CN116891806B - 一种降低雨生红球藻死亡率的预胁迫处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降低雨生红球藻死亡率的预胁迫的处理方法，包括以下步骤：雨生红球藻经过对数生长期扩增达到一定生物量后，在进入雨生红球藻虾青素积累阶段之前，对雨生红球藻进行预胁迫处理，所述预胁迫处理是指调整培养体系包括光谱参数为波长范围430‑490nm和620‑700nm的特征峰。本发明通过对雨生红球藻培养体系中生态因子的调整，使其中90％以上的细胞能够在短时间内脱离鞭毛，增厚细胞壁并同步进入到可积累虾青素的理想不动细胞状态，且死亡率小于3％，从而达到降低雨生红球藻胁迫虾青素积累阶段的初期细胞死亡率，从而减少藻液中有机质的产生，实现降低污染、缩短雨生红球藻积累虾青素周期、提高生产效率、提高产品品质、产量和稳定性的目的。

Description

一种降低雨生红球藻死亡率的预胁迫处理方法
技术领域
本发明涉及藻类生物技术领域，具体涉及一种降低雨生红球藻死亡率的预胁迫处理方法。
背景技术
大规模培养雨生红球藻是目前公认的生产天然虾青素的最佳来源。人工培养雨生红球藻来获得高含量的虾青素一般分为两个培养阶段：首先大量扩培雨生红球藻细胞，获得足够的生物量，这个过程需要提供适合细胞营养生长和分裂增殖所需的最佳条件；而后通过制造不利的内、外部条件来胁迫诱导细胞积累虾青素，进入虾青素富集阶段。常见所施加的不利条件包括营养匮乏、高光、高温等，如专利：一种培养用于制造虾青素的红球藻属生物的方法(公开号：CN108350478A)公开了一种附着式的雨生红球藻培养方法，方法分为两步，第一步初始培养是将排列在基材表面的细胞暴露于低光能下培养，第二步将细胞暴露于相对前一步骤更强的光能下，诱导虾青素的合成。还有以加入化学试剂进行雨生红球藻产虾青素诱导的方法，如专利：一种雨生红球藻的培养方法(公开号：CN109609385A)根据雨生红球藻生长阶段和诱导阶段的培养特点，在基本培养液的基础上，向生长阶段培养液中加入NaHCO3、氨苄青霉素、维生素B12，而在诱导阶段加入NaAc、赤霉素等，以提高雨生红球藻的产量及虾青素含量。另有利用茉莉酸、油菜素内酯、黄腐酸、萘乙酸等植物激素来诱导雨生红球藻累积虾青素，如专利CN101974600A、CN101974599A、CN109679853A、CN107338194A等。
雨生红球藻对环境变化非常敏感,在营养生长期内抵抗细菌和原生动物污染的能力较差,而在极端环境下则又失去繁殖能力,不易建立稳定、高效的生产技术体系。培养雨生红球藻生产虾青素，在藻种、光生物反应器的设计、细胞高密度培养条件、虾青素积累的生态调控技术等方面具有相当的技术难度。由于雨生红球藻细胞积累虾青素的过程本身即是藻类细胞对不良环境条件的适应性保护，因此，当人们根据这一原理施加诱导压力时，不管以上述何种方式，都会对细胞的正常生长造成抑制，打乱细胞原有的生命节奏和代谢进程造成大量细胞死亡，死亡细胞不仅会影响最终的产量，还会由于细胞裂解有机物释放而引起微生物、原生动物等污染生物的快速繁殖影响培养过程，严重的会导致养殖失败。
因此，如何在胁迫诱导过程中既快速、顺利地完成细胞转红，又尽可能地减少压力因子对细胞的损伤，降低细胞的死亡率是在雨生红球藻养殖中的一个不可忽视的问题。现有技术尚未就这一问题提出明确概念和操作方法。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明在雨生红球藻分段式养殖的藻细胞培养阶段末期，细胞进入到虾青素积累阶段之前，增加一个中间的预胁迫处理过程，所述预胁迫方法是指调整介于雨生红球藻养殖中的扩增阶段和虾青素积累阶段之间的培养体系的外部条件。通过调整培养条件，使得藻细胞以更优异的状态进入虾青素积累阶段，以达到缩短虾青素积累的生产周期，实现养殖体系中的细胞同步化发展，降低由于人工胁迫条件导致的细胞死亡率、避免污染的目的，有利于在大规模生产中提高产品的品质、产量和生产过程的稳定性。
现有技术往往采用日光灯或太阳光作为胁迫处理的光源，由于其光谱较杂，对藻细胞有强杀伤性的波长范围的光能量较高，而适合用于胁迫的波长范围的光能量不足，往往导致胁迫过程藻细胞死亡率高，鉴于这点，本发明引入了预胁迫阶段，并对雨生红球藻对光谱各波长的适应性进行了系统性研究，找出了430-490nm和620-700nm的两个特征峰，能够在预胁迫中起到最佳效果，在预胁迫处理后，能够在高效降低死亡率的基础上不影响生产效率。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种降低雨生红球藻死亡率的预胁迫处理方法，其特征在于，将经过对数生长期扩增阶段的雨生红球藻进行预胁迫；所述预胁迫的外部条件包括：光谱参数包括波长范围为430-490nm和620-700nm的特征峰。
进一步的，所述经过对数生长期扩增的雨生红球藻的细胞密度为30-40×104cells/mL。所述对数生长期是本领域常用概念，即藻类细胞快速生长繁殖的阶段，就本申请而言，一般是指雨生红球藻快速生长后，藻细胞密度在30×104cells/mL以上，即当过对数生长期扩增的雨生红球藻的细胞密度高于30×104cells/mL时，可进行本发明雨生红球藻积累虾青素预胁迫处理。
进一步的，所述波长范围为430-490nm和620-700nm的特征峰，两者的光强比值为0.1-1:1。
在一些方式中，所述波长范围为430-490nm和620-700nm的特征峰，两者的光强比值为0.7:1。
进一步的，所述预胁迫处理方法的外部条件还包括：光照强度为1×104cells/mL细胞密度藻液满足300-400Lux光强。
进一步的，所述预胁迫处理方法的外部条件还包括：光周期为L:D为16-18：6-8。
在一些方式中，光周期为L:D为16：8。
进一步的，所述预胁迫处理方法的光源采用光生物反应器。
进一步的，所述预胁迫处理方法的外部条件还包括：温度为26-28℃，pH为8.0-8.5。
在一些方式中，温度取28℃，pH取8.2。
进一步的，所述预胁迫处理方法的处理时间为24-36小时。
在一些方式中，所述预胁迫处理方法的处理时间为32小时。
经过预胁迫处理后90％以上的藻细胞在短时间内能够达到进入虾青素积累阶段的状态，死亡率小于3％；所述预胁迫处理完成并进入虾青素积累阶段的状态是指90％以上的藻细胞能够出现以下特征中的至少两个：a、原游动细胞失去鞭毛，变为不动细胞；b、细胞壁有明显加厚；c、细胞中心开始发红积累少量虾青素。
优选地，90％以上藻细胞还能够和/或出现以下特征：d、细胞由原水滴形变为球形；e、细胞体积增大且直径由20-25μm增加至30-40μm。
所述对数生长期是本领域常用概念，即藻类细胞快速生长繁殖的阶段，就本申请而言，一般是指雨生红球藻快速生长后，藻细胞密度在30×104cells/mL以上，即当过对数生长期扩增的雨生红球藻的细胞密度高于30×104cells/mL时，可进行本发明雨生红球藻积累虾青素预胁迫处理。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了一种用于对数生长期扩增阶段和虾青素积累阶段之间的预处理方法，即预胁迫阶段，预胁迫处理通过调整培养体系的外部条件对藻细胞进行压力适应性诱导，从而解决现有技术中直接进入正式催红阶段细胞这种养殖方法中存在的细胞损伤问题，预胁迫能够降低诱导初期细胞的死亡率，保证生产产量和过程的稳定性；避免了由于死亡细胞裂解所带来的外源如原生动物、微生物等的污染，极大降低了生产失败的风险，提高了产品的品质。
2、本发明通过多次实验筛选出适应藻细胞预胁迫的外部条件，降低正式胁迫阶段初期的藻细胞死亡率，这是因为，现有技术中不经过预胁迫的细胞在直接进入正式催红诱导时，会由于迅速进入催红的胁迫环境，藻类的养殖环境发生急变化，各个细胞个体的表现差异较大，有的能够迅速形成厚壁细胞开始累积虾青素，有的会出现抑制甚至裂解死亡，条件改变过于剧烈，不利于细胞整体水平的一致和后续得到稳定的产量，尤其是生物量指标，而本发明中经过预胁迫处理的细胞通常细胞大小较为一致，死亡率低，从而达到采收的生物量高的效果，现有技术中直接进入胁迫阶段时，前期细胞的死亡率根据诱导压力和方式的不同，死亡率至少在30％以上，而本发明中经过预胁迫的藻细胞由于养殖条件变化而引起的死亡率基本可降为3％以下。
3、本发明提供的预处理方法对于那些对外部环境条件变化较为敏感，能够快速、高含量累积虾青素，但自身抗性较差、容易由于条件变化而引起损伤或死亡的藻株具有格外重要的意义，可以扬长避短，使具有快速和高含量累积虾青素的藻株得到生产应用；同时，本发明对在雨生红球藻虾青素诱导过程中所采用的诱导方式也起到了较好的拓展作用，可以在采用较为强烈而效果显著的诱导方式时，最大程度地缓解细胞由于诱导压力而导致的细胞死亡现象。
附图说明
图1为预胁迫处理前的雨生红球藻细胞显微镜成像图；
图2为预胁迫处理后的雨生红球藻细胞显微镜成像图；
具体实施方式
以下结合具体实施例和说明书附图对本发明雨生红球藻积累虾青素预处理的方法做进一步解释说明，但以下实施例的内容不应理解为是对本发明保护范围的限制。若无特别限定，本发明实施例采用试剂均可商购得到。
下述实施例使用的雨生红球藻藻种原种均购自武汉水生所，各项数据测试方式如下：
下述死亡率均为雨生红球藻虾青素生产期进行胁迫后的死亡率，细胞死亡率的测试是利用藻类计数框和计数器进行，统计死亡细胞在总细胞中的占比，计数框共100微升容量，分100个计数小格，点样后藻液细胞分布均匀，在显微镜下随机选取25-50格统计，每格统计指标包括：总细胞数、正常细胞、死亡细胞、预胁迫成功细胞(至少具有失去鞭毛；细胞壁加厚；细胞中心发红三个特点中的两项以上)。其中死亡细胞是指细胞裂解或内部呈弥散状态的细胞。细胞死亡率为：死亡细胞数量÷总细胞数×100％。
细胞不动率的计算与细胞死亡率相似，细胞不动率为：预胁迫成功细胞(至少具有失去鞭毛；细胞壁加厚；细胞中心发红三个特点中的两项以上)数量÷总细胞数×100％。
细胞直径利用藻类计数框、计数器和测微尺进行，计数框共100微升容量，分100个计数小格，点样后藻液细胞分布均匀，在显微镜下随机选取25-50格统计，利用测微尺测定细胞直径，同时计数，取平均数即为细胞平均直径。
虾青素含量测定以液相色谱法得到，采用试管分散机破碎细胞，并用甲醇：二氯甲烷＝3:1溶液为提取液对其中的色素成份进行充分的提取，提取液经过0.1mol/L氢氧化钾甲醇溶液皂化4h后上机测定，色谱条件设置为：柱温25℃，进样量10ul，流速1ml/min，波长476nm，流动相为甲醇：二氯甲烷：乙腈：水＝85：5：5：5的混合溶液，C18色谱柱。液相色谱标准品购自Sigma公司。
细胞干重测试为采用烘箱105℃干燥2.5h至恒重后，转移到干燥器中冷却至室温，并用电子分析天平称取得到数据，计算公式为W＝(m2-m1)/v,式中，w为干重数据，m1为容器重量，m2为容器和藻液干燥后的总重量，v为取样藻液的体积。
实施例1：包含预胁迫处理的雨生红球藻生产虾青素的养殖方法
1、在藻液中接入藻种
1.1设备准备
本实施例采用板式内置光源光生物反应器及配套的探测、控制装置为雨生红球藻的培养系统，消毒培养系统，含管道、阀门等全部接触培养的装置，校正各监控探头和辅助装置，选用了500L和1000L两种体量的罐体，其中500L体量的罐体用于对数生长期扩增阶段和预催红阶段，1000L罐体用于虾青素积累阶段，二者间通过管道阀门连接。500L罐体的培养系统准备完毕后，加入纯净水至水位线，打开气体流量计泵入气体。500L生物反应器设备参数设置为：光照强度6000Lux，光周期L：D为12：12，温度控制21-26℃，pH控制在7.0-7.5，通入气体为压缩空气和二氧化碳的混合气体，其中二氧化碳占通入气体的3.5％，气体流量为4m3/h。
1.2培养液配制
培养基采用优化的雨生红球藻养殖配方，生产时按照比例在500L生物反应器中依次加入母液(母液为高浓度的营养盐溶解液，依据反应器内所需要的浓度按比例加入反应器)并持续充气搅拌，使最终培养液中各营养物质的浓度为硝酸钠0.15g/L、磷酸氢二钾7.5×10-3g/L、磷酸二氢钾1.75×10-2g/L、硫酸镁3.7×10-2g/L、氯化钙1.9×10-2g/L、硼酸1.14×10-2g/L、硫酸锌8.82×10-3g/L、氯化锰1.44×10-3g/L、钼酸钠1.2×10-3g/L、硫酸铜1.57×10-3g/L、硝酸钴4.9×10-4g/L、乙二胺四乙酸二钠5.0×10-2g/L、硫酸亚铁4.98×10-3g/L。
1.3接入藻种
首先筛选藻种，选取的藻种具有增殖快速，对外界条件刺激敏感，累积虾青素启动快速，最终细胞干重和虾青素含量指标较高的特点。实操中通过显微镜镜检筛选藻种，镜检后筛选细胞游动活泼，具有明显的趋光性，细胞内色素体饱满，细胞大小适中，直径平均值在25μm的藻细胞作为藻种，并确保培养体系中无污染物，其次将初始密度2×104cells/mL的藻种接入母液中，接种结束后实测细胞密度为2.41×104cells/mL。
2、对数生长期扩增阶段
藻种接入后进行对数生长期扩增培养，培养条件为上述1.1中500L生物反应器的设备参数，根据pH探头检测到的培养体系酸碱度数值自动启动和关闭二氧化碳气管阀门，当培养体系中pH高于预设值(7.0-7.5)时，二氧化碳通入装置启动，当体系中pH降到设定值时，二氧化碳通入停止，压缩空气和二氧化碳均经过前端无菌过滤和干燥处理，每日取样镜检，观察细胞生长状态，直至第4天镜检发现细胞分裂旺盛，可见多个细胞分裂现象和多数新生细胞，细胞游动活泼、色素体饱满、培养体系干净无污，且第4天的细胞计数结果为35.2×104cells/mL，表示此时可进入预催红阶段。
3、预胁迫处理方法(预催红阶段)
对数生长期扩增完成，进入预催红阶段。预催红阶段仍然在原对数生长期扩增阶段的培养体系中进行，即仍在500L生物反应器中进行，将生物反应器的外部条件调整至：光源采用光谱参数为波长范围430-490nm和620-700nm的特征峰且两者的光强比值为0.7:1，光照强度12000Lux，光周期L：D为16：8，温度控制在26-28℃，pH控制在8.0-8.2；此处温度选为28℃，pH控制为8.2。在此条件下培养36小时后取样镜检多数细胞，当镜检时80％以上藻细胞出现以下三个特征中的至少两个即为完成预催红阶段，三个特征分别为：a.原游动细胞失去鞭毛，变为不动细胞；b.细胞壁有明显加厚；c.细胞中心出现虾青素积累现象。特征a、b、c作为预催红是否完成的主要判断指标，还有两个辅助指标，分别为：d.细胞由原水滴形变为球形；e.细胞体积增大，细胞直径由20-25μm增加至30-40μm。36h后观察达标即完成预催红，如未达标则继续养殖并12h检测一次，直至达标为止；
在培养36小时后镜检时的藻细胞表现出以下特征：细胞基本无分裂现象，新生细胞数量少，游动细胞比例大幅降低，对数生长期扩增阶段中绿色细胞占总细胞的比例由原87％降为18％；同时，80％以上的藻细胞失去鞭毛，变为不动细胞，同时，细胞体积增大，细胞直径由平均25μm增加至30μm，其中出现部分超过40μm的细胞，约占总细胞比例7％，细胞外形由原来多数的水滴形变为现在的球形，细胞的胞壁镜下清晰可见，出现明显加厚，部分细胞中心变红的现象。上述特征表明藻细胞可以结束预催红阶段，进入下一步的虾青素积累阶段。
上述预催红阶段在原对数生长期扩增阶段的培养系统内进行，不新增装置、不转移藻液、不对藻液做沉降等处理，在正常培养的情况下，仅通过生态因子的调整来实现，便于大规模生产应用，同时，在进入预催红阶段，培养体系的氮磷等营养元素基本消耗殆尽，便于后续以营养盐匮乏这一压力因子对细胞进行快速的催红诱导，缩短了催红诱导周期，提高了细胞干重和虾青素含量这两个重要的采收指标，节约了设备、人工成本与能耗，降低了由于操作环节多引起的不确定风险因素。
4、虾青素积累阶段(正式催红阶段)和藻液采收
预催红结束后根据两段式生产工艺，藻液由500L生物反应器转移至1000L生物反应器中，进行虾青素积累，虾青素积累阶段的生产周期一般在10天以内，1000L生物反应器的培养条件为：LED光源发出的单色光包括波长分别为370-420nm、400-495nm、615-700nm的三个特征峰，三个特征峰的光强比为1：50：70，光照强度35000Lux，光周期L：D为24：0，温度控制28-30℃，pH控制8.5-9.0，通入气体流量4m3/h；此处温度控制为28℃，pH控制为8.8。每日取样镜检，当镜检结果是培养体系干净无污染，细胞体积逐渐增大，多数细胞直径超过40μm，细胞颜色不断加深，范围由中心红色逐渐扩大到整个细胞，直至整个细胞呈现为深红色，显微镜下基本看不到原叶绿素颜色，藻液外观深红色，静置细胞下沉，即表示虾青素积累阶段完成可进行采收。本实施例在第7天镜检达标，对藻液进行采收，采收通过藻液沉降、离心获得藻泥并通过冷冻干燥工艺获得富含虾青素的雨生红球藻藻粉。在虾青素积累阶段初期的第24小时测定了细胞死亡率为0.6％，采收时测定了藻液细胞虾青素含量和干重指标，结果显示虾青素含量为4.89％、干重1.03g/L。雨生红球藻在进入虾青素积累阶段完成了缓冲处理，使其中80％以上的细胞能够在短时间内同步进入到可催红的理想状态，以达到降低催红初期细胞死亡率、避免污染的效果。
实施例2：是否经过预胁迫处理的对比
本实施例设置两组实验，一组为实施例1所述的方法，另一组在实施例1的基础上去除预胁迫处理方法，分别平行实验三次，测定虾青素积累阶段初期的第24小时测定细胞死亡率，在采收时测定藻液细胞虾青素含量和干重指标，结果如表1所示。
表1：是否经过预胁迫处理的对比
从实验结果可以看出：未预胁迫组成功时，其细胞死亡率较高、虾青素含量较低、干重低；经过预胁迫的，其细胞死亡率仅为0.6％、虾青素含量高、干重高，有利于生产。
此外，未经过预胁迫，当藻细胞进入虾青素积累阶段时可能发生对环境的不耐受，导致细胞大规模死亡(细胞死亡率>30％)，此时会造成无法产出虾青素，宣告生产失败。为定量地评价预胁迫能够减少多少失败几率，我们对上述两组实验各设置了50组，结果为：未预胁迫组有11组未能完成生产，失败率22％；预胁迫组全部完成了生产。显然，预胁迫处理还能够减低虾青素生产的失败几率。
实施例3：波长范围的筛选
现有技术进行胁迫的光源往往采用太阳光或LED灯白光，均为波长范围混杂的混合光，胁迫的结果是藻细胞死亡率高或藻细胞累积虾青素效果不佳。正常太阳光照射下死亡率往往高达15％～30％，甚至30％以上，高死亡率严重影响了虾青素的产量；因此波长可能是影响藻细胞存活的重要因素。
在本实施例中，我们选用气升式外置光源板式光生物反应器及配套的探测、控制装置为雨生红球藻的培养系统，校正各监控探头和辅助装置，选用10组100L养殖容积的光生物反应器进行养殖实验。所用藻液为洁净的对数生长期绿色游动态雨生红球藻，密度达到30×104cells/mL，藻种接入以及对数生长期扩增阶段的方法都与实施例1相同。
将光生物反应器的外部条件调整至：光照强度12000Lux，光周期L：D为16：8，温度控制在28℃(温控仪自动控制)，pH控制在8.2(通过调节二氧化碳含量控制)；根据先前的研究，藻细胞吸收光谱范围在400-700nm，于是我们将光谱参数分别设定为波长范围400-430nm、430-460nm、460-490nm、490-520nm、520-550nm、550-580nm、580-610nm、610-640nm、640-670nm、670-700nm，在上述条件下预胁迫处理36h，转而进入实施例1所述的虾青素积累阶段(正式催红阶段)和藻液采收；在虾青素积累阶段初期的第24小时测定细胞死亡率，采收时测定了藻液细胞虾青素含量和干重指标，结果如表2所示。
表2：波长与细胞死亡率
波长范围(nm) 细胞死亡率(％) 虾青素含量(％) 干重(g/L)
400-430 9.6 1.30 0.54
430-460 2.7 2.73 0.80
460-490 1.9 3.28 0.83
490-520 10.7 1.35 0.55
520-550 11.9 1.31 0.56
550-580 12.4 1.33 0.55
580-610 8.4 1.35 0.57
610-640 3.5 2.37 0.72
620-640 2.8 2.77 0.80
640-670 2.4 2.89 0.82
670-700 1.6 3.43 0.86
结果显示：波长范围430-490nm和620-700nm下，藻细胞死亡率低于3％综合来看，波长范围430-490nm和620-700nm下藻细胞死亡率低于3％，且藻细胞表现出以下特征：细胞基本无分裂现象，新生细胞数量少，游动细胞比例大幅降低，对数生长期扩增阶段中绿色细胞占总细胞的比例由原87％降为18％；同时，95％以上的藻细胞失去鞭毛，变为不动细胞，死亡率约2％；同时，细胞体积增大，细胞直径由平均25μm增加至35μm，其中出现部分超过40μm的细胞，约占总细胞比例7％，细胞外形由原来多数的水滴形变为现在的球形，细胞的细胞壁在显微镜下清晰可见，出现明显加厚，部分细胞中心变红的现象。上述特征表明藻细胞完成预胁迫阶段，进入下一步的虾青素积累阶段。
预胁迫处理培养36小时前后部分雨生红球藻细胞显微镜成像图如图1及图2所示，图1中显示雨生红球藻预处理前的特征，图2显示预胁迫处理结束后出现以下特征：a.原游动细胞失去鞭毛，变为不动细胞；b.细胞壁有明显加厚；c.细胞中心开始发红。
同时，通过对采收时藻液细胞虾青素含量和干重指标的测定，我们还能发现：波长范围430-490nm和620-700nm下虾青素的含量较高，干重较大，即虾青素的生产得到显著的提高；而其他波长的光进行预胁迫处理，其虾青素积累生产效果增加效果不明显，虾青素含量不高且干重低，接近未进行预胁迫处理的生产方案得到的虾青素产量。
上述预胁迫处理阶段在原对数生长期扩增阶段的培养系统内进行，不新增装置、不转移藻液、不对藻液做沉降等处理，在正常培养的情况下，仅通过生态因子的调整来实现，便于大规模生产应用，同时，在进入预胁迫处理阶段，培养体系的氮磷等营养元素基本消耗殆尽，便于后续以营养盐匮乏这一压力因子对细胞进行快速的虾青素积累诱导，缩短了诱导周期，提高了细胞干重和虾青素含量这两个重要的采收指标，节约了设备、人工成本与能耗，降低了由于操作环节多引起的不确定风险因素。
实施例4：波长430-490nm和620-700nm的光混合比
在实施例3中我们筛选得到了能降低细胞死亡率到3％以下的两个波长范围430-490nm和620-700nm的特征峰，因为其增强预胁迫效果的机理可能不同，那么这两种能够对预胁迫产生良好效果的特征峰进行组合可以能够达到更好的效果；因此在本实施例中，我们研究这两个特征峰的光强比，实验方法与实施例3相同，唯一的区别为固定光源为两个波长范围430-490nm和620-700nm的特征峰，进而改变此二者的光混合比，相同地，预胁迫处理36h，转而进入实施例1所述的虾青素积累阶段(正式催红阶段)和藻液采收；在虾青素积累阶段初期的第24小时测定细胞死亡率，采收时测定了藻液细胞虾青素含量和干重指标，结果如表3所示。
表3：波长430-490nm和640-700nm的光混合比
光强比 细胞死亡率(％) 虾青素含量(％) 干重(g/L)
仅620-700nm 2.5 2.89 0.80
0.1 1.4 3.56 0.89
0.5 1.1 4.12 0.96
0.7 0.6 4.89 1.03
0.9 1.2 4.07 0.94
1.0 1.8 3.46 0.86
1.1 2.2 3.16 0.84
1.5 2.3 2.97 0.84
仅430-490nm 2.6 2.81 0.80
结果显示：所述波长范围为430-490nm和620-700nm的特征峰，两者的光强比值为0.1-1:1时，能够使藻细胞死亡率低于2％；所述波长范围为430-490nm和620-700nm的特征峰，两者的光强比值为0.7:1时最最佳，藻细胞的死亡率仅0.6％；虾青素含量最高、干重最大，虾青素生产效果最好。
由此可见，将波长范围为430-490nm和620-700nm的特征峰进行一定比例的混合，其降低藻细胞死亡率的效果显著高于单一特征峰，存在协同效应；且单一特征峰光照无法实现组合之后的效果，有且只有二者的组合能达到上述效果。
实施例5：光照强度的筛选
在实际生产中，光照强度对雨生红球藻的死亡率、细胞不动率、平均直径都有着显著的影响；光照强度过大，死亡率升高，但是细胞不动率升高、平均直径增加，虽然促进了细胞进行光合作用，但是过高的死亡率明显不利于生产；光照强度过低，胁迫效果差，死亡率低，但是细胞不动率也较低、平均直径不会明显增加，也是不利于生产的。基于上述问题，本实施例研究筛选预胁迫处理方法适用的光照强度。
本实施例采用气升式外置光源板式光生物反应器及配套的探测、控制装置为雨生红球藻的培养系统，校正各监控探头和辅助装置，选用若干组100L养殖容积的光生物反应器进行养殖实验。所用藻液为洁净的对数生长期绿色游动态雨生红球藻，密度达到30×104cells/mL；藻种接入以及对数生长期扩增阶段的方法都与实施例1相同。
将光生物反应器的外部条件调整至：光谱参数为波长范围430-490nm和620-700nm的特征峰且两者的光强比值为0.7:1，光周期L：D为16：8，温度控制在28℃，pH控制在8.2；调整光照强度，使满足1×104cells/mL细胞密度藻液分别满足250、300、350、400、450Lux光强，总光强＝藻细胞密度*每单位密度光强，进行36小时预胁迫处理，随后转入虾青素积累阶段，方法同实施例1。在虾青素积累阶段初期的第24小时测定藻细胞的死亡率、细胞不动率、平均直径，采收时测定藻液细胞虾青素含量和干重指标，结果如表4和表5所示。
表4：不同光强下藻细胞的死亡率、细胞不动率、平均直径
表5：不同光强下藻细胞虾青素含量和干重
光强/密度 虾青素含量(％) 干重(g/L)
250 1.53 0.60
300 3.88 0.92
350 4.37 0.98
400 4.89 1.03
450 1.60 0.62
结果显示：适用于本发明提供的预胁迫处理方法的光强度为1×104cells/mL细胞密度藻液满足300-400Lux光强，在上述光强范围内，细胞死亡率低、细胞不动率高、平均直径大，虾青素的生产效率高；低于这一范围，细胞不动率低且平均直径小，高于这一范围，死亡率显著增加，都不利于虾青素的生产，造成产量严重下降。
实施例6：光周期的筛选
光周期也会影响预胁迫处理的效果：光照时间过长，引起死亡率上升，不利于生产；光照时间过短，光合效果不佳，细胞直径小，也不利与生产。因此应找出一种适合于本发明提供的预胁迫处理方法的光周期。
本实施例采取和实施例5相同的方法，区别在于，固定光强为12000Lux，调整光周期L：D分别为15:7、16:8、17:9、18:6、19:5。进行36小时预胁迫处理，随后转入虾青素积累阶段，方法同实施例1。在虾青素积累阶段初期的第24小时测定藻细胞的死亡率、细胞不动率、平均直径，采收时测定藻液细胞虾青素含量和干重指标，结果如表6和表7所示。
表6：不同光周期下藻细胞的死亡率、细胞不动率、平均直径
光周期 死亡率(％) 细胞不动率(％) 平均直径(μm)
15:7 1.1 91 26
16:8 0.6 97 35
17:9 1.4 97 36
18:6 2.7 98 36
19:5 5 98 32
表7：不同光周期下藻细胞虾青素含量和干重
光周期 虾青素含量(％) 干重(g/L)
15:7 1.69 0.57
16:8 4.89 1.03
17:9 4.61 0.95
18:6 4.23 0.92
19:5 1.57 0.53
结果显示：在光周期16:8或17:9或18:6下死亡率低，细胞不动率高，平均直径大，产出的虾青素含量高、细胞干重大，虾青素生产效果好，适合本发明提供的预胁迫处理方法；其中光周期为16:8效果最好。
实施例7：温度和pH的控制
本发明提供的预胁迫处理方法是为了让雨生红球藻适应从对数生长期到虾青素生产期，因此培养条件调整的幅度需要合适，太过柔和会导致雨生红球藻在虾青素生产期生产效率低下，太过粗粝则会导致死亡率飙升，有减产甚至生产失败的可能性。本实施例讨论温度和pH值的控制，以实现预胁迫处理方法的最优化。
首先，我们采取同实施例5的方法，区别在于固定光强为12000Lux，分别调整温度为24、25、26、27、28、29、30摄氏度，进行36小时预胁迫处理，随后转入虾青素积累阶段，方法同实施例1。在虾青素积累阶段初期的第24小时测定藻细胞的死亡率、细胞不动率、平均直径，采收时测定藻液细胞虾青素含量和干重指标，结果如表8和表9所示。
表8：不同温度下藻细胞的死亡率、细胞不动率、平均直径
温度(℃) 死亡率(％) 细胞不动率(％) 平均直径(μm)
24 5.3 88 24
25 4.2 91 26
26 1.9 96 32
27 1.1 96 34
28 0.6 97 35
29 3.7 98 32
30 5.9 98 32
表9：不同温度下藻细胞虾青素含量和干重
温度(℃) 虾青素含量(％) 干重(g/L)
24 1.54 0.55
25 2.07 0.60
26 4.29 0.97
27 4.70 1.00
28 4.89 1.03
29 2.21 0.63
30 1.50 0.52
结果显示：温度为26-28℃时死亡率低，细胞不动率高，平均直径大，虾青素含量高，干重大，其中温度为28℃时效果最好；温度过高引发死亡率上升，温度过低平均直径太小，均导致藻细胞虾青素含量和干重不足。
进一步的研究培养体系pH值对雨生红球藻预胁迫效果的影响，同样的采用和上述一样的方法，区别在于固定了温度为28℃，只调整体系pH，调整的方法为调节体系的二氧化碳浓度，分别调整pH为7.5、8.0、8.5、9.0，进行36小时预胁迫处理，随后转入虾青素积累阶段，方法同实施例1。在虾青素积累阶段初期的第24小时测定藻细胞的死亡率、细胞不动率、平均直径，采收时测定藻液细胞虾青素含量和干重指标，结果如表10和表11所示。
表10：不同pH值下藻细胞的死亡率、细胞不动率、平均直径
pH 死亡率(％) 细胞不动率(％) 平均直径(μm)
7.5 6.1 88 27
8.0 2.4 96 34
8.2 0.6 97 35
8.5 2.7 96 32
9.0 7.9 84 27
表11：不同pH值下藻细胞虾青素含量和干重
结果显示：pH为8.0-8.5时死亡率低，细胞不动率高，平均直径大，虾青素含量高，干重大。
此外，我们进一步针对这个区间内的pH进行了试验，发现pH＝8.2为最优选，死亡率仅为0.6％，且虾青素生产的效果最好。
实施例8：预胁迫处理时长
预胁迫处理时长对预胁迫处理效果具有一定影响：处理时间过短，预胁迫的效果不佳，导致在虾青素生产阶段死亡率上升；处理时间过长，容易对藻细胞产生毒害作用，直接导致藻细胞死亡。本实施例研究预胁迫处理时长。
同样采取实施例5所述的方法，区别在于固定光强度为12000Lux，调整预胁迫处理的时间长度，检测藻细胞的死亡率，结果如表7所示。
表12：不同时长的预胁迫处理时长对藻细胞死亡率的影响
时长(h) 藻细胞死亡率(％)
20 3.7
24 1.8
28 1.4
32 1.1
36 0.6
40 4.0
结果显示：合适的预胁迫处理时长取24-36小时之间，以36小时为最佳。
综上所述，本发明提供的降低雨生红球藻死亡率的预胁迫处理方法的最佳实施为：光谱参数为波长范围430-490nm和620-700nm的特征峰且两者的光强比值为0.7:1，光照强度为1×104cells/mL细胞密度藻液满足300-400Lux光强，光周期L：D为16：8，温度控制在28℃，pH控制在8.2，预胁迫处理时间为36小时；在上述条件下，死亡率会降低至0.6％，细胞不动率为97％，平均直径35μm，能够有效解决现有技术中直接进入正式催红阶段细胞这种养殖方法中存在的细胞损伤问题，预胁迫能够降低诱导初期细胞的死亡率，保证生产产量和过程的稳定性；在上述预胁迫处理后，胁迫完成采收时藻细胞虾青素含量为4.89％，远高于常规方法，且藻细胞干重大，达到了1.03g/L，显著增加了产量；还避免了由于死亡细胞裂解所带来的外源如原生动物、微生物等的污染，极大降低了生产失败的风险，提高了产品的品质。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种降低雨生红球藻死亡率的预胁迫处理方法，其特征在于，将经过对数生长期扩增阶段的雨生红球藻进行预胁迫；所述预胁迫的外部条件包括：光谱参数包括波长范围为430-490nm和620-700nm的特征峰，两者的光强比值为0.1-1:1；光照强度为1×104cells/mL细胞密度藻液满足300-400Lux光强；光周期为L:D为16-18：6-8；
所述经过对数生长期扩增的雨生红球藻的细胞密度为30-40×104cells/mL。
2.如权利要求1所述的预胁迫处理方法，其特征在于，所述预胁迫处理方法的光源采用光生物反应器。
3.如权利要求1所述的预胁迫处理方法，其特征在于，所述预胁迫处理方法的外部条件还包括：温度为26-28℃，pH为8.0-8.5。
4.如权利要求1所述的预胁迫处理方法，其特征在于，所述预胁迫处理方法的处理时间为24-36小时。
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