CN102453684B - 氮源用于提高金藻生物量与油脂含量的培养方法 - Google Patents

Abstract

一种提高金藻生物量与油脂含量的培养方法公开了一种利用氮源提高金藻生物量同时提高油脂含量的培养调控方法，是将藻株高密度接种于传统的f／2灭菌培养基中，每12～72h内向培养体系中加入氮源，浓度为0.2～100mmol／L，培养温度25～30℃，光强100～300μmol.m^-2s^-1，光暗比为14h：10h条件下通CO₂培养，通气速率0.6～1.2vvm，8-10天时间内收获，藻细胞密度最高可达1.3×10⁸cell／ml，干重最高达3.12g／L，油脂含量最高可达53％。该方法在获得高生物量同时也获得了藻细胞的高油脂含量，弥补了目前利用氮限制提高藻细胞油脂含量但降低生物量的不足。

Description

氮源用于提高金藻生物量与油脂含量的培养方法

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及海洋单细胞微藻金藻的生长培养以及油脂调控。

背景技术

当前，能源问题已经成为主导国家经济发展以及战略安全的主要问题。按目前的探明储量以及消耗速度上看，世界存储石油仅可维持40年的使用。此外，以石油为主的传统化石能源的消耗给环境带来严重的污染，空气中70％的CO2和颗粒悬浮物均来自各种化石燃料的燃烧。因此，化石能源的日趋减少以及造成的环境污染使科研工作者把注意力集中到可再生能源的开发利用上。在各种可再生能源中，生物质能是地球上最普遍的具有广泛实用价值的一种可再生能源资源。

微藻，由于其具有光合效率高、繁殖快、油脂含量高、不占用农业耕地等特点，使微藻油脂成为目前第三代生物能源开发的原料。目前对于大部分微藻尤其是绿藻而言，提高其细胞油脂含量的主要培养调控方法是氮限制胁迫，即将藻细胞接种于氮限制或无氮环境的培养体系中以改变其体内碳流的途径，使合成蛋白或碳水化合物的碳源用于向合成脂肪的方向流动，从而达到提高脂肪含量的目的。然而由于氮源的限制使藻细胞的分裂、生长受到限制，在培养后期藻细胞会出现分裂活动停止，细胞活力下降导致生物量急剧下降，最后藻细胞的总脂肪产量反而没有得到极大的提升。

湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)都是海洋微藻，属于金藻门、普林藻纲、等鞭藻目、等鞭藻科、等鞭藻属。据报道，金藻尤其是球等鞭金藻体内的总脂肪可以占其干重的20-40％，并且富含多不饱和脂肪酸，而迄今为止对于湛江等鞭金藻还未有报道。因此，找到一种既能提高金藻生物量又能提高其油脂含量的培养方法成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对金藻(湛江等鞭金藻、球等鞭金藻)提供了一种生物量和油脂含量筒同时得以提高的培养方法。

为了实现上述目的，本发明采用的培养方法包括以下步骤：

一种提高金藻生物量与油脂含量的培养方法：

1)藻细胞预培养于容器中，待生长至指数期；

2)将指数期的藻细胞接种于添加氮源的传统灭菌的f/2培养基中，于柱状光生物反应器中通空气培养；8-10天时间内将藻细胞收获；

其中，于f/2培养基中添加氮源的量为0.4～200mmol/L。

3)油脂提取与测定：将生长平台期的藻液收获离心，所得的藻泥经冷冻干燥，得到干藻粉后采用氯仿-甲醇法分析测定油脂含量。

添加氮源的添加方式为一次性加入、间歇补加或连续补加；其中一次性加入氮源，浓度为20～200mmol/L；间歇补加为每12-72h内向培养体系中加入氮源，浓度为0.2～100mmol/L；连续补加的方式使培养体系中的氮源浓度维持在0.88～50mmol/L。

该方法适应的藻株为湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)或球等鞭金藻(Isochrysis galbana)。

指数期的藻细胞采用高密度接种于添加氮源的传统灭菌的f/2培养基中，接种终浓度至少为6×10⁶cell.ml^-1～10×10⁶cell.ml^-1。

藻细胞生长于添加氮源的传统f/2培养基中，选用的氮源为硝酸盐或尿素；所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾。

所述培养温度25～30℃，光强150～300μmol.m^-2s^-1，光暗比为12～14h∶12～10h，空气中CO₂体积浓度为1％～5％，通气速率0.6～1.2vvm。

所述光生物反应器为柱状光生物反应器，柱体直径为3-8厘米。

本发明的优点如下：

1.脂肪产量高：本发明所得到的藻细胞生物量有显著的提高，细胞密度最高可达1.1×10⁸～1.3×10⁸cell/ml，干重最高2.82～3.2g/L，油脂含量最高达36～53％，而普通培养条件下细胞密度最高仅为2.4～3.0×10⁷cell/ml，干重最高0.9～1.18g/L，油脂含量25～29％，因此脂肪产量得到了大大提高，是普通培养条件下的3～4倍，弥补了目前由氮源限制带来的油脂含量提高且生物量下降的缺陷。

2、应用前景好：本发明所选的藻种为海洋单细胞微藻，利用海水规模培养，缓解淡水资源危机。同时，对CO₂作为藻细胞生长的碳源的利用也可以在一定程度上固定大气中的CO₂，起到缓解温室效应的作用。此外，藻细胞生长快速，8～10天内即可达到平台期。温度适应性强，9～35℃范围内均能生长繁殖，光照适应性强，20～600μmol.m^-2s^-1范围内均可生长繁殖。

3、副产品价值高：在藻细胞获得高油脂含量的条件下，其蛋白含量也非常可观约占干重的37％(Lowrry法测定)。金藻的脂肪酸成分种类多达13种，其中DHA含量约占总脂肪酸的10～13％，在开发成生物燃料的同时可以提取出来开发成高附加值生物产品。

本发明培养调控方法藻细胞密度最高可达1.3×10⁸cell/ml，干重最高达3.12g/L，油脂含量最高可达53％。该方法在获得高生物量同时也获得了藻细胞的高油脂含量，弥补了目前利用氮限制提高藻细胞油脂含量但降低生物量的不足。该藻株为海洋单细胞微藻，海水培养，并具有个体细胞小，生长速度快等特点，有潜力作为生物燃料的原料规模培养。

具体实施方式

传统f/2培养基配方：

1)氮源：75g/LNaNO₃；

2)磷源：5g/LNaH₂PO₄·H₂O；

3)金属元素：3.15g/L FeCl₃·6H₂O，4.36g/L Na₂EDTA，0.0098g/LCuSO₄·5H₂O，0.0063g/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.022g/L ZnSO₄·7H₂O，0.01g/LCoCl₂·6H₂O，0.18g/L MnCl₂·4H₂O；

4)维生素0.001g/L vitamin B₁₂，0.2g/L vitamin B₁，0.001g/L D-生物素.

向每升海水中添加上述氮源、磷源、金属元素各1ml，维生素0.5ml。

灭菌方法：

采用高温式灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为10min。

指数期是指：藻细胞的快速生长期，金藻藻细胞在3L锥形瓶中生长至第5天进入指数期。

实施例1

首先将湛江等鞭金藻藻细胞预培养于3L锥形瓶中摇瓶培养，培养体积2L，光照培养架上生长至指数期，藻细胞密度在600～700×10⁴cell.ml^-1时，将藻液离心，收集藻细胞。

将指数期的藻液离心后接种于灭菌的f/2培养基中，于600ml直径为5cm的柱状光生物反应器中培养，培养体积500ml，接种终浓度为8×10⁶cell·ml^-1。氮源选用硝酸钠，培养过程中不补加氮源，每72h补加磷源、金属元素、维生素1次，其补加浓度与f/2培养基的原配方浓度一致，培养温度25±1℃，光强200μmol·m^-2s^-1，光暗比为14h∶10h条件下通CO₂培养，CO₂浓度为2％，通气速率0.8vvm，第9天离心收获藻细胞。

藻细胞密度最高为2.4×10⁷cell/ml，藻液过滤于预先干燥称重的Whatman GF/C纤维膜上，再用0.5M碳酸氢铵洗涤两遍，烘干至恒重测定干重，计算其生物量为1.18g/L。离心后所得藻泥经冷冻干燥得到干藻粉，氯仿-甲醇法测定其油脂含量为28％，总脂肪产量为0.33g/L(表1)。

实施例2

首先将湛江等鞭金藻藻细胞预培养于3L锥形瓶中摇瓶培养，培养体积2L，光照培养架上生长至指数期，藻细胞密度在600～700×10⁴cell·ml^-1时，将藻液离心，收集藻细胞。

将指数期的藻液离心后接种于灭菌的f/2培养基中，于600ml直径为5cm的柱状光生物反应器中培养，培养体积500ml，接种终浓度为8×10⁶cell·ml^-1。氮源选用尿素，每24h内向培养体系中加入0.03g/L尿素，每72h补加磷源、金属元素、维生素1次，其补加浓度与f/2培养基原配方浓度一致，培养温度25±1℃，光强200μmol.m^-2s^-1，光暗比为14h∶10h条件下通CO₂培养，CO₂浓度为2％，通气速率0.8vvm，第9天离心收获藻细胞。

藻细胞密度最高为1.3×10⁸cell/ml，藻液过滤于预先干燥称重的Whatman GF/C纤维膜上，再用0.5M碳酸氢铵洗涤两遍，烘干至恒重测定干重，计算其生物量为3.0g/L。离心后所得藻泥经冷冻干燥得到干藻粉，氯仿-甲醇法测定其油脂含量为36％，总脂肪产量为1.08g/L(表1)。

实施例3

首先将湛江等鞭金藻藻细胞预培养于3L锥形瓶中摇瓶培养，培养体积2L，光照培养架上生长至指数期，藻细胞密度在600～700×10⁴cell.ml^-1时，将藻液离心，收集藻细胞。

将指数期的藻液离心后接种于灭菌的f/2培养基中，于600ml直径为5cm的柱状光生物反应器中培养，培养体积500ml，接种终浓度为8×10⁶cell.ml^-1。氮源选用硝酸钠，每24h内向培养体系中加入4.5g/L硝酸钠，每72h补加磷源、金属元素、维生素1次，其补加浓度与f/2培养基原配方浓度一致，培养温度25±1℃，光强200μmol.m^-2s^-1，光暗比为14h∶10h条件下通CO₂培养，CO₂浓度为2％，通气速率0.8vvm，第9天离心收获藻细胞。

藻细胞密度最高为5.8×10⁷cell/ml，藻液过滤于预先干燥称重的Whatman GF/C纤维膜上，再用0.5M碳酸氢铵洗涤两遍，烘干至恒重测定干重，计算其生物量为2.1g/L。离心后所得藻泥经冷冻干燥得到干藻粉，氯仿-甲醇法测定其油脂含量为53％，总脂肪产量为1.11g/L(表1)。

实施例4

首先将湛江等鞭金藻藻细胞预培养于3L锥形瓶中摇瓶培养，培养体积2L，光照培养架上生长至指数期，藻细胞密度在600～700×10⁴cell.ml^-1时，将藻液离心，收集藻细胞。

将指数期的藻液离心后接种于灭菌的f/2培养基中，于600ml直径为5cm的柱状光生物反应器中培养，培养体积500ml，接种终浓度为8×10⁶cell.ml^-1。氮源选用硝酸钠，采用连续补加的方式使培养体系中加入硝酸钠的浓度维持在0.068g/L，每72h补加磷源、金属元素、维生素1次，其补加浓度与f/2培养基原配方浓度一致，培养温度25±1℃，光强200μmol.m^-2s^-1，光暗比为14h∶10h条件下通CO₂培养，CO₂浓度为2％，通气速率0.8vvm，第9天离心收获藻细胞。

藻细胞密度最高为8×10⁷cell/ml藻液过滤于预先干燥称重的WhatmanGF/C纤维膜上，再用0.5M碳酸氢铵洗涤两遍，烘干至恒重测定干重，计算其生物量为1.6g/L。离心后所得藻泥经冷冻干燥得到干藻粉，氯仿-甲醇法测定其油脂含量为43％，总脂肪产量为0.69g/L(表1)。

实施例5

首先将湛江等鞭金藻藻细胞预培养于3L锥形瓶中摇瓶培养，培养体积2L，光照培养架上生长至指数期，藻细胞密度在600～700×10⁴cell·ml^-1时，将藻液离心，收集藻细胞。

将指数期的藻液离心后接种于灭菌的f/2培养基中，于600ml直径为5cm的柱状光生物反应器中培养，培养体积500ml，接种终浓度为8×10⁶cell.ml^-1。氮源选用硝酸钾，一次性向培养体系中加入1.5g/L硝酸钾，每72h补加磷源、金属元素、维生素1次，其补加浓度与f/2培养基原配方浓度一致，培养温度25±1℃，光强200μmol.m^-2s^-1，光暗比为14h∶10h条件下通CO₂培养，CO₂浓度为2％，通气速率0.8vvm，第9天离心收获藻细胞。

藻细胞密度最高为1.1×10⁸cell/ml，藻液过滤于预先干燥称重的Whatman GF/C纤维膜上，再用0.5M碳酸氢铵洗涤两遍，烘干至恒重测定干重，计算其生物量为2.5g/L。离心后所得藻泥经冷冻干燥得到干藻粉，氯仿-甲醇法测定其油脂含量为40％，总脂肪产量为1.00g/L(表1)。

表1

Claims (2)

1.氮源用于提高金藻生物量与油脂含量的培养方法，其特征在于：

藻细胞预培养于容器中，待生长至指数期；将指数期的藻细胞接种于添加氮源的灭菌的传统f／2培养基中，于柱状光生物反应器中通空气培养；8-10天时间内将藻细胞收获；

所述添加氮源的添加方式为一次性加入、间歇补加或连续补加；其中一次性加入硝酸钾15mmol／L；间歇补加为每12-72h内向培养体系中加入硝酸钠50mmol／L或加入尿素0.5mmol／L；连续补加的方式使培养体系中的硝酸钠浓度维持在0.8mmol／L；

所述藻细胞为湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)；

所述指数期的藻细胞采用高密度接种于添加氮源的灭菌的传统f／2培养基中，接种终浓度为6×10⁶cell·ml^-1～10×10⁶cell·ml^-1；

所述培养温度25～30℃，光强150～300μmol.m^-2s^-1，光暗比为12-14h：12-10h，空气中CO₂体积浓度为1％～5％，通气速率0.6～1.2vvm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述光生物反应器为柱状光生物反应器，柱体直径为3-8厘米。