CN104830693A - 一种营养切换培养产油微藻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培养产油微藻的方法，对数生长期的产油微藻接种到含有有机碳源的培养基中，在光照与无光照交替循环的环境下进行培养，培养至平台期。此方法在光照与无光照交替循环的环境下进行培养，保证了生物质和脂质产量的同时又兼顾了其固定二氧化碳的重要作用并大大缩短了微藻培养的周期。

Description

一种营养切换培养产油微藻的方法
技术领域
本发明属于微藻生物培养技术领域，具体涉及一种营养切换培养产油微藻的方法。
背景技术
近年来，随着全球能源需求的不断扩大和环境污染问题的日益严重，对于绿色环保可再生的新能源的研究日益深入。其中，生物柴油作为一种可生物再生、环境友好型的绿色新能源而被广泛关注。自20世纪80年代开始，许多西方国家就已经开始利用油料作物(如大豆、油菜等)生产生物柴油作为传统化石燃料的替代品。
藻类是最原始的生物之一,通常呈单细胞、丝状体或片状体,结构简单,整个生物体都能进行光合作用,所以光合作用效率高,生长周期短、速度快。产油微藻为在一定条件下能将二氧化碳、碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为藻体内大量贮存的油脂,且油脂含量超过生物总量20％的微型藻类。同时与其他油料作物相比,利用微藻培养生产生物柴油所需占地面积最少,同时微藻培养可以利用滩涂地、荒废地等非耕地,因此微藻培养生产生物柴油不会导致世界粮食供应问题。所以，近几年来，利用产油微藻生产生物柴油成为目前国内外生产生物柴油的主要方法。
目前产油微藻的培养模式主要有两种：光反应器(如跑道池，光照培养箱等)中的自养培养和发酵罐中的异养培养。自养培养虽然降低了培养成本且有利于缓解温室效应，但生物质产量也较低同时生长周期相对较长；而异养培养虽可获得较高的培养密度，但失去了微藻作为绿色植物固定二氧化碳的重要作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种培养产油微藻的方法，对数生长期的产油微藻接种到含有有机碳源的培养基中，在光照与无光照交替循环的环境下进行培养，培养至平台期。此方法在光照与无光照交替循环的环境下进行培养，保证了生物质和脂质产量的同时又兼顾了其固定二氧化碳的重要作用并大大缩短了微藻培养的周期。
本发明采用以下技术方案来解决以上技术问题：
一种培养产油微藻的方法，对数生长期的产油微藻接种到含有有机碳源的培养基中，在光照与无光照交替循环的环境下进行培养，培养至平台期。
优选的，培养初始pH值为7.5-8.5，初始接种浓度为0.05-0.15g/L。
优选的，培养条件为：温度25-30摄氏度，光照时的光照强度为6000-10000lux，通气速率为0.3-0.7vvm。
优选的，在光暗比为18h:6h-6h:18h条件下进行光照与无光照交替循环。若光暗比为Ah:Bh，代表有光照的培养时间为Ah，无光照的培养时间为Bh，(A+B)小时进行有光照和无光照循环直至平台期结束。对数生长期的产油微藻在光照与无光照交替循环的环境下进行培养，通过控制光暗比达到混养和化能异养两者切换培养的目的。在培养基中添加有机碳源(如葡萄糖)之后，有光照时为混养培养，无光照时为化能异养培养。混养培养是指微藻在利用光能和二氧化碳等无机碳源的同时，以有机碳源(如葡萄糖)作为补充碳源进行生长；化能异养培养是指微藻仅以有机碳源(如葡萄糖)作为能源和碳源进行生长。
优选的，所述培养基为含有5-15g/L有机碳源的BG11培养基。所述BG11培养基的成分为NaNO31.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O0.036g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，乙二胺四乙酸0.001g/L，Na2CO30.02g/L，A5溶液1mL/L，用去离子水定容，其中A5溶液的组成为H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L，Co(NO3)2·6H2O0.0494g/L，NaMoO4·2H2O 0.390g/L。有机碳源可为糖类如葡萄糖，醇类如甘油，脂类如乙酸乙酯等。
所述产油微藻为能异养培养的产油微藻，可选自淡水小球藻株或蛋白核小球藻，淡水小球藻株如保藏号为CCTCC M2013607的淡水小球藻株Chlorella sorokiniana GS02。
任一上述培养产油微藻的方法用于生物柴油制造领域。
本发明的有益效果：通过光照与无光照交替循环的环境下进行培养产油微藻的方法，不仅获得了明显高于自养的生物质和脂质产量，同时也发挥了微藻作为绿色植物固定二氧化碳的重要作用；通过控制光照时间即光照比，巧妙地控制了光照与无光照的迅速切换，达到混养和化能异养交替培养的目的。
附图说明
图1为实施例1中蛋白核小球藻在自养和营养切换时的生长曲线。
图2为实施例2中小球藻Chlorella sorokiniana GS02在自养和营养切换时的生长曲线。
图3为实施例3中小球藻Chlorella sorokiniana GS02在自养和营养切换时的生长曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
藻细胞的细胞干重和油脂含量的测量方法
(1)测量藻细胞的细胞干重
培养结束后，将获得的藻液通过离心收集藻粉，进行干燥；干燥方式为冷冻干燥，最后获得纯净的藻粉。
细胞干重(g/L)＝干燥后所得藻粉总质量(g)/藻液总体积(L)
(2)测量藻细胞中脂质含量
取0.2g干燥的藻粉，加适量蒸馏水溶解后超声破碎，离心去掉上清，用氯仿：甲醇＝2:1混合溶液进行提取，离心收集上清液，重复提取三次后，将上清液混合，水浴蒸发去掉有机溶剂，残留物即为脂质。
脂质含量(％)＝脂质质量(g)/0.2(g)
实施例1蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa
(1)蛋白核小球藻的活化：配制50mlBG11培养基倒入锥形瓶中，高压灭菌后，从固体平板中挑取单菌落进行接种，并置于3000lux光强下24小时光照培养7天至对数生长期。
(2)在1L通气瓶中加入600ml含5g/L葡萄糖的BG11培养基，高压灭菌后从步骤(1)所述锥形瓶中吸取20ml活化完全的藻液进行接种，培养初始pH值为7.5，初始接种浓度为0.05g/L，培养温度为25摄氏度，并置于8000lux光强下以0.3vvm通气速率进行通气培养，控制光暗比为16h:8h，通过对光暗比的控制，使对数生长期的产油微藻在光照与无光照的环境进行切换(即营养切换)，培养至平台期。
(3)在1L通气瓶中加入600mlBG11培养基，高压灭菌后从步骤(1)所述锥形瓶中吸取20ml活化完全的藻液进行接种，培养初始pH值为7.5，初始接种浓度为0.05g/L，培养温度为25摄氏度，并置于8000lux光强下以0.3vvm通气速率进行通气培养，控制光暗比为16h:8h，不添加葡萄糖，作为对照。
蛋白核小球藻在自养和营养切换时的生长曲线见图1。
培养八天后，采用上述藻细胞的细胞干重和油脂含量的测量方法获得表1数据。
表1
培养方式 细胞干重(g/L) 脂质含量(％)
自养 0.66 27.2
营养切换 1.62 50.3
实施例2小球藻Chlorella sorokiniana GS02
(1)小球藻Chlorella sorokiniana GS02的活化：配制50mlBG11培养基倒入锥形瓶中，高压灭菌后，从固体平板中挑取单菌落进行接种，并置于4000lux光强下24小时光照培养7天至对数生长期。
(2)在1L通气瓶中加入500ml含10g/L葡萄糖的BG11培养基，高压灭菌后从步骤(1)所述锥形瓶中吸取35ml活化完全的藻液进行接种，培养初始pH值为8.0，初始接种浓度为0.1g/L，培养温度为30摄氏度，并置于10000lux光照强度下以0.5vvm通气速率进行通气培养，控制光暗比为12h:12h，通过对光暗比的控制，使对数生长期的产油微藻在光照与无光照的环境进行切换(即营养切换)，培养至平台期。
(3)在1L通气瓶中加入500ml BG11培养基，高压灭菌后从步骤(1)所述锥形瓶中吸取35ml活化完全的藻液进行接种，培养初始pH值为8.0，初始接种浓度为0.10g/L，培养温度为30摄氏度，并置于10000lux光照强度下以0.5vvm通气速率进行通气培养，控制光暗比为12h:12h，不添加葡萄糖，作为对照。
小球藻Chlorella sorokiniana GS02在自养和营养切换时的生长曲线见图2。
培养八天后，采用上述藻细胞的细胞干重和油脂含量的测量方法获得表2数据。
表2
培养方式 细胞干重(g/L) 脂质含量(％)
自养 0.89 22.5
营养切换 3.36 35.6
实施例3小球藻Chlorella sorokiniana GS02
(1)小球藻Chlorella sorokiniana GS02的活化：配制60mlBG11培养基倒入锥形瓶中，高压灭菌后，从固体平板中挑取单菌落进行接种，并置于4000lux光强下24小时光照培养7天至对数生长期。
(2)在1L通气瓶中加入500ml含10g/L葡萄糖的BG11培养基，高压灭菌后从步骤(1)所述锥形瓶中吸取50ml活化完全的藻液进行接种，培养初始pH值为8.5，初始接种浓度为0.15g/L，培养温度为28摄氏度，并置于6000lux光照强度下以0.7vvm通气速率进行通气培养，控制光暗比为8h:16h，通过对光暗比的控制，使对数生长期的产油微藻在光照与无光照的环境进行切换(即营养切换)，培养至平台期。
(3)在1L通气瓶中加入500ml BG11培养基，高压灭菌后从步骤(1)所述锥形瓶中吸取50ml活化完全的藻液进行接种，培养初始pH值为8.5，初始接种浓度为0.15g/L，培养温度为28摄氏度，并置于6000lux光照强度下以0.7vvm通气速率进行通气培养，控制光暗比为8h:16h，不添加葡萄糖，作为对照。
小球藻Chlorella sorokiniana HN01在自养和营养切换时的生长曲线见图3。
培养八天后，采用上述藻细胞的细胞干重和油脂含量的测量方法获得表3数据。
表3
培养方式 细胞干重(g/L) 脂质含量(％)
自养 0.79 21.2
营养切换 3.29 37.8

Claims (9)

1.一种培养产油微藻的方法，其特征在于，对数生长期的产油微藻接种到含有有机碳源的培养基中，在光照与无光照交替循环的环境下进行培养，培养至平台期。
2.根据权利要求1所述的培养产油微藻的方法，其特征在于，培养初始pH值为7.5-8.5，初始接种浓度为0.05-0.15g/L。
3.根据权利要求1所述的培养产油微藻的方法，其特征在于，培养条件为：温度为25-30摄氏度，光照时的光照强度为6000-10000lux，通气速率为0.3-0.7vvm。
4.根据权利要求1所述的培养产油微藻的方法，其特征在于，在光暗比为18h:6h-6h:18h条件下进行光照与无光照交替循环。
5.根据权利要求1所述的培养产油微藻的方法，其特征在于，所述培养基为含有5-15g/L有机碳源的BG11培养基。
6.根据权利要求5所述的培养产油微藻的方法，其特征在于，所述有机碳源为葡萄糖。
7.根据权利要求5所述的培养产油微藻的方法，其特征在于，所述BG11培养基的成分为NaNO31.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，乙二胺四乙酸0.001g/L，Na2CO30.02g/L，A5溶液1mL/L，用去离子水定容，其中A5溶液的组成为H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.0494g/L，NaMoO4·2H2O 0.390g/L。
8.根据权利要求1所述的培养产油微藻的方法，其特征在于，所述产油微藻选自淡水小球藻株或蛋白核小球藻。
9.根据权利要求1至8任一所述的培养产油微藻的方法用于生物柴油制造领域。
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