：
CO2的浓度为1％～2％；
光照时间为20～24h；
光照强度为95-110μmolm-2s-1；
培养的温度为20～28℃；
培养的时间为6～8d。
本发明第二方面提供了一种利用微藻处理废水的方法，该方法通过在上述微藻的培养过程中可去除废水中的金属钴离子、氮和磷。
本发明第三方面提供了一种从上述微藻培养方法中培养得到的微藻的用途，可作为汽油、柴油和航空燃料的原料。
本发明的有益效果：
本发明提供的微藻生物膜贴壁培养是根据光稀释与固定化的原理，将藻细胞与培养基相分离，并固定在一定的生物膜材料上，极少量的培养基液体通过附着多孔材料的背面或内部滴入以使藻细胞处于半干湿润状态，并在一定光照强度与CO2浓度下进行生长的培养方式，其在培养过程中的取样和培养后的采收均比传统液体悬浮培养更为经济、简便。本发明提供的微藻培养方法能够有效去除废水中的钴离子以及氮和磷，尤其是在一定范围内随着钴离子浓度的增加，微藻的油脂产量也随之增加，尤其是布朗葡萄藻中长链烃的比例有所提高，为汽油、柴油以及航空燃料提供了更优的生物原料。
附图说明
图1A为本发明实施例1提供的葡萄藻在不同钴浓度的培养液中生物量积累效果示意图；
图1B为本发明实施例1提供的葡萄藻在不同钴浓度的培养液中生物产率变化效果示意图；
图2A为本发明实施例1提供的葡萄藻在正常钴浓度(0.09mg/L)与钴富余(4.50mg/L)的培养液中粗烃含量积累效果示意图；
图2B为本发明实施例1提供的葡萄藻在正常钴浓度(0.09mg/L)与钴富余(4.50mg/L)的培养液中粗烃产率变化效果示意图；
图3A为本发明实施例1提供的葡萄藻在正常钴浓度(0.09mg/L)与钴富余(4.50mg/L)的培养液中Co2+浓度变化效果示意图；
图3B为本发明实施例1提供的葡萄藻在正常钴浓度(0.09mg/L)与钴富余(4.50mg/L)的培养液中N浓度变化效果示意图；
图4为本发明实施例1提供的葡萄藻在正常钴浓度(0.09mg/L)与钴富余(4.50mg/L)的培养液中烃构架分布效果示意图。
具体实施方式
以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
本实施例采用的微藻为布朗葡萄藻(Botryococcus braunii SAG807-1)，购买于德国哥廷根大学，采用的培养液为Chu13培养基。Chu13培养基培养液的组成和配制参见表1，在配制培养液时，将以下成分以固体形式加入蒸馏水中配成100～1000倍的母液，使用时再按需稀释配制成培养液，然后将Chu13培养基分装封口，灭菌处理，最后取出灭菌处理后的培养基，冷却至室温后，待用。
表1Chu 13培养基的组成及其含量
成分 储液浓度 使用时终浓度
KNO3 150g/L 0.2g/L
MgSO4.7H2O 75.0g/L 0.1g/L
CaCl2.2H2O 36.0g/L 0.04g/L
Na2EDTA 1.0g/L 0.01g/L
K2HPO4 40.0g/L 0.052g/L
H3BO3 2.86g/L 0.00286g/L
MnSO4.H2O 1.54g/L 0.00154g/L
ZnSO4.7H2O 0.22g/L 0.00022g/L
Na2MoO4.2H2O 0.06g/L 0.00006g/L
CuSO4.5H2O 0.08g/L 0.0008g/L
Co(NO3)2.6H2O 0.09g/L 0.0009g/L
1、葡萄藻在不同Co2+浓度中的生长情况
取在正常Chu13培养基液体培养至对数期的葡萄藻为藻种，将葡萄藻细胞与培养基相分离，并固定在0.45μm的醋酸纤维膜材料上，极少量的培养基液体通过附着在滤纸的背面或内部滴入以使藻细胞处于半干湿润状态。采用Chu13作为培养基液，分别配制6组Co2+浓度不同的培养液，Co2+的浓度分别为0.09mg/L，0.18mg/L，0.45mg/L，0.90mg/L，4.50mg/L，45.00mg/L，在温度为25℃、光照强度为100μmolm-2s-1、CO2浓度为1％的条件下分别进行培养，在培养第0d，2d，4d，6d，8d分别对葡萄藻的生物产量及生物产率进行检测，发现当Co2+浓度在0.09mg/L～4.50mg/L之间，随着培养时间的延长，葡萄藻的生物量呈现了线性增长，生物产率稍微有所升高，但增幅不是很明显；当Co2+浓度为45.00mg/L时，随着培养时间的延长，葡萄藻的生物量没有明显变化，生物产率有所下降，具体见图1A和图1B。通过该实验结果可以说明，当Co2+浓度小于4.50mg/L时，本发明提供的葡萄藻培养方法能够有效去除水体中的Co2+。
2、葡萄藻在正常培养液(Co2+浓度为0.09mg/L)与钴富余的培养液(Co2+浓度为4.50mg/L)中的粗烃产量情况
采用正常Chu13培养液(Co2+浓度为0.09mg/L)与Co2+浓度为4.50mg/L的Chu13培养液进行对比实验，在温度为25℃、光照强度为100μmolm-2s-1、CO2浓度为1％的条件下分别进行培养，在培养第0d，2d，4d，6d，8d分别对葡萄藻的粗烃含量及粗烃产率进行检测，发现随着时间的延长，Chu13正常培养液(Co2+浓度为0.09mg/L)与钴富余(Co2+浓度为4.50mg/L)的Chu13培养液中培养得到的葡萄藻粗烃含量及粗烃产率均随时间的延长而增长，在钴富余的培养液中，粗烃含量高于正常培养液中的粗烃含量，粗烃产率变化相差不大，具体见图2A和图2B。通过实验结果可以说明，本发明提供的葡萄藻的培养方法能够有效去除水体中高浓度的Co2+，对粗烃含量不仅没有影响，还有明显的提高。
3、葡萄藻在正常培养液(Co2+浓度为0.09mg/L)与钴富余的培养液(Co2+浓度为4.50mg/L)中的Co2+、N含量的情况
采用正常Chu13培养液(Co2+浓度为0.09mg/L)与Co2+浓度为4.50mg/L的Chu13培养液进行对比实验，在温度为25℃、光照强度为100μmolm-2s-1、CO2浓度为1％的条件下分别进行培养，在培养第0d，2d，4d，6d，8d分别对葡萄藻的粗烃含量及粗烃产率进行检测，发现随着时间的延长，在正常培养液中的Co2+浓度没有明显变化，在钴富余培养液中，Co2+浓度有明显的下降；N元素的浓度在正常培养液和钴富余的培养液中随着时间的延长都有所下降，具体见图3A和图3B。通过实验结果可以说明，本发明提供的葡萄藻的培养方法能够有效的去除水体中的Co2+和N元素。
4、葡萄藻在正常培养液(Co2+浓度为0.09mg/L)与钴富余的培养液(Co2+浓度为4.50mg/L)中的烃构架分布情况
采用正常Chu13培养液(Co2+浓度为0.09mg/L)与Co2+浓度为4.50mg/L的Chu13培养液进行对比实验，在温度为25℃、光照强度为100μmolm-2s-1、CO2浓度为1％的条件下分别进行培养，通过检测发现，本发明提供的葡萄藻的培养方法，能够产生的烃种类主要有C27、C29和C31，在钴富余的培养液中得到的C27和C29产量跟正常培养液中没有明显变化，但C31有所上升。通过实验结果可以说明，本发明提供的葡萄藻的培养方法在去除水体中富余的Co2+时，烃的产量也没有明显降低，其中长链烃C31的产量还有所提高。
5、烃的提取
将上述培养得到的布朗葡萄藻溶液于8000r/min离心8min，洗涤离心3次后收集藻体，然后进行冷冻干燥。称取一定质量的干燥藻粉，加入正己烷超声15min，5000r/min离心10min后，收集正己烷提取液，提取过程重复3-4次，直到提取液无色，合并正己烷提取液，25℃水浴下旋转蒸发掉正己烷，室温下用氮气吹干所剩残余，称其重量即为“粗烃”质量，计算后得到粗烃含量。本发明涉及到的“烃”为“粗烃”。粗烃经硅胶柱(硅胶粒度200～300目，层析柱尺寸10×100mm，正己烷为流动相)纯化，收集黄色条带出来之前的所有样品，25℃旋转蒸发掉正己烷，氮气吹干所剩残余，称重得到“纯烃”质量，计算后得到纯烃含量。然后硅胶柱分别用氯仿和甲醇进行洗脱，分别收集洗脱后的样品，旋转蒸发、氮气吹干，称重，即得非极性脂肪酸和极性脂肪酸含量。
本实施例提供的葡萄藻在4.5mg/L Co2+浓度下贴壁培养，培养8d后，葡萄藻生物产量可达5.4gm-2d-1，而培养基中约85％的Co2+被去除。葡萄藻贴壁培养Co2+的结合能力为1473.9μmol g-1，培养基中N浓度也从最初的1.98mM降到约0。葡萄藻所产生的烃类(油脂)含量要高于正常Chu 13培养基的量，分别是52.9％、43.2％；4.5mg/L Co2+浓度贴壁培养促进了烃类的合成；通过GC-MS分析，4.5mg/L Co2+主要促进了长链烃类C31的合成，相比于正常Chu 13培养基下的C31含量提高了9.6％。
以上实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种微藻的培养方法，其特征在于：在贴壁培养装置中接种微藻，通入CO2气体、光照以及含有培养液的废水，所述的培养液的配方为：
2.根据权利要求1所述的微藻的培养方法，其特征在于：所述的培养液的配方为：
3.根据权利要求1所述的微藻的培养方法，其特征在于：所述的废水来自工业废水。
4.根据权利要求3所述的微藻的培养方法，其特征在于：所述的废水中含有大量的金属离子钴以及氮和磷。
5.根据权利要求4所述的微藻的培养方法，其特征在于：所述的废水中，钴的浓度为0.1～50mg/L，氮的浓度为50～400mg/L，磷的浓度为20～100mg/L。
6.根据权利要求4所述的微藻的培养方法，其特征在于：所述的废水中，钴的浓度为0.5～10mg/L，氮的浓度为100～300mg/L，磷的浓度为40～80mg/L。
7.根据权利要求1所述的微藻的培养方法，其特征在于：所述的微藻选自布朗葡萄藻、海绿球藻、纤细角毛藻、间囊藻和菱形藻中的一种或任意几种的组合。
8.根据权利要求1所述的微藻的培养方法，其特征在于，所述微藻的培养条件为：
CO2的浓度为0.5％～3％；
光照时间为12～24h；
光照强度为80-120μmolm-2s-1；
培养的温度为18～28℃；
培养的时间为6～12d。
9.根据权利要求1～8中任意一项权利要求所述的微藻的培养方法，其特征在于：所述的微藻在培养过程中可去除废水中的金属钴离子、氮和磷。
10.根据权利要求1～8所述的微藻的培养方法培养得到的微藻，其特征在于：所述的微藻可作为汽油、柴油和航空燃料的原料。
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