CN111440727B - 一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法及其应用。该方法包括如下步骤：S1、将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中并分成n份，然后分别加入浓度梯度的化学诱导剂进行诱导培养，依次得到诱导剂组绿藻细胞，同时以不加入化学诱导剂为对照，得到对照组绿藻细胞；S2、采用流式细胞仪分别测定诱导剂组绿藻细胞和对照组绿藻细胞内叶绿素的平均荧光强度；S3、根据诱导剂组和对照组绿藻细胞内叶绿素的平均荧光强度判断该化学诱导剂是否能提高绿藻细胞内产油量，并以此筛选出最佳诱导浓度。本发明方法可以筛选出能有效提高绿藻产油量的化学诱导剂，进而可将其用于培养绿藻细胞生产生物柴油原料油和/或食用型藻油。

Description

一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法及其应用
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，特别涉及一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法及其应用。
背景技术
微藻是一大类单细胞低等植物的总称，具有植物和微生物的双重特性，特殊品种能在缺氮、高碳氮比培养条件下能积累大量油脂，是藻基生物燃料、藻基食用油脂的优质原料，其生物量和油脂(总脂和脂肪酸)的高产发酵技术一直是本领域的研究热点。佐夫色绿藻(Chromochloris zofingiensis)是一种单细胞绿藻，生长速率快，能够在黑暗条件下利用有机碳源进行异养高细胞密度发酵，同时高碳氮比时在细胞内积累类胡萝卜素和脂类等多种高价值代谢产物，是目前微藻油脂生产的重要种质之一。研究表明，佐夫色绿藻在高光、高盐、氮磷营养元素限制等诱导条件下可以有效积累藻油，但相对于广泛采用的小球藻等绿藻种质，佐夫色绿藻油脂产量还比较低，生产成本还相对较高。如能筛选获得高效的化学诱导剂，显著提高佐夫色绿藻的油脂产量，对于微藻产油的生产技术进步、促进商业化开发利用具有非常重要的意义。
诱导条件是决定佐夫色绿藻胞内油脂积累量的重要影响因素，在微藻合成油脂的代谢调控中具有积极作用。目前常见的促进油脂积累的化学诱导物主要有三大类，分别是中间代谢前体物、氧化还原诱导物以及代谢抑制剂等化学诱导物等。其中，后两者本质上都是诱导藻细胞内氧化水平的提高，进而通过活性氧自由基(ROS)信号介导的调控机制来诱导油脂的合成。通过快速筛选实验可以获得有助于油脂高效积累的化学诱导剂诱导条件，再结合特定设计的适宜微藻的诱导培养装置，可以进一步显著提高佐夫色绿藻胞内油脂积累量。此外，采用化学诱导物进行佐夫色绿藻细胞的生理代谢具有经济高效、简便快捷、易于操作和调控微藻细胞代谢的优势，目前在微藻培养积累高价值代谢产物方面具有重要的商业化应用前景。
根据文献检索，能够提高微藻油脂产量的化学诱导物种类多，诱导效果差异大，如何快速检测评估其诱导效果是实现高效筛选化学诱导物的关键。传统的微藻油脂含量检测方法，主要有溶剂提取称重法和脂类荧光染色法等，涉及到样品处理和检测等多个步骤，所需要的检测时间较长，工作效率比较低，也无法实现快速、批量检测，在大规模批量筛选和评估化学诱导物时具有很大局限性。现有研究表明，微藻细胞在缺氮胁迫下大量积累油脂时，会伴随着叶绿体的自噬解体和叶绿素的降解转化，而通过检测微藻细胞的叶绿素含量就可以间接反映出微藻油脂含量。这是因为叶绿素是微藻细胞内的含氮化合物，在微藻细胞处于胞外完全缺氮前提下，微藻细胞会首先将叶绿素降解转化用于细胞内必需的氮素。这时，如果胞内氮源尤其是叶绿素的含量越高，就说明越少叶绿素被降解转化，这样会显著加剧微藻细胞内的缺氮水平，从而显著提高油脂积累量。简言之，在微藻胞外完全无氮条件下进行诱导胁迫培养，微藻细胞中叶绿素含量越高，其油脂积累量也越高，两者呈现出正相关性。
目前微藻胞内油脂含量测定方法为有机溶剂提取称重法和荧光染料染色法等，而叶绿素含量测定主要采用传统的紫外可见分光法和液相色谱法等。这些测定方法存在费时费力，检测效率低等缺点。因此，建立一种简单、有效、快速的筛选方法，为佐夫色绿藻生产油脂的工艺开发利用提供创新技术支撑具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法。
本发明的另一目的在于提供所述用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，包括如下步骤：
S1、初筛诱导培养：将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中并分成n份，然后分别加入浓度为C1，C2……Cn(按浓度梯度进行)的化学诱导剂进行诱导培养，依次得到诱导剂组绿藻细胞A1，A2……An，同时在相同条件下以不加入化学诱导剂为对照，得到对照组绿藻细胞；其中n≥2，且为整数；浓度C1>C2……>Cn；
S2、MFI值测定：采用流式细胞仪分别测定步骤S1中得到的诱导剂组绿藻细胞A1，A2……An以及对照组绿藻细胞内叶绿素的平均荧光强度，依次得到诱导剂组绿藻细胞的平均荧光强度值MFI1、MFI2……MFIn，以及对照组绿藻细胞的平均荧光强度值MFI0；
S3、初筛判断：
①若MFI1≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C1时能够提高绿藻细胞内产油量，反之，若MFI1＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C1时不能提高绿藻细胞内产油量(即该化学诱导剂在浓度为C1时对绿藻细胞产油量无诱导刺激作用效果)；同理，若MFI2≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C2时能够提高绿藻细胞内产油量，若MFI2＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C2时不能提高绿藻细胞内产油量；以此类推，若MFIn≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cn时能够提高绿藻细胞内产油量，反之，若MFIn＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cn时不能提高绿藻细胞内产油量；
和/或，
②将MFI1、MFI2……MFIn进行排序，取最大值，命名为MFIx，并获得与MFIx相对应的化学诱导剂的浓度，命名为Cx；若MFIx≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cx时能够提高绿藻细胞内产油量，以该浓度为化学诱导剂的最佳诱导浓度；若MFIx＜MFI0，则说明该化学诱导剂对绿藻细胞产油量无诱导刺激作用效果(即该化学诱导剂不能用于提高绿藻细胞内产油量)。
步骤S1中所述的绿藻为色绿藻、小球藻、栅藻、衣藻和盐藻中的至少一种；优选为佐夫色绿藻(Chromochloris zofingiensis)。
步骤S1中所述的分成n份优选为平均分成n份。
步骤S1中所述的活化为通过如下步骤实现：先将绿藻细胞接种到斜面固体培养基中进行培养，然后转接至液体培养基中进行循环往复振荡培养3～5天，得到活化的绿藻细胞；其中，所述的培养的条件均为：转速为50～500rpm，培养温度20～30℃(优选为26℃)，光照10～30μmol m-2s-1(优选为10μmol m-2s-1)，光暗周期为0:24(h)～24:0(h)，pH 6.0～7.0(优选为6.5)。
所述的液体培养基为Bristol、Basal、BG-11、BBM或Kuhl培养基；优选为改良的Bristol、Basal、BG-11、BBM或Kuhl培养基；更优选为含有如下组分：10000mg/L葡萄糖，75mg/L K2HPO4，5mg/L FeCl3，25mg/L NaCl，0.061mg/L H3BO3，750mg/L NaNO3，25mg/LMgSO4·7H2O，25mg/L CaCl2·2H2O，0.287mg/L ZnSO4·7H2O，175mg/L KH2PO4，0.0025mg/LCuSO4·5H2O，0.169mg/L MnSO4·H2O，0.00124mg/L(NH4)6Mo7O24·7H2O。
步骤S1中所述的无氮含糖培养基含有如下组分：10000mg/L葡萄糖，75mg/LK2HPO4，5mg/L FeCl3，25mg/L NaCl，0.061mg/L H3BO3，25mg/L MgSO4·7H2O，25mg/L CaCl2·2H2O，0.287mg/L ZnSO4·7H2O，175mg/L KH2PO4，0.0025mg/L CuSO4·5H2O，0.169mg/LMnSO4·H2O，0.00124mg/L(NH4)6Mo7O24·7H2O。
步骤S1中所述的绿藻细胞的接种密度为2～3g/L。
步骤S1中所述的加入的化学诱导剂的终浓度为体积百分比0～0.1％(不包括0)；优选为将化学诱导剂溶于助溶剂获得含化学诱导剂的溶液。
所述助溶剂为水、乙醇或二甲亚砜。
步骤S1中所述的化学诱导剂可以为氧化类试剂，还原类试剂，醇类试剂，盐类试剂，代谢调控类试剂和有机酸类试剂中的至少一种；优选为2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)，过氧化氢(H2O2)，乙醇(EtOH)，丁基羟基苯甲醚(BHA)，2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，没食子酸丙酯(PG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，三甲基甘氨酸(GB)，原钒酸钠(SOV)，乙酰胆碱(ACE)，二氯苯基二甲脲(DCMU)，草甘膦(GPS)，莠去津(At)，丙酮酸(Py)，柠檬酸(Ct)，苹果酸(Ma)，α-酮戊二酸(Kt)，氯化镁(MgCl2，本发明简称Mg)和氯化钾(KCl)中的一种以上；更优选为过氧化氢(H2O2)，乙醇(EtOH)，2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，丁基羟基苯甲醚(BHA)，三甲基甘氨酸(GB)，莠去津(At)，二氯苯基二甲脲(DCMU)，草甘膦(GPS)，α-酮戊二酸(Kt)，柠檬酸(Ct)，苹果酸(Ma)，丙酮酸(Py)，氯化镁(MgCl2)和氯化钾(KCl)中的一种以上；最优选为丙酮酸(Py)。
所述的化学诱导剂的最高添加浓度(C1)依据种类而确定，然后在此基础上，将不同种类化学诱导剂的最高浓度进行稀释，用于配置不同数量的浓度梯度组(1至n组；n≥2)，浓度稀释倍数的范围为1至1000倍之间，具体浓度C1，C2，……Cn取值范围在最高添加浓度C1和C1/1000之间，即Cn＝(1～1/1000)C1。
所述的氧化类试剂的最高添加浓度为不高于64.5mg/L。
所述的还原类试剂的最高添加浓度为不高于6.61mg/L。
所述的醇类试剂的最高添加浓度为不高于体积百分比2％。
所述的盐类试剂的最高添加浓度为不高于12710mg/L。
所述的代谢调控类试剂的最高添加浓度为不高于1180mg/L。
所述的有机酸类试剂的最高添加浓度为不高于9600mg/L。
所述的2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)在诱导培养体系中的终浓度为2.7～27.1mg/L；优选为27.1mg/L。
所述的过氧化氢(H2O2)在诱导培养体系中的终浓度为32.3～64.5mg/L；优选为64.5mg/L。
所述的乙醇(EtOH)在诱导培养体系中的终浓度为体积百分比1.0～2.0％；优选为体积百分比2.0％。
所述的丁基羟基苯甲醚(BHA)在诱导培养体系中的终浓度为0.54～5.41mg/L；优选为5.41mg/L。
所述的2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)在诱导培养体系中的终浓度为0.66～6.61mg/L；优选为6.61mg/L。
所述的没食子酸丙酯(PG)在诱导培养体系中的终浓度为0.085～0.849mg/L；优选为0.849mg/L。
所述的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在诱导培养体系中的终浓度为0.2～1.8mg/L；优选为1.8mg/L。
所述的三甲基甘氨酸(GB)在诱导培养体系中的终浓度为590～1180mg/L；优选为1180mg/L。
所述的原钒酸钠(SOV)在诱导培养体系中的终浓度为92.0～185.0mg/L；优选为92mg/L。
所述的乙酰胆碱(ACE)在诱导培养体系中的终浓度为0.56～5.6μg/L；优选为5.6μg/L。
所述的莠去津(At)在诱导培养体系中的终浓度为21.6～215.7μg/L；优选为215.7μg/L。
所述的二氯苯基二甲脲(DCMU)在诱导培养体系中的终浓度为0.12～1.16mg/L；优选为0.12mg/L。
所述的草甘膦(GPS)在诱导培养体系中的终浓度为0.2～1.7mg/L；优选为0.2mg/L。
所述的α-酮戊二酸(Kt)在诱导培养体系中的终浓度为1.5～7.3g/L；优选为1.5g/L。
所述的柠檬酸(Ct)在诱导培养体系中的终浓度为1.9～9.6g/L；优选为9.6g/L。
所述的苹果酸(Ma)在诱导培养体系中的终浓度为1.3～6.7g/L；优选为1.3g/L。
所述的丙酮酸(Py)在诱导培养体系中的终浓度为0.9～4.3g/L；优选为4.3g/L。
所述的氯化镁(MgCl2)在诱导培养体系中的终浓度为1620～16200mg/L；优选为1.62g/L。
所述的氯化钾(KCl)在诱导培养体系中的终浓度为1280～12710mg/L；优选为12.71g/L。
步骤S1中所述的诱导培养的条件为：转速50～500rpm，培养温度20～30℃，采用白光光源，光照300±30μmol m-2s-1，培养时间12天以上；优选为：转速50～500rpm，培养温度26℃，采用白光光源，光照300±30μmol m-2s-1，培养时间12天以上。
步骤S1中所述的诱导培养为在微藻培养装置中进行诱导培养；更优选为在透明微孔板或类似薄层的微藻培养装置进行诱导培养。
步骤S2中所述的平均荧光强度值为采用流式细胞仪测定藻细胞在FL3通道(FL3:>670nm)的平均荧光强度值。
步骤S2中所述的测定优选为通过如下方法实现：将步骤S1中培养得到的诱导剂组佐夫色绿藻细胞和对照组佐夫色绿藻细胞分别离心洗涤后，加水稀释到0.6～2×106cells/mL，然后分别用过滤膜过滤，在流式细胞仪的通道FL3(FL3通道的光谱范围为>670nm)上检测藻细胞自发荧光的平均荧光强度值；其中，流式细胞仪分析的条件为：进样量为10000个细胞以上，进校流速控制为35μL/min，采用488nm激光器对藻细胞进行单色光激发。
所述的过滤膜优选为400目过滤膜。
所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，在步骤S3之后还包括复筛的步骤；具体如下：
(I)将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中，然后以步骤S3中获得的化学诱导物的最佳诱导浓度作为化学诱导物的浓度，对绿藻细胞进行培养，同时以不加入化学诱导剂为对照，得到诱导剂组绿藻细胞和对照组绿藻细胞；
(II)培养结束后测定诱导剂组绿藻细胞的油脂的含量H1以及对照组绿藻细胞的油脂的含量H2，和/或测定诱导剂组绿藻细胞的油脂的产量Y1以及对照组绿藻细胞的油脂的产量Y2；
(II)若Y1>Y2和/或H1>H2，则确定该化学诱导剂为可用于提高绿藻细胞的产油量的化学诱导剂。
步骤(I)中所述的绿藻细胞的接种密度为2～3g/L。
步骤(I)中所述的诱导培养的条件为：转速50～500rpm，培养温度20～30℃，采用白光光源，光照300±30μmol m-2s-1，培养时间12天以上；优选为：转速50～500rpm，培养温度26℃，采用白光光源，光照300±30μmol m-2s-1，培养时间12天以上。
步骤(I)中所述的诱导培养为在微藻培养装置中进行诱导培养；更优选为在透明微孔板或类似薄层的微藻培养装置进行诱导培养。
步骤(II)中所述的油脂的含量可通过测定绿藻细胞的总脂和/或脂肪酸含量获得。
所述的微藻细胞的总脂含量可采用有机溶剂提取法(有机试剂提取-称重法)测定。
所述的微藻细胞的脂肪酸含量可采用气相色谱法测定。
步骤(II)中所述的油脂的产量为通过测定绿藻细胞的总脂和/或脂肪酸产量获得。
所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，在步骤S3之后还包括用有机溶剂提取法(有机试剂提取-称重法)测定微藻细胞的总脂含量，和/或采用气相色谱法测定微藻细胞脂肪酸含量的步骤。
所述的有机溶剂为甲醇和二氯甲烷混合得到的溶剂；优选为甲醇和二氯甲烷按体积比3:1混合得到的溶剂。
所述的脂肪酸含量为采用安捷伦气相色谱-质谱联用仪进行测定。
所述的气相色谱测定的条件为：
选用高纯氦气作为载气，流速为1ml/min，样品不分流，进样量为0.2μL；
进样口温度为250℃，检测器温度为270℃；
程序升温条件为：柱温箱130℃保持1min，然后以5℃/min升高到200℃保持5min；
质谱的质量扫描范围为33～400amu。
所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法在培养绿藻细胞生产生物柴油原料油和/或食用型藻油中的应用。
所述的绿藻为色绿藻、小球藻、栅藻、衣藻和盐藻的至少一种；优选为佐夫色绿藻(Chromochloris zofingiensis)。
一种提高绿藻细胞产油量(总脂和脂肪酸)的诱导方法，包括如下步骤：将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中，然后加入化学诱导剂进行诱导培养，以提高绿藻细胞内总脂和脂肪酸含量；其中，
所述的化学诱导剂为过氧化氢(HO)，乙醇(EtOH)，2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，丁基羟基苯甲醚(BHA)，三甲基甘氨酸(GB)，莠去津(At)，二氯苯基二甲脲(DCMU)，草甘膦(GPS)，α-酮戊二酸(Kt)，柠檬酸(Ct)，苹果酸(Ma)，丙酮酸(Py)，氯化镁(MgCl2)和氯化钾(KCl)中的一种以上；更优选为丙酮酸(Py)。
所述的绿藻为色绿藻、小球藻、栅藻、衣藻和盐藻中的至少一种；优选为佐夫色绿藻(Chromochloris zofingiensis)。
所述的过氧化氢(HO)在诱导培养体系中的终浓度为32.3～64.5mg/L；优选为64.5mg/L。
所述的乙醇(EtOH)在诱导培养体系中的终浓度为体积百分比1.0～2.0％；优选为体积百分比2.0％。
所述的丁基羟基苯甲醚(BHA)在诱导培养体系中的终浓度为0.54～5.41mg/L；优选为5.41mg/L。
所述的2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)在诱导培养体系中的终浓度为0.66～6.61mg/L；优选为6.61mg/L。
所述的三甲基甘氨酸(GB)在诱导培养体系中的终浓度为590～1180mg/L；优选为1180mg/L。
所述的莠去津(At)在诱导培养体系中的终浓度为21.6～215.7μg/L；优选为215.7μg/L。
所述的二氯苯基二甲脲(DCMU)在诱导培养体系中的终浓度为0.12～1.16mg/L；优选为0.12mg/L。
所述的草甘膦(GPS)在诱导培养体系中的终浓度为0.2～1.7mg/L；优选为0.2mg/L。
所述的α-酮戊二酸(Kt)在诱导培养体系中的终浓度为1.5～7.3g/L；优选为1.5g/L。
所述的柠檬酸(Ct)在诱导培养体系中的终浓度为1.9～9.6g/L；优选为9.6g/L。
所述的苹果酸(Ma)在诱导培养体系中的终浓度为1.3～6.7g/L；优选为1.3g/L。
所述的丙酮酸(Py)在诱导培养体系中的终浓度为0.9～4.3g/L；优选为4.3g/L。
所述的氯化镁(MgCl2)在诱导培养体系中的终浓度为1620～16200mg/L；优选为1.62g/L。
所述的氯化钾(KCl)在诱导培养体系中的终浓度为1280～12710mg/L；优选为12.71g/L。
所述的绿藻细胞的接种密度为2～3g/L。
所述的活化为通过如下步骤实现：先将绿藻细胞接种到斜面固体培养基中进行培养，然后转接至液体培养基中进行循环往复振荡培养3～5天，得到活化的绿藻细胞；其中，所述的培养的条件均为：转速为50～500rpm，培养温度20～30℃(优选为26℃)，光照10～30μmol m-2s-1(优选为10μmol m-2s-1)，光暗周期为0:24(h)～24:0(h)，pH 6.0～7.0(优选为6.5)。
所述的液体培养基为Bristol、Basal、BG-11、BBM或Kuhl培养基；优选为改良的Bristol、Basal、BG-11、BBM或Kuhl培养基；更优选为含有如下组分：10000mg/L葡萄糖，75mg/L K2HPO4，5mg/L FeCl3，25mg/L NaCl，0.061mg/L H3BO3，750mg/L NaNO3，25mg/LMgSO4·7H2O，25mg/L CaCl2·2H2O，0.287mg/L ZnSO4·7H2O，175mg/L KH2PO4，0.0025mg/LCuSO4·5H2O，0.169mg/L MnSO4·H2O，0.00124mg/L(NH4)6Mo7O24·7H2O。
所述的诱导培养为在微藻培养装置中进行诱导培养；更优选为在透明微孔板或类似薄层的微藻培养装置进行诱导培养。
所述的无氮含糖培养基含有如下组分：10000mg/L葡萄糖，75mg/L K2HPO4，5mg/LFeCl3，25mg/L NaCl，0.061mg/L H3BO3，25mg/L MgSO4·7H2O，25mg/L CaCl2·2H2O，0.287mg/L ZnSO4·7H2O，175mg/L KH2PO4，0.0025mg/L CuSO4·5H2O，0.169mg/L MnSO4·H2O，0.00124mg/L(NH4)6Mo7O24·7H2O。
所述的诱导培养的条件为：转速50～500rpm，培养温度20～30℃，采用白光光源，光照300±30μmol m-2s-1，培养时间12天以上；优选为：转速50～500rpm，培养温度26℃，采用白光光源，光照300±30μmol m-2s-1，培养时间12天以上。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、为了弥补现有绿藻细胞产油能力(胞内总脂和脂肪酸含量)较低对其商业化应用的限制，以及化学诱导物的筛选评估技术费时费力等的不足之处，本发明提供了一种提高绿藻产油用(总脂和脂肪酸含量)化学诱导剂的筛选方法，获得了能有效提高佐夫色绿藻总脂和脂肪酸含量的化学诱导剂，建立的技术操作简便、快速准确，在藻基生物燃油和藻基营养油脂的研究与应用领域具有非常重要的应用价值。
2、本发明采用常规的微藻三角瓶培养和基于微孔板高通量的培养方法，结合高光无氮培养条件，实现了佐夫色绿藻细胞在化学诱导剂-高光低氮条件下的协同诱导培养，最终显著提高了佐夫色绿藻胞内的总脂和脂肪酸含量，可以显著改进或取代现有的利用微藻产油的生产方式，获得的富含藻油的佐夫色绿藻可用于生物能源炼制和新型食用油开发方面。
3、微藻在完全无氮培养基中进行化学诱导物的诱导培养，微藻细胞中叶绿素含量较高，其油脂(总脂和脂肪酸)含量也越高，两者呈现出正相关性，基于上述正相关性，本发明通过对胁迫诱导下微藻胞内叶绿素含量的快速检测评估，来间接反映出微藻胞内油脂含量，即本发明采用流式细胞仪来检测藻细胞内叶绿素的自发荧光强度(测定藻细胞在FL3通道的平均荧光强度值)，从而可以用来评估微藻细胞内的叶绿素含量，也就可以间接用于微藻完全缺氮-化学诱导物诱导培养过程中的油脂含量的快速批量监测。
4、本发明方法可对多种类型化学诱导剂进行批量筛选，以提高佐夫色绿藻油脂含量(总脂和脂肪酸)为目标，获得显效、低成本的诱导剂种类及其使用浓度，从而建立简单、有效、快速的诱导方法，为佐夫色绿藻生产油脂的技术开发提供创新技术支撑。
5、本发明采用基于叶绿素荧光的流式细胞仪测定在不同浓度的化学诱导剂诱导下培养获得的藻细胞叶绿素的自发荧光(以确定的微藻胞内叶绿素含量反映微藻胞内油脂含量)，从而初筛获得各种化学诱导剂的最佳的浓度，然后根据初筛获得的化学诱导剂的最佳浓度条件用于绿藻培养，再采用有机试剂提取-称重法和气质联用法等技术复筛来准确测定培养获得的藻细胞的油脂(总脂和脂肪酸)含量，从而确定确定能够显著提高佐夫色绿藻胞内总脂和脂肪酸积累量的化学诱导剂种类，实现了佐夫色绿藻细胞油脂的高效积累，并系统评估了该油脂应用于新型食用型藻油和可再生燃料原料油的潜力和经济效益，本发明可以显著改进或取代现有的利用微藻积累总脂以生产藻油的生产方式，可以大大提高藻油的生产效率，具有非常重要的应用价值和广阔的市场前景。
附图说明
图1是不同化学诱导剂对于佐夫色绿藻C.zofingiensis细胞在流式细胞仪FL3通道的平均荧光强度的影响图(FL3:>670nm；Ctl:对照组；D:二甲亚砜；E:乙醇；H:高浓度；L:低浓度)。
图2是不同化学诱导剂对佐夫色绿藻生物量的影响图(Ctl:对照组；D:二甲亚砜；E:乙醇)。
图3是不同化学诱导剂对佐夫色绿藻总脂积累量的影响图(Ctl:对照组；D:二甲亚砜；E:乙醇)。
图4是不同化学诱导剂对佐夫色绿藻脂肪酸含量的影响图(Ctl:对照组；D:二甲亚砜；E:乙醇)。
图5是不同化学诱导剂对佐夫色绿藻细胞内脂肪酸百分比组成的影响图(Ctl:对照组；D:二甲亚砜；E:乙醇)。
图6是不同化学诱导剂对佐夫色绿藻细胞生长和总脂积累量的影响效果的聚类分析图(Ctl:对照组；D:二甲亚砜；E:乙醇)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明开发一种提高佐夫色绿藻胞内油脂含量的诱导培养方法，采用基于微孔板的培养方法实现佐夫色绿藻细胞在不同化学诱导剂和高光无氮条件下的协同诱导培养，然后采用流式细胞仪进行快速检测评估和初步筛选，再采用验证实验准确测定佐夫色绿藻细胞内总脂含量，从而确定最佳的化学诱导剂及其最适浓度，最终显著提高了佐夫色绿藻胞内的总脂积累量，可以生产制备藻油等高价值化工原料。本发明可以显著改进或取代现有的利用微藻生产制备藻油的生产方式。
实施例1多种不同化学诱导剂诱导条件对佐夫色绿藻自发荧光影响的初筛实验
本实施例采用多种不同的化学诱导剂结合高光无氮胁迫条件对佐夫色绿藻(Chromochloris zofingiensis，美国菌种保藏中心ATCC 30412)细胞进行诱导胁迫培养，然后采用流式细胞仪测定了佐夫色绿藻细胞的在FL3通道(>670nm)的平均荧光强度值，通过快速检测评估从而初步筛选确定了有助于佐夫色绿藻细胞荧光强度值增加的化学诱导剂及其适宜浓度。
1.1菌种活化及种子液制备
将实验室中保存的佐夫色绿藻C.zofingiensis菌种转接到装有改良Bristol培养基(琼脂含量为1.5～2.0％(m/v)来配制固体斜面培养基)的斜面上进行培养，培养温度为26℃，光照为10μmol m-2s-1，光暗周期是24h:0h，并观察佐夫色绿藻生长情况。
用接种环将佐夫色绿藻藻苔接种到装有改良Bristol液体培养基的三角瓶中进行培养，在温度为26℃、光源强度为10μmol m-2s-1，光暗周期是24h:0h的恒温振荡摇床中，培养3～5天用作种子液。
其中所述的改良Bristol培养基(pH6.5)成分如下表1所示(单位为mg/L)：
表1液体培养基配方
组分 含量(mg/L) 组分 含量(mg/L) 组分 含量(mg/L)
葡萄糖 10000 NaNO<sub>3</sub> 750 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 175
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 75 MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 25 CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.0025
FeCl<sub>3</sub> 5 CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 25 MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.169
NaCl 25 ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.287 (NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.00124
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 0.061 / / / /
1.2佐夫色绿藻C.zofingiensis在多种化学诱导剂诱导条件下的诱导胁迫培养
1.2.1佐夫色绿藻C.zofingiensis诱导培养条件的初筛实验
将培养好的佐夫色绿藻种子液在3800×g离心力的离心机中离心2min，弃去上层培养基，并用无菌水重新悬浮洗涤后，再次离心去除上清液，将收集的佐夫色绿藻细胞采用改良的无氮含糖发酵Bristol培养基进行稀释重悬，控制佐夫色绿藻的细胞密度在2～3g/L之间。同时，向重悬藻液中加入不同种类的化学诱导剂，这些化学试剂分别用水、乙醇、二甲亚砜作为助溶剂配制母液，化学诱导剂在母液中浓度为培养基中最高终浓度的1000倍，然后将这些母液添加到培养基中，添加母液的浓度不超过0.1％(v/v)，控制化学诱导剂在培养基中终浓度如表2所示，同时以不添加化学诱导剂为对照。然后将重悬藻液分装到透明微孔板中，并置于微孔板振荡器中，一起放置于光照培养箱中进行诱导培养以积累脂类和脂肪酸。其中，改良的无氮含糖发酵Bristol培养基和表1中的配方相比，不同之处仅在于：葡萄糖为10g/L，NaNO3为0g/L，并且分别添加有不同浓度不同种类的化学诱导剂(见表2)。
培养条件为：转速为50～500rpm，温度为26℃、采用白色的荧光灯并排放置作为光源进行持续光照培养，控制微孔板表面的光照强度为300±30μmol m-2s-1以上，分别培养12天以上。
培养结束后，收集新鲜的佐夫色绿藻培养液，按照流式细胞仪测定荧光值的方法(如1.2.2所示)，快速测定佐夫色绿藻细胞在通道FL3的平均荧光强度值，用于对比分析不同化学加剂的诱导效果。
表2化学诱导剂及其在培养基的终浓度
Figure BDA0002402518750000111
1.2.2流式细胞仪分析法
佐夫色绿藻诱导培养结束后，获得新鲜的佐夫色绿藻细胞，然后采用流式细胞仪(Accuri C6,BD,USA)分析测定不同培养条件得到的佐夫色绿藻细胞的平均荧光强度值(Meanfluorescence intensity,MFI)。
本实施例采用的流式细胞仪，配备有50mW的空冷激光器(激发波长分别为488nm)，然后对FL3检测通道(FL3:>670nm)的平均荧光强度进行检测(3次重复)。
具体检测过程如下：将新鲜藻液在3800×g离心力下离心2分钟，然后用纯水洗涤离心两次后，用纯水将藻细胞密度稀释到0.6～2×106cells/mL，然后用400目过滤膜将藻细胞悬液过滤后直接用于流式细胞仪分析。
流式细胞仪分析中，流速设置为35μL/min，一共收集测定10000个细胞以上，主要采用488nm氩离子激光器对藻细胞进行单色光激发，然后在通道FL3检测藻细胞自发荧光的平均荧光强度值。测定结束后，采用系统自带Accuri Cflow数据处理软件进行统计分析佐夫色绿藻细胞在通道FL3的平均荧光强度值MFI。
1.3多种不同化学诱导剂诱导条件对佐夫色绿藻自发荧光影响的初筛实验结果
本实施例前期研究表明：佐夫色绿藻细胞在胞外缺氮胁迫缺氮条件下会导致胞内缺氮代谢，进而诱导藻细胞内积累大量的脂类，从而用来抵抗逆境条件。叶绿素是藻细胞内最主要的胞内含氮化合物，其含量高低可以直接反映出藻细胞胞内的缺氮程度，即在富氮条件下，藻细胞内叶绿素大量合成用于光合作用并贮存氮源，含量较高；在缺氮条件下，藻细胞内叶绿素则不断降解，供给胞内必要代谢活动，因而含量也显著降低。由此推测，佐夫色绿藻细胞内的叶绿素含量的高低，可以直接反映出细胞的缺氮胁迫程度，进而间接反映出藻细胞内的油脂积累程度。因此，本实施例通过测定佐夫色绿藻细胞内叶绿素的自发荧光强度(即流式细胞仪测定的FL3通道的平均荧光强度)来间接但快速评估佐夫色绿藻细胞的脂类积累程度，并以此作为筛选有助于藻油积累的化学诱导剂的快速筛选的基本依据。
通过1.2.1和1.2.2的佐夫色绿藻诱导培养方法和流式细胞仪测定方法，可以获得佐夫色绿藻细胞的叶绿素的平均荧光强度值的变化情况，结果如图1所示。采用对照组的藻细胞的平均荧光强度值作为基准，其它诱导条件得到的藻细胞荧光值与之相比获得荧光强度比值，从而便于直观展示不同化学诱导剂的诱导条件对于佐夫色绿藻细胞平均荧光强度值的影响。因此，本实施例以FL3(>670nm)通道荧光强度比值为依据，进而分析筛选出佐夫色绿藻细胞内叶绿素自发荧光强度最高的化学诱导剂及其浓度。
由图1中可知，F检验结果表明添加不同化学诱导剂的诱导胁迫条件对于佐夫色绿藻细胞在FL3通道的平均荧光强度比值均具有显著的影响(p<0.01)。在相同化学诱导剂诱导条件下，不同的浓度对于佐夫色绿藻细胞的平均荧光强度比值也存在明显影响。这里需要强调的是，对于不同的化学诱导剂而言，它们对于佐夫色绿藻胞内色素组分尤其是叶绿素的合成具有不同的影响效果，因此对于细胞自发荧光强度也存在差异。对于相同的化学诱导剂而言，不同的浓度剂量也会影响到佐夫色绿藻胞内的叶绿素的合成和细胞自发荧光强度，再考虑到细胞荧光不稳定，易淬灭，采用流式细胞仪进行微藻细胞荧光值的测定时可能存在一定的误差。因此，在初筛过程中，对于细胞自发荧光具有显著增加效果的化学诱导剂及其浓度易于判断和筛选，而对于荧光值影响不显著的化学诱导剂，为了避免假性实验结果，只要该荧光值不显著低于对照组，就作为备选的潜在化学诱导剂，进行后续的复筛验证，从而最终确定其诱导效果。
本实施例除了Kt和Ma外，其他均选择对于细胞自发荧光强度最高的添加浓度作为后续验证，其中Kt和Ma的两种浓度剂量的诱导效果无显著差异，从成本考虑选择，选择较低浓度作为最佳诱导剂量。由图中可知，在适宜的浓度条件下，化学诱导剂AAPH(2.7mg/L)、H2O2(64.5mg/L)、EtOH(2％，体积百分数)、BHA(5.41mg/L)、BHT(6.61mg/L)、PG(0.849mg/L)、EGCG(1.8mg/L)、GB(1.18g/L)、SOV(92mg/L)、ACE(5.6μg/L)、At(215.7μg/L)、DCMU(0.12mg/L)、GPS(0.2mg/L)、Kt(1.5g/L)、Ct(9.6g/L)、Ma(1.3g/L)、Py(4.3g/L)、Mg(1.62g/L)、KCl(12.71g/L)均有助于佐夫色绿藻细胞内FL3通道的平均荧光强度的增加，这表明这些化学诱导剂可能是潜在的佐夫色绿藻总脂积累的高效诱导物，因此这些化学诱导剂及其浓度作为初步筛选的条件，以备后续进一步验证。
综上可知，通过分析不同化学诱导剂诱导条件对于佐夫色绿藻细胞的荧光强度影响，本实施例基本完成了不同化学诱导剂及其浓度的诱导效果的初步评价和筛选，并用于后续的微藻生产积累藻油的复筛验证。
实施例2不同化学诱导剂对佐夫色绿藻生物量和总脂积累量的影响
考虑到采用不同的诱导胁迫条件进行佐夫色绿藻培养时，会导致细胞内积累的叶绿素比例和含量存在较在差异，而这会影响到FCM快速检测评估的稳定性。因此，为了提高初筛的准确性，本实施例以FCM快速评估的初步筛选结果为基础，结合验证实验最终确定最适宜的化学诱导剂及其最适浓度，即首先初筛确定每种化学诱导剂的适宜浓度，然后采用相同的诱导条件重新进行佐夫色绿藻细胞的培养验证实验，获得足够的藻细胞后采用有机溶剂提取称重和气相色谱法的传统定量方法，准确测定佐夫色绿藻细胞内总脂和脂肪酸含量，从而最终确定最佳诱导效果的化学诱导剂。
本实施例主要针对实施例1中初步筛选佐夫色绿藻细胞内叶绿素荧光值相对较高的化学诱导剂进行进一步验证，准确测定这些化学诱导剂对于佐夫色绿藻细胞生长和总脂积累量的影响，从而最终确定能够高效诱导佐夫色绿藻胞内总脂积累的化学诱导剂，最大限度提高佐夫色绿藻生产制备藻油的生产水平。
2.1菌种活化及种子液制备
将实验室斜面保存的佐夫色绿藻C.zofingiensis菌种按1.1所述的培养方法，培养3～5天用作种子液。
2.2佐夫色绿藻C.zofingiensis在不同化学诱导剂作用下的验证培养实验
2.2.1佐夫色绿藻在不同化学诱导剂作用下的验证培养实验
将培养好的佐夫色绿藻种子液按1.2.1所述的方法，离心收集佐夫色绿藻细胞，然后采用无氮含糖发酵培养基进行稀释重悬，控制佐夫色绿藻细胞起始密度为2～3g/L左右，同时向重悬藻液中分别加入1.3初筛实验中确定的化学诱导剂(以不添加化学诱导剂为对照)，然后将该藻液分装到不同的透明微孔板中，并置于微孔板振荡器中，最后一起放置于光照培养箱中，进行佐夫色绿藻C.zofingiensis培养积累总脂。本实施例是为了解决实施例1的批量筛选实验中佐夫色绿藻细胞样品量少，无法满足总脂样品测定的要求等问题，最终目的是获得足够的藻细胞，用于准确测定细胞内总脂和脂肪酸含量，从而最终确定这些化学诱导剂的诱导效果。
其中，无氮含糖发酵培养基采用改良Bristol培养基，其和表1中的培养基的不同在于：葡萄糖为10g/L，另外分别添加实验例1中的1.2实验中筛选的化学诱导剂及其最适浓度，具体为EtOH 2％(v/v)、AAPH 2.7mg/L、H2O2 64.5mg/L、BHA 5.41mg/L、BHT 6.61mg/L、PG0.849mg/L、EGCG 1.8mg/L、GB 1.18g/L、ACE 5.6μg/L、SOV 92.0mg/L、At 215.7μg/L、DCMU0.12mg/L、GPS 0.2mg/L、Kt 1.5g/L、Ct 9.6g/L、Ma 1.3g/L、Py 4.3g/L、MgCl2 1.62g/L、KCl 12.71g/L，从而制备得到含有不同化学诱导剂的无氮含糖发酵培养基。
培养条件为：转速为50～500rpm，温度为26℃、采用白色的荧光灯并排放置作为光源，控制微孔板表面的光照强度为300±30μmol m-2s-1，进行持续高光照射，培养12天以上。
培养结束后，收集佐夫色绿藻培养液，并离心收集藻泥细胞，冻干获得干藻粉，置于-20℃冰箱中进行冷冻保存，用于佐夫色绿藻胞内色素脂类含量的分析。佐夫色绿藻的生物量和脂类含量测定，采用2.2.2所述的测定方法进行分析。
2.2.2佐夫色绿藻细胞相关测定方法
2.2.2.1生物量的测定方法
佐夫色绿藻培养过程中的生物量的测定方法采用干重法进行测定。将取样获得的藻液，量取一定的体积(V)置于事前称重(m1)的离心管中，在6000rpm转速下离心1min收集下层藻细胞，然后加入纯水振荡悬浮后，重复离心洗涤2次，除去上清液，将含有藻泥的离心管置于60℃烘箱中烘干至恒重，测定藻粉和离心管的总重(m2)。将干藻粉重量与藻液体积，通过换算即可以获得佐夫色绿藻培养液中的生物量，计算公式为：生物量(g/L)＝(离心管和干藻粉总重量m2(g)–离心管重量m1(g))/藻液体积V(L)；生物量产率(g/L/d)＝生物量(g/L)/培养时间(d)。
2.2.2.2总脂测定方法
总脂含量测定采用有机溶剂提取法进行测定，简述如下：取冷冻干燥得到的藻粉，准确称取约100mg，置于冻存管中，再加入适量陶瓷珠，用甲醇/二氯甲烷混合试剂(1:3,v/v)作为有机提取试剂进行提取。首先在高速珠磨仪上进行快速振荡，再用液氮冷冻破碎以提取脂类，期间多次离心收集上层提取液，直到油脂提取完全为止。合并的所有上层提取液用氮气吹干，最后用天平称重，根据提取前重质量差，即可获得藻细胞内总脂含量(％,DW)，再根据测定的生物量(g/L)和培养时间(d)，可以计算得到总脂产量(mg/L)和产率(mg/L/d)。
2.2.2.3脂肪酸提取方法
佐夫色绿藻胞内脂肪酸采用皂化和甲酯化的方法进行提取并用于GC-MS检测分析，具体如下：在螺口试管中加入一定体积(100～600μL)的十九烷酸(C19:0)脂肪酸标准品(N5252，美国Sigma-Aldrich公司)溶液(浓度为1mg/mL，溶剂为二氯甲烷)，并氮气吹干溶剂后，再称量放入20mg左右藻粉，加入1mL饱和氢氧化钾-甲醇溶液，迅速摇匀，75℃水浴中加热10min，冷却至室温，加入2mL三氟化硼-无水甲醇溶液(1/2，v/v；其中三氟化硼浓度约为15％左右)，振荡混匀后75℃水浴加热10min，冷却至室温，再加入0.3mL饱和食盐水，最后加2mL正己烷混匀萃取脂肪酸甲酯，低速离心后取上层油层，采用有机滤膜过滤后置于气相进样小瓶中，用于气相质谱仪分析。
2.2.2.4气相质谱GC-MS测定法
脂肪酸含量测定方法采用安捷伦气相质谱联用仪进行分析，配以6890气相色谱仪、5975内置型MSD和高效毛细管柱(DB-23,30mm×0.25mm,0.25μm)。选用高纯氦气作为载气，流速为1ml/min，样品不分流，进样量为0.2μL。进样口温度为250℃，检测器温度为270℃。程序升温条件为：柱温箱130℃保持1min，然后以5C/min升高到200C保持5min。质谱的质量扫描范围为33-400amu。各峰型的鉴定采用NIST质谱库自动检索，对脂肪酸组分进行定性分析。定量分析采用C19:0为内标，以内标法测得各脂肪酸组分的定量分析。
2.2.2.5佐夫色绿藻藻油的性能参数分析方法
采用上述实验方法测定的脂肪酸占总脂肪酸的百分比含量(％)作为实验数据，通过经验公式计算得到佐夫色绿藻藻油的各项性能，用于估计该藻油的应用前景。各项性能参数的计算公式如下：
不饱和指数：UI＝USFA(％)/SFA(％)；
式中，UI：不饱和指数；USFA：不饱和脂肪酸的百分含量；SFA：饱和脂肪酸的百分含量；
不饱和度(DU,▽/mole)＝单不饱和脂肪酸(wt％)×1+双不饱和脂肪酸(wt％)×2+三不饱和脂肪酸(wt％)×3；
密度＝∑[(4.9/每种脂肪酸相对分子质量+0.0118×每种脂肪酸双键数+0.8463)×每种脂肪酸的含量(％)]×1000；
运动黏度＝Exp∑{每种脂肪酸的含量(％)×ln[2.496×ln(每种脂肪酸相对分子质量)－0.178×每种脂肪酸双键数－12.503]}；
碘化值＝∑[每种脂肪酸含量(％)×每种脂肪酸双键数(个)×254/每种脂肪酸相对分子质量]；
十六烷值＝5458/∑[每种脂肪酸含量(％)×560/每种脂肪酸相对分子质量]－碘化值×0.225+46.3；
冷滤点＝[十六碳脂肪酸含量(％)×0.1+十八碳脂肪酸含量(％)×0.5+二十碳脂肪酸含量(％)×1.5]×3.1417－16.477。
2.3不同化学诱导剂对佐夫色绿藻生物量和脂类积累的影响
通过本实施例2.2所述的诱导培养方法，可以获得不同化学诱导剂对于佐夫色绿藻细胞生长和脂类积累的影响，结果如图2～5所示。
在图2中，通过F检验可知，不同化学诱导剂对于佐夫色绿藻细胞生物量具有极显著影响(p<0.01)。化学氧化类添加物以及代谢抑制剂类化学诱导剂，对于佐夫色绿藻细胞生物量均具有显著的抑制作用(p<0.05)。当采用At进行诱导培养时，最低生物量仅为1.9g/L，同对照组相比显著降低了71.7％。此外，采用乙醇EtOH进行佐夫色绿藻细胞诱导胁迫培养时，也显著抑制了细胞的生长，培养结束后细胞生物量也仅为2.5g/L，同对照组相比显著降低了62.7％。而有机酸类化学诱导剂对于佐夫色绿藻细胞生长则具有显著促进作用(p<0.05)，尤其是α-酮戊二酸(Kt)可以显著提高佐夫色绿藻细胞生物量，最高达到9.9g/L，同对照相比增加了50％，对于佐夫色绿藻细胞生物量的促进效果非常明显。
在总脂含量积累方面，由图3可知，不同化学诱导剂对于佐夫色绿藻胞内脂类积累也具有显著的影响(p<0.05)。由前述研究表明，氧化还原类化学诱导剂可以促进佐夫色绿藻胞内虾青素含量的提高，同时对于脂类积累也有促进作用，但是其促进效果并不明显。采用过氧化氢H2O2进行诱导胁迫培养时，脂类含量达到60.0％以上，相对于对照而言增加程度有限，仅增加9.5％。结合前面可知，过氧化氢H2O2对于佐夫色绿藻胞内总脂含量的增加程度为33.8％，增加程度远高于脂类含量的增加程度，这表明过氧化氢H2O2可以调控佐夫色绿藻细胞内的碳源代谢，尤其是将更多的物质和能量用于合成脂类，从而抵抗氧化胁迫等逆境条件。对于脂类含量具有最大促进效果的是有机酸类化学诱导剂。由图3可知，Kt、Ct、Ma和Py对于脂类含量的增加，均具有显著的促进效果(p<0.05)，尤其是采用丙酮酸(Py)结合高光无氮进行胁迫培养时，佐夫色绿藻胞内脂类含量最大可以达到66.1％，相对于对照组而言，脂类含量增加了20.6％，促进效果比较显著。众所周知，脂类物质合成过程中，需要藻类细胞内大量的碳源转化合成，因此对于碳源等前体物的需求比较大。但是，当佐夫色绿藻细胞在高光无氮诱导胁迫条件下，细胞对于培养基中葡萄糖等碳源物质的同化利用速率受到极大影响，无法从培养基中获得并同化碳源，因此采用添加多种有机酸等化学诱导剂，易于吸收利用，有助于提高佐夫色绿藻细胞内三羧酸循环中的碳源代谢前体物，从而就可以显著提高佐夫色绿藻胞内脂类含量。
在总脂产量(g/L)和产率(mg/L/d)方面，采用丙酮酸(Py)诱导佐夫色绿藻细胞可以获得最大总脂含量，而总脂产量和产率也较高，分别达到5.51g/L和459.0mg/L/d。而采用α-酮戊二酸Kt进行诱导培养时，虽然总脂含量仅有59.9％，但是可以获得最大的总脂产量为5.95g/L，总脂产率最高可以达到496.0mg/L/d。这是本实施例研究中获得的脂类含量最高的结果，同时该总脂产率是目前佐夫色绿藻生产积累脂类的较高水平。本实施例的研究成果，对于目前利用微藻工业化生产藻油用作生物能源的原料具有非常重要的价值。
不同化学诱导剂对佐夫色绿藻胞内总脂肪酸积累量的影响效果如图4所示。由图可知，不同的化学诱导剂对于脂肪酸含量以及脂肪酸占总脂百分比含量均具有显著的影响(p<0.05)。在总脂肪酸占总脂的百分比含量方面，采用EtOH、BHT、PG、GB和SOV进行诱导培养时，可以获得相对较高的百分比含量，均超过60％以上。但是，在这些诱导条件下，脂肪酸占干重的含量却并未达到最大值。对总脂肪酸含量具有最大促进效果的化学诱导剂是有机酸，尤其是丙酮酸(Py)可以将佐夫色绿藻胞内总脂肪酸含量提高到330mg/g，增加效果显著(p<0.05)。其次是苹果酸(Ma)和柠檬酸(Ct)，总脂肪酸含量均达到300mg/g以上，而对于总脂含量具有最大促进效果的α-酮戊二酸(Kt)，总脂肪酸含量与对照组基本无差别。此外，氯化镁对于佐夫色绿藻胞内脂肪酸积累也具有重要的显著促进作用(p<0.05)，经过诱导培养后总脂肪酸含量达到292.6mg/g。虽然有机酸和无机盐可以显著提高总脂肪酸占干重的含量，但是获得的总脂肪酸占总脂的百分比含量基本维持在44.7～50.0％之间。结合前述的总脂积累量来看，佐夫色绿藻在有机酸和无机盐诱导过程中，总脂和总脂肪酸含量均呈现增加的趋势，总脂肪酸占总脂的百分比含量基本呈现稳定并略有增加的趋势。这说明在胁迫条件下，佐夫色绿藻胞内脂肪酸代谢与总脂积累是同步增加的，即甘油酯、糖脂、磷脂等脂类物质含量都在增加，从而维持了总脂肪酸在总脂中的百分比例含量的稳定。
图5为佐夫色绿藻胞内脂肪酸百分比组成的分析结果，由图中可知，采用不同的化学诱导剂对于脂肪酸组分具有显著的影响(p<0.05)，并且可以诱导佐夫色绿藻细胞大量积累脂肪酸，尤其是以十六碳和十八碳脂肪酸为主的脂肪酸。这些脂肪酸中，百分比含量最高的脂肪酸主要有四种，分别为油酸(C18:1)、棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。尤其是油酸(C18:1)，它是佐夫色绿藻胞内最主要的脂肪酸，其含量基本占到藻细胞内的总脂肪酸含量的40％左右。亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)是佐夫色绿藻胞内另外两种重要的脂肪酸，其含量分别占到总脂肪酸含量的15％和10％左右。以上这三种具有重要营养功效的不饱和脂肪酸共计占总脂肪酸含量的65％以上，与植物油的脂肪酸组分非常相近。
本实施例将该藻油中的脂肪酸组分和饱和度等指标参数计算整合如表3所示。由表可知，佐夫色绿藻细胞内的十六碳和十八碳脂肪酸占比达到96％以上，尤其是十八碳脂肪酸占比超过69％以上，是最主要的脂肪酸。佐夫色绿藻细胞在高光缺氮的对照组条件下培养时，MUFA和PUFA(多不饱和脂肪酸含量)比例要高于饱和脂肪酸(SFA)，并且经过丙酮酸(Py)诱导培养后，SFA比例进一步减少，而MUFA的占比会同步增加，但PUFA基本保持不变，SFA/MUFA/PUFA的比值基本保持在1：2：1，具有较好的均衡性。藻油中的最终的不饱和指数UI(USFA/SFA)比值也高达4.08，相对于对照而言增加了18.9％。不饱和度DU是衡量油脂质量的重要指标之一，本实施例获得的藻油中DU值稳定在1.16，这说明该藻油具有较好的稳定性和适用性。此外，人类膳食中需要定量补充PUFA，对于人体生理发育和正常代谢具有重要功能，尤其是n-3和n-6多不饱和脂肪酸，前者在人体内会主要用来合成EPA和DHA，分别对于降血脂、降血栓、提高智力，促进神经发育等具有重要生理功效；而n-6多不饱和脂肪酸用来合成花生四烯酸(ARA)，对于炎症反应和增加免疫力具有重要功效。日常膳食中对于n-3和n-6多不饱和脂肪酸要均衡补充，其比值不应超过4～6。本实施例中获得的藻油中n-3和n-6多不饱和脂肪酸的比值基本在1.68～2.23之间，这说明获得的藻油中脂肪酸组成比较均衡，非常适宜用作开发新型食用型藻油。
表3佐夫色绿藻胞内脂肪酸组分及饱和度分析
Figure BDA0002402518750000181
为了进一步分析评估佐夫色绿藻藻油用作生产生物燃料的原料油的可行性，本实施例依据藻细胞内的脂肪酸组分进行了进一步的参数整合计算，成功推测出了利用该藻油生产得到的生物柴油的关键性能参数，结果如表4所示。由表可知，采用佐夫色绿藻作为生物柴油的原料油进行生产制备生物柴油，在密度、碘化值、十六烷值和冷滤点这些重要性能指标方法，均能满足欧盟和中国的生物柴油国家标准。在运动粘度方面，推测可能是由于藻油的多不饱和脂肪酸的占比较高，从而导致制备获得的生物柴油的粘度较小，稍微低于中国生物柴油的国家标准的最低值1.9。如果采用饱和脂肪酸占比高的原料油进行中和调配，就可以满足生物柴油的国标要求。本实施例以上研究结果充分证实了佐夫色绿藻藻油可以作为生物柴油的原料油，在各项指标情况方面都能基本满足生物柴油的国际和国内的性能要求。
表4基于佐夫色绿藻胞内藻油制备的生物柴油的性能参数分析
Figure BDA0002402518750000191
综上，本实施例通过以上研究结果分析表明，佐夫色绿藻经过诱导培养后，可以积累大量的藻油，其中富含高价值的脂肪酸尤其是油酸、亚油酸和亚麻酸等，具有开发作为未来新型食用型藻油的潜在能力。同时，佐夫色绿藻胞内积累的藻油中主要以十六碳和十八碳脂肪酸为主，还非常适宜作为生产可再生燃料的重要原料油，从而取代现在日渐枯竭的化石燃料，这对于新型可再生能源行业的发展具有重要的促进作用。
本实施例的最重要的创新性价值在于，开发建立了一种基于叶绿素荧光的评估微藻总脂积累量的快速筛选检测技术，将该工艺技术用于筛选大批量的化学诱导剂，可以快速鉴定出目标物。同时，本实施例筛选获得的高效化学诱导剂，可以作为一种新的微藻培养和生物炼制的新工艺技术，实现佐夫色绿藻胞内总脂和脂肪酸的高效积累，培养获得的富含藻油的佐夫色绿藻在微藻生物能源炼制和新型食用型藻油开发方面具有非常重要的研究价值和广阔的应用前景。
效果实施例
1、为了突出展现本发明在佐夫色绿藻生产藻油方面的创造性成果价值，这里将本发明(方法同实施例2，化学诱导剂为丙酮酸(Py))获得的微藻生产总脂的技术水平与现有公开的技术方案的结果进行详细对比分析，结果如表5所示。
表5佐夫色绿藻生产积累总脂/甘油三酯(TAG)的文献综合对比
Figure BDA0002402518750000201
注：表中“～”表示“大约”，如“～8.0”表示“大约为8.0”；N/A：Not applicable。
由表5中可知，目前佐夫色绿藻积累脂类方面的研究主要是采用自养培养方式并在多种不同规格的光反应器中进行的。本发明则主要是采用混养培养方式进行培养，佐夫色绿藻C.zofingiensis可以利用有机碳源葡萄糖进行快速生长的特性，获得较高的生物量浓度，生长效率增加效果非常显著。但该藻种目前总脂积累量还偏低，基本在21～54.5％之间。而本发明采用专门用于微藻培养的微孔板培养装置，进行佐夫色绿藻的高光无氮胁迫培养，再结合不同化学诱导剂的高效诱导，可以将佐夫色绿藻胞内总脂含量显著提高，最高达到66.1％，绿藻胞内总脂产量和产率，最高可以达到5500mg/L和459.0mg/L/d。这是目前文献报道的较高水平，这也就是本发明技术方案最大的创造性价值之一，显著地提高了现有佐夫色绿藻生产积累总脂的生产水平，可满足工业化规模化生产的要求。培养获得的富含藻油的佐夫色绿藻在微藻生物能源炼制和新型食用型藻油开发等产业化方面具有非常重要的研究价值和广阔的应用前景。
本发明技术方案的另一个创造性贡献在于，成功地开发了一种基于叶绿素荧光的评估微藻总脂积累量的快速筛选检测技术，将该工艺技术用于筛选大批量的化学诱导剂，可以快速鉴定出目标物，将这些化学诱导剂用于佐夫色绿藻的诱导胁迫培养，可以实现总脂和脂肪酸的高效积累。本专利技术方案具有简单可行，稳定可靠的特点，在微藻诱导胁迫条件的批量筛选评估方面有着重要的应用潜力。
2、在上述实施例2中，不同化学诱导剂的诱导胁迫培养，对于佐夫色绿藻细胞生长和脂类积累具有不同的诱导效果。对于针对这些不同化学诱导剂的诱导效果进行综合对比归纳，本实施例采用系统聚类分析技术对不同化学诱导剂的诱导胁迫效果进行分析，依据佐夫色绿藻细胞的生长和脂类含量及产量等数据为依据，采用统计分析软件SPSS进行系统聚类分析，采用组间联接的聚类方法，度量标准为Euclidean距离，聚类树状图如图6所示。由图中可知，当聚类标定距离为5～10时，基本可以依据其不同的诱导效果将化学诱导剂分为四类，分别是对照组及其类似的化学诱导剂(如AAPH、EGCG、BHA等)、促进佐夫色绿藻细胞生长和总脂积累的化学诱导剂(如Ma、Py、Ct和Kt等)、抑制佐夫色绿藻细胞生长和总脂积累的化学诱导剂(如At和DCMU)、抑制佐夫色绿藻细胞生长但对总脂积累抑制程度较小的化学诱导剂(如EtOH和GPS)。因此，为了获得最大的总脂生产效率，就可以考虑选择有机酸等化学诱导剂如Ma、Py、Ct和Kt可以获得最大的生物量和总脂产量。
但是，在实际生产中，化学诱导剂的选择不仅仅要考虑最终的诱导效果，还需要考虑化学诱导剂的经济成本和操作便利性。为此，本发明针对不同化学诱导剂诱导佐夫色绿藻高效积累油脂的1000L规模化放大培养的经济成本进行了分析核算，综合考虑不同化学诱导剂的成本以及色绿藻胞内油脂的单位增加值的成本，从而希望能够获得经济且高效的化学诱导剂，实现佐夫色绿藻胞内油脂的高效积累，具体实验结果如表6所示。由表可知，不同化学诱导剂的价格和使用量之间存在着显著的差异，因此化学诱导剂的总成本也就存在重要差异，其中成本最高的就是有机酸类的化学诱导剂。虽然这些物质，可以获得最大的色绿藻生物量和油脂产量，但是单位藻油增加值的成本最高达到460元/公斤，显然采用有机酸来诱导色绿藻生产积累藻油是不现实的。最具有经济价值的化学诱导剂就是ACE、BHT和BHA，这些化学诱导剂的单位增加量的成本基本都在0.01～0.27元/公斤，成本非常低。因此，选择BHA、BHT、ACE、KCl和MgCl2等也可以获得较高的总脂产量，基本达到363.5mg/L/d的较高水平。虽然这些化学诱导剂的诱导效果相比于有机酸类化学诱导物的效果要低，但是从经济方面考虑，这些物质比较便宜，易于添加，具有较好的性价比，非常适宜用作佐夫色绿藻胞内油脂的高效诱导。
综上，本发明通过系统性聚类分析等，全面归纳评估了不同化学诱导剂的诱导作用效果及其应用的经济性和现实性，对于更好地指导佐夫色绿藻细胞生长和总脂的高效生产具有非常重要的意义。
表6不同化学诱导剂诱导佐夫色绿藻高效积累油脂的1000L规模化培养的经济成本分析
Figure BDA0002402518750000211
Figure BDA0002402518750000221
注：表中每种化学诱导剂的单价来源于2019年12月的阿里巴巴采购平台网站(www.1688.com)；培养浓度为筛选得到的不同化学诱导剂的最佳处理浓度；藻油增加量的计算是依据实施例2和图3中的每种化学诱导剂对于藻细胞内总脂的增加量，再按照1000L的培养规模计算得来的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、初筛诱导培养：将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中并分成n份，然后分别加入浓度为C1，C2……Cn的化学诱导剂进行诱导培养，依次得到诱导剂组绿藻细胞A1，A2……An，同时在相同条件下以不加入化学诱导剂为对照，得到对照组绿藻细胞；其中n ≥ 2，且为整数；浓度C1> C2……>Cn；
S2、MFI值测定：采用流式细胞仪分别测定步骤S1中得到的诱导剂组绿藻细胞A1，A2……An以及对照组绿藻细胞内叶绿素的平均荧光强度，依次得到诱导剂组绿藻细胞的平均荧光强度值MFI1、MFI2……MFIn，以及对照组绿藻细胞的平均荧光强度值MFI0；
S3、初筛判断：
①若MFI1 ≥ MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C1时能够提高绿藻细胞内产油量，反之，若MFI1＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C1时不能提高绿藻细胞内产油量；同理，若MFI2≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C2时能够提高绿藻细胞内产油量，若MFI2＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C2时不能提高绿藻细胞内产油量；以此类推，若MFIn≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cn时能够提高绿藻细胞内产油量，反之，若MFIn＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cn时不能提高绿藻细胞内产油量；
和/或，
②将MFI1、MFI2……MFIn进行排序，取最大值，命名为MFIx，并获得与MFIx相对应的化学诱导剂的浓度，命名为Cx；若MFIx≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cx时能够提高绿藻细胞内产油量，以该浓度为化学诱导剂的最佳诱导浓度；若MFIx＜MFI0，则说明该化学诱导剂对绿藻细胞产油量无诱导刺激作用效果；
步骤S1中所述的绿藻为佐夫色绿藻；
步骤S1中所述的化学诱导剂为过氧化氢，丁基羟基苯甲醚，2,6-二叔丁基对甲酚，三甲基甘氨酸，原钒酸钠，草甘膦，丙酮酸，柠檬酸，苹果酸，α-酮戊二酸，氯化镁和氯化钾中的一种以上；
步骤S2中所述的平均荧光强度值为采用流式细胞仪测定藻细胞在FL3通道的平均荧光强度值；其中，FL3通道的光谱范围为> 670 nm；
所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，在步骤S3之后还包括复筛的步骤；具体如下：
（I）将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中，然后以步骤S3中获得的化学诱导物的最佳浓度作为化学诱导物的浓度，对绿藻细胞进行培养，同时以不加入化学诱导剂为对照，得到诱导剂组绿藻细胞和对照组绿藻细胞；
（II）培养结束后测定诱导剂组绿藻细胞的油脂的含量H1以及对照组绿藻细胞的油脂的含量H2，和/或测定诱导剂组绿藻细胞的油脂的产量Y1以及对照组绿藻细胞的油脂的产量Y2；
（II）若Y1> Y2和/或H1 > H2，则确定该化学诱导剂为可用于提高绿藻细胞的产油量的化学诱导剂；
步骤S1中所述的绿藻细胞的接种密度为2~3 g/L；
步骤S1中所述的诱导培养的条件为：转速50~500 rpm，培养温度20~30 ˚C，采用白光光源，光照300 ± 30 μmol m-2 s-1，培养时间12天以上。
2.根据权利要求1所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于：
步骤（I）中所述的绿藻细胞的接种密度为2~3 g/L；
步骤（I）中所述的诱导培养的条件为：转速50~500 rpm，培养温度20~30 ˚C，采用白光光源，光照300 ± 30 μmol m-2 s-1，培养时间12天以上；
步骤（II）中所述的油脂的含量为通过测定绿藻细胞的总脂和/或脂肪酸含量获得；
步骤（II）中所述的油脂的产量为通过测定绿藻细胞的总脂和/或脂肪酸产量获得。
3.根据权利要求1所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于：
步骤S1中所述的加入的化学诱导剂的终浓度为体积百分比0~0.1%。
4.根据权利要求1所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于：
所述的过氧化氢在诱导培养体系中的终浓度为32.3 ~ 64.5 mg/L；
所述的丁基羟基苯甲醚在诱导培养体系中的终浓度为0.54 ~ 5.41 mg/L；
所述的2,6-二叔丁基对甲酚在诱导培养体系中的终浓度为0.66 ~ 6.61 mg/L；
所述的三甲基甘氨酸在诱导培养体系中的终浓度为590 ~ 1180 mg/L；
所述的原钒酸钠在诱导培养体系中的终浓度为92.0~185.0 mg/L；
所述的草甘膦在诱导培养体系中的终浓度为0.2 ~ 1.7 mg/L；
所述的α-酮戊二酸在诱导培养体系中的终浓度为1.5 ~ 7.3 g/L；
所述的柠檬酸在诱导培养体系中的终浓度为1.9 ~ 9.6 g/L；
所述的苹果酸在诱导培养体系中的终浓度为1.3 ~ 6.7 g/L；
所述的丙酮酸在诱导培养体系中的终浓度为0.9 ~ 4.3 g/L；
所述的氯化镁在诱导培养体系中的终浓度为1620 ~ 16200 mg/L；
所述的氯化钾在诱导培养体系中的终浓度为1280 ~ 12710 mg/L。
5.根据权利要求1所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于：
步骤S1中所述的活化为通过如下步骤实现：先将绿藻细胞接种到斜面固体培养基中进行培养，然后转接至液体培养基中进行循环往复振荡培养3~5天，得到活化的绿藻细胞；其中，所述的培养的条件均为：转速为50~500 rpm，培养温度20~30 ˚C，光照10 ~30 μmol m-2s-1，光暗周期为0: 24~ 24 : 0，pH 6.0～7.0；所述的液体培养基为Bristol、Basal、BG-11、BBM或Kuhl培养基；
步骤S1中所述的无氮含糖培养基含有如下组分：10000 mg/L葡萄糖，75mg/L K2HPO4，5mg/L FeCl3，25 mg/L NaCl，0.061mg/L H3BO3，25mg/L MgSO4·7H2O，25mg/L CaCl2·2H2O，0.287mg/L ZnSO4·7H2O，175mg/L KH2PO4 ，0.0025mg/L CuSO4·5H2O，0.169 mg/L MnSO4·H2O，0.00124 mg/L (NH4)6Mo7O24·7H2O。
6.权利要求1～5任一项所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法在培养绿藻细胞生产生物柴油原料油和/或食用型藻油中的应用，其特征在于：所述的绿藻为佐夫色绿藻。
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