CN102495152A - 一种分析微藻代谢组的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分析微藻代谢组的方法，该方法包括：微藻细胞收集及淬灭；提取细胞内代谢物；代谢物衍生化；最后通过GC-MS对样品分析得到代谢组结果。本发明提供了一种分析微藻代谢组的手段，这种手段涉及代谢反应的终止、代谢物的提取、代谢物的分析，从而获得微藻在不同培养条件下的代谢物的定性和定量结果，为微藻代谢组的分析提供了方法，这种方法对促进微藻的代谢研究具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物燃料领域，涉及一种分析微藻代谢组的方法。
背景技术
随着人类社会的不断发展，对能源的需求与日俱增，但是当前化石能源的储备是有限的，伴随着化石能源的消耗，石油价格持续看涨，国际关系也日益紧张，此外，化石能源的使用造成二氧化碳不断增加，是温室效应的主要来源。因此可持续发展的绿色新能源的开发成为了各国关注的热点。
目前常用的生物能源主要是生物乙醇和生物柴油，其中生物乙醇主要来自于农业废弃物中的纤维素资源，但是生物乙醇的使用需要重新设计配送基础结构及引擎，与现有技术兼容性差，而且纤维素降解液的利用和前处理过程中产生的抑制性毒素也是生物发酵产乙醇的一大瓶颈。而通过富油生物，比如微藻产生物柴油，所得脂肪酸甲酯完全可以使用现有的燃料装置，而且微藻生长速率快，对培养环境要求低，不占用耕地，含油量也较高。
但是微藻产油尚在起步阶段，在其发展成为可以适应大规模工业生产之前还有许多技术知识需要积累，而微藻培养过程中相关的代谢机制研究就是其中一个关键方向，不过微藻的破壁比较困难，而且微藻相关的代谢组学研究方法几乎是空白。因此，对微藻油脂积累过程中的代谢组监控的方法的开发就显得尤为重要了。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分析微藻代谢组的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种分析微藻代谢组的方法，包括如下步骤：
(1)微藻细胞收集及淬灭：
取出已培养好的藻液样品3-5份，每份100-150mL，4℃下3000-5000rpm，离心3-4min，收集下层的细胞，用3-5mL代谢终止液在-40℃下淬灭5-10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；
所述代谢终止液为含有1500mg·L-1NaNO3，36mg·L-1CaCl2·2H2O，75mg·L-1MgSO4·7H2O和40mg·L-1K2HPO4·3H2O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；
(2)提取细胞内代谢物：
从3-5份步骤(1)获得的冻干细胞中各取15-25mg分别置于离心管中，每管加入1-2mL-40℃的代谢提取液，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融3-5次，在-20℃下4000-6000rpm离心1-2min，收集上清，另向残渣中加入0.5-1mL代谢提取液，-20℃下4000-6000rpm离心1-2min，离心后，将两次上清液合并，加入10-20μg氘标记琥珀酸，得混合液，各取200μL混合液，在-80℃下冷冻干燥2-4小时；
所述代谢提取液为体积百分含量为50％的甲醇水溶液；
(3)代谢物衍生化
向步骤(2)获得的样品中各加入20mg·mL-1的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反应60-80min，反应结束后加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反应60-80min，8000-12000rpm离心1min，取上清100μL放入已编号的GC进样瓶，室温放置2h；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对步骤(3)获得的3-5份样品进行定性和定量处理，得到微藻代谢组分析结果。
所述步骤(4)的检测条件优选的是如下：
色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；
进样量：1μL；
分流比：10∶1；
进样口温度：280℃；
GC interface温度：270℃；
氦气流速：恒压，91KPa；
升温程序：70℃保持2min，以5℃·min-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；
电离电压：70eV；
源温：250℃；
扫描范围：50-800m/z；
扫描速度：2scan·s-1。
所述的微藻涉及但不限于小球藻(Chlorella sorokiniana)、栅藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)及鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)。
本发明提供了一种分析微藻代谢组的手段，这种手段涉及代谢反应的终止、代谢物的提取、代谢物的分析，从而获得微藻在不同培养条件下的代谢物的定性和定量结果，为微藻代谢组的分析提供了方法，这种方法对促进微藻的代谢研究具有重要的意义。
具体实施方式
下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何限制。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种分析微藻代谢组的方法，包括如下步骤：
(1)小球藻(Chlorella sorokiniana)细胞收集及淬灭：
对小球藻(Chlorella sorokiniana)进行培养，当培养至OD560为0.8时，取出5份藻液样品，每份100mL，4℃下3000rpm，离心3min，收集下层的细胞，用4mL代谢终止液在-40℃下淬灭5分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4h获得冻干细胞；
所述代谢终止液为含有1500mg·L-1NaNO3，36mg·L-1CaCl2·2H2O，75mg·L-1MgSO4·7H2O和40mg·L-1K2HPO4·3H2O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；
(2)提取细胞内代谢物：
取步骤(1)获得的冻干细胞5份，每份15mg分别置于离心管中，每管加入1mL-40℃的代谢提取液，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融3次，在-20℃下4000rpm离心1min，收集上清，另向残渣中加入0.5mL代谢提取液，-20℃下4000rpm离心1min，离心后，两次上清液合并，加入10μg氘标记琥珀酸，得混合液，各取200μL混合液，在-80℃下冷冻干燥2小时；
所述代谢提取液为体积百分含量为50％的甲醇水溶液；
(3)代谢物衍生化
向步骤(2)获得的样品中加入20mg·mL-1的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反应60min，反应结束后加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反应60min，8000rpm离心1min，取上清100μL放入已编号的GC进样瓶，室温放置2h；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对步骤(3)获得的5份样品进行定性和定量处理，得到微藻代谢组分析结果，见表1。
条件如下：
色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；
进样量：1μL；
分流比：10∶1；
进样口温度：280℃；
GC interface温度：270℃；
氦气流速：恒压，91KPa；
升温程序：70℃保持2min，以5℃·min-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；
电离电压：70eV；
源温：250℃；
扫描范围：50-800m/z；
扫描速度：2scan·s-1；
(5)实验结果
表1代谢物鉴定表
如表1所示，通过本发明的方法提取微藻代谢物一共获得88种代谢物，其中74种是可被鉴定的，包括15种氨基酸，10种有机酸，6种胺类，23种脂质，12种糖及其他。
实施例2
一种分析微藻代谢组的方法，包括如下步骤：
(1)小球藻(Chlorella sorokiniana)细胞收集及淬灭：
对小球藻(Chlorella sorokiniana)进行培养，当培养至OD560为1.0时，取出4份藻液样品，每份120mL，4℃下5000rpm，离心3min，收集下层的细胞，用3mL代谢终止液在-40℃下淬灭7分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥6h获得冻干细胞；
代谢终止液同实施例1；
(2)提取细胞内代谢物：
取步骤(1)获得的4份冻干细胞，每份25mg分别置于离心管中，每管加入2mL-40℃的代谢提取液，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融5次，在-20℃下6000rpm离心1min，收集上清，另向残渣中加入1mL代谢提取液，-20℃下6000rpm离心1min，离心后，两次上清液合并，加入20μg氘标记琥珀酸，得混合液，各取200μL混合液，在-80℃下冷冻干燥4小时；
代谢提取液同实施例1；
(3)代谢物衍生化
向步骤(2)获得的样品中加入20mg·mL-1的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反应80min，反应结束后加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反应80min，12000rpm离心1min，取上清100μL放入已编号的GC进样瓶，室温放置2h；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对步骤(3)获得的4份样品进行定性和定量处理，得到微藻代谢组分析结果。
检测条件同实施例1；
(5)实验结果
经检测，其结果同实施例1的结果，通过本发明的方法提取微藻代谢物一共获得88种代谢物，其中74种是可被鉴定的，包括15种氨基酸，10种有机酸，6种胺类，23种脂质，12种糖及其他。
实施例3
一种分析微藻代谢组的方法，包括如下步骤：
(1)小球藻(Chlorella sorokiniana)细胞收集及淬灭：
对小球藻(Chlorella sorokiniana)进行培养，当培养至OD560达到1，5，取出3份藻液样品，每份150mL，4℃下3000rpm，离心4min，收集下层的细胞，用5mL代谢终止液在-40℃下淬灭10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥6h获得冻干细胞；
代谢终止液同实施例1；
(2)提取细胞内代谢物：
取步骤(1)获得的冻干细胞3份，每份20mg分别置于离心管中，每管加入2mL-40℃的代谢提取液，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融5次，在-20℃下6000rpm离心2min，收集上清，另向残渣中加入1mL代谢提取液，-20℃下6000rpm离心2min，离心后，两次上清液混合，加入20μg氘标记琥珀酸，得混合液，取200μL混合液，在-80℃下冷冻干燥4小时；
代谢提取液同实施例1；
(3)代谢物衍生化
向步骤(2)获得的样品中加入20mg·mL-1的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反应70min，反应结束后加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反应60min，12000rpm离心1min，取上清100μL放入已编号的GC进样瓶，室温放置2h；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对对步骤(3)获得的3份样品进行定性和定量处理，得到微藻代谢组分析结果。
检测条件同实施例1：
(5)实验结果
经检测，其结果同实施例1的结果，通过本发明的方法提取微藻代谢物一共获得88种代谢物，其中74种是可被鉴定的，包括15种氨基酸，10种有机酸，6种胺类，23种脂质，12种糖及其他。
本发明所采用的小球藻(Chlorella sorokiniana)只用于说明本发明，但并不用于限定本发明，实验证明，栅藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)及鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)也可以用于本发明。
Claims (3)
1.一种分析微藻代谢组的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)微藻细胞收集及淬灭：
取出已培养好的微藻藻液样品3-5份，每份100-150mL，4℃下3000-5000rpm，离心3-4min，收集下层的细胞，用3-5mL代谢终止液在-40℃下淬灭5-10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；
所述代谢终止液为含有1500mg·L-1NaNO3，36mg·L-1CaCl2·2H2O，75mg·L-1MgSO4·7H2O和40mg·L-1K2HPO4·3H2O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；
(2)提取细胞内代谢物：
从步骤(1)获得的3-5份冻干细胞中各取15-25mg分别置于离心管中，每管加入1-2mL-40℃的代谢提取液，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融3-5次，在-20℃下4000-6000rpm离心1-2min，收集上清，另向残渣中加入0.5-1mL代谢提取液，-20℃下4000-6000rpm离心1-2min，离心后，将两次上清液合并，加入10-20μg氘标记琥珀酸，得混合液，各取200μL混合液，在-80℃下冷冻干燥2-4小时；
所述代谢提取液为体积百分含量为50％的甲醇水溶液；
(3)代谢物衍生化
向步骤(2)获得的样品中各加入20mg·mL-1的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反应60-80min，反应结束后加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反应60-80min，8000-12000rpm离心1min，取上清100μL放入已编号的GC进样瓶，室温放置2h；
(4)GC-MS检测
采用GC-MS对步骤(3)获得的3-5份样品进行定性和定量处理，得到微藻代谢组分析结果。
2.根据权利要求1所述的一种分析微藻代谢组的方法，其特征是所述微藻为小球藻(Chlorellasorokiniana)、栅藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)及鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)。
3.根据权利要求1所述的一种分析微藻代谢组的方法，其特征是所述步骤(4)的检测条件如下：
色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；
进样量：1μL；
分流比：10∶1；
进样口温度：280℃；
GC interface温度：270℃；
氦气流速：恒压，91KPa；
升温程序：70℃保持2min，以5℃·min-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；
电离电压：70eV；
源温：250℃；
扫描范围：50-800m/z；
扫描速度：2scan·s-1。
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