CN107841495B - 利用光合放氧电子分离快速筛检核诱变固碳藻株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物质能利用技术，旨在提供一种利用光合放氧电子分离快速筛检核诱变固碳藻株的方法。包括：将处于对数生长期的微藻置于钴60‑γ射线核辐照条件下进行诱变，静置恢复后依次进行单个藻株纯化、单株接种和扩大培养；采集微藻样品，分别测试其获得微藻光合放氧速率数据和微藻光合作用反应中心的叶绿素电子分离效率数据；分别选取两组数据中最高的前10名，将同时能列入两个筛选结果中的藻株作为高生长固碳速率的优良藻株。本发明能将筛选核诱变后的高效固碳藻株突变体的劳动耗时由传统直接测量微藻生长速率方法的90天减少到30天，大幅度提高了核诱变藻株突变体的筛选工作效率，显著降低了劳动时间成本。

Description

利用光合放氧电子分离快速筛检核诱变固碳藻株的方法
技术领域
本发明是关于生物质能利用和二氧化碳减排技术，特别涉及一种利用光合放氧电子分离快速筛检核诱变固碳藻株的方法。
背景技术
利用微藻减排CO2的生物工程技术已经被广泛研究了数十年(Sivakumar etal.2014)。微藻因其高固碳效率成为了可被持续利用的生物燃油制备的原料(Breuer etal.2012；Hu et al.2008)。可生长在海水中的微藻同时可以减缓淡水危机(Taher et al.,2014)，同时较高的盐度可以避免多种淡水微生物的生物入侵，使得利用海水来培养微藻具有更大的价值和前景。然而，利用微藻来固定CO2需要微藻在生长环境中有较高的生长固碳速率(Cheng et al.2013b)。因此如何选育高生长固碳速率的优良藻株就成了固定CO2问题的关键。
近几年微藻诱变育种方法已经广泛用于微藻固碳的研究中，包括物理诱变方法如紫外辐射和离子束，以及化学诱变方法如叠氮化钠、二乙基硫酸盐和乙基甲磺酸盐。此外60Co-γ射线具有强穿透力，并且诱变时间短，诱变效率高，使得核辐射诱变成为一种获得目标突变株的高效诱变方法。但是对于诱变后成千上万个藻株，如何快速地选育高效固碳的藻株，是一直以来的瓶颈问题。
传统筛检方法一般对于诱变后的藻株做单株纯化培养，然后逐步扩大培养并连续测量比较生长速率，从而筛选出高效固碳藻株。这种方法耗时耗力，且需消耗大量的微藻培养基，效率非常低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种利用光合放氧电子分离快速筛检核诱变固碳藻株的方法。
为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种利用光合放氧电子分离快速筛检核诱变固碳藻株的方法，包括下述步骤：
(1)将处于对数生长期的微藻置于钴60-γ射线核辐照条件下进行诱变，然后静置恢复一个月；
(2)取恢复生长后的微藻接种至由微藻培养基制成的琼脂板中进行单个藻株纯化培养，然后以96孔板接种单株纯化后存活的藻株，再取96个试管分别一一对应接种96孔板的每个孔藻液进行扩大培养，各培养周期均为7天；
(3)在96个试管中分别采集1毫升经扩大培养的微藻样品，置于溶氧测试仪的样品槽内，控制溶氧测试仪的光照强度，测量样品槽内由微藻光合作用释放的氧气溶解浓度，进而获得微藻光合放氧速率数据；
(4)在96个试管中分别采集50微升经扩大培养的微藻样品，置于快速重复荧光仪的样品槽内，对微藻样品进行光束刺激实验，进而获得微藻光合作用反应中心的叶绿素电子分离效率数据；
(5)分别选取光合放氧速率最高的前10名的藻株，以及叶绿素电子分离效率最高的前10名的藻株，将同时能列入两个筛选结果中的藻株作为高生长固碳速率的优良藻株。
本发明中，所述的微藻是小球藻、微拟球藻或螺旋藻中的任意一种。
本发明中，所述步骤(1)具体包括：取20毫升处于对数生长期的微藻，装入容量50毫升的锥形瓶，置于剂量500～5000GY的钴60-γ射线核辐照条件下进行诱变；然后将核诱变后的微藻突变体静置于20℃恒温箱进行一个月的恢复，全天24小时控制光照强度为1000Lux；
本发明中，所述步骤(2)具体包括：取恢复生长后的微藻溶液0.2微升，接种至由微藻培养基制成的琼脂板中进行单个藻株纯化培养，培养周期为7天；将96孔板每个孔中加入微藻培养基0.3毫升，然后接种单株纯化后存活的藻株，培养周期为7天；再取96个试管分别加入微藻培养基5毫升，然后一一对应接种96孔板中的每个孔藻液进行扩大培养，培养周期为7天。
本发明中，所述步骤(3)具体包括：在96个试管中分别采集1毫升经扩大培养的微藻样品，置于溶氧测试仪的样品槽内，在黑暗条件下持续通入氩气直至测试出藻液中的氧气溶解浓度为零；然后控制溶氧测试仪的光照强度为350μmol(m2·s)-1，测量样品槽内由微藻光合作用释放的氧气溶解浓度；计算微藻光合放氧速率：R氧气＝(C2-C1)/(t2-t1)，其中C2为t2＝120秒时的氧气溶解浓度，C1为t1＝60秒时的氧气溶解浓度。
本发明中，所述步骤(4)具体包括：在96个试管中分别采集50微升经扩大培养的微藻样品，置于快速重复荧光仪的样品槽内，对微藻样品进行6000个光束的刺激实验；每一个小周期10毫秒的光束刺激的控制策略为：控制一束光照时间为0.05毫秒，然后黑暗时间为9.95毫秒；重复50次小周期的光束刺激共0.5秒，然后再控制黑暗时间0.5秒；以上共1秒的实验时间称为一个大周期，重复此大周期实验120次，共耗时120秒；计算微藻光合作用反应中心的叶绿素电子分离效率方法：将第120个大周期实验时的共50个小周期光束刺激时获得的叶绿素荧光参数Fv/Fm取平均值，即为叶绿素电子分离效率。
发明原理描述：
微藻生长固碳速率是与藻细胞内的光合放氧速率及叶绿素电子分离效率呈现正相关性的。微藻的光合放氧速率和叶绿素电子分离效率越高，其固碳速率也就越高，故利用光合放氧速率和叶绿素电子分离效率来挑选高效固碳藻株是可行的。本发明提出利用光合放氧速率和叶绿素电子分离效率测试来筛选藻株，以间接得到固碳速率高的突变体藻株，是一种准确且快速筛检核诱变高效固碳藻株的高效可行方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用微藻固碳速率随光合放氧电子分离特性增强而提高的特点，针对核诱变后的藻株突变体进行单株纯化和扩大培养，筛选出光合放氧速率高(31～41nmol/ml/min)和叶绿素电子分离效率高的藻株(0.46～0.51)。分别选取光合放氧速率最高的前10名的藻株，以及叶绿素电子分离效率最高的前10名的藻株，将同时能列入两个筛选结果中的藻株作为高生长固碳速率的优良藻株(比诱变前原始藻株的固碳速率提高了15.6～132.6％)。此方法将筛选核诱变后的高效固碳藻株突变体的劳动耗时由传统直接测量微藻生长速率方法的90天减少到30天，大幅度提高了核诱变藻株突变体的筛选工作效率，显著降低了劳动时间成本。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
实施例1
(1)取对数生长期的微拟球藻20毫升，装入容量50毫升的锥形瓶，置于剂量500GY的钴60-γ射线核辐照条件下进行诱变。将核诱变后的微藻突变体静置于20℃恒温箱进行一个月的恢复，全天24小时控制光照强度为1000Lux。
(2)取一个月后恢复生长的微藻溶液0.2微升，接种至由微藻培养基制成的琼脂板中进行单个藻株纯化培养，培养周期为7天。将96孔板每个孔中加入微藻培养基0.3毫升，然后接种单株纯化后存活的藻株，培养周期为7天。再取96个试管分别加入微藻培养基5毫升，然后一一对应接种96孔板中的每个孔藻液进行扩大培养，培养周期为7天。
(3)在96个试管中分别采集1毫升经扩大培养的微藻样品，置于溶氧测试仪的样品槽内，在黑暗条件下持续通入氩气直至测试出藻液中的氧气溶解浓度为零。然后控制溶氧测试仪的光照强度为350μmol(m2·s)-1，测量样品槽内由微藻光合作用释放的氧气溶解浓度，计算微藻光合放氧速率：R氧气＝(C2-C1)/(t2-t1)，其中C2为t2＝120秒时的氧气溶解浓度，C1为t1＝60秒时的氧气溶解浓度。
(4)在96个试管中分别采集50微升经扩大培养的微藻样品，置于快速重复荧光仪的样品槽内，对微藻样品进行6000个光束的刺激实验。一个小周期10毫秒的光束刺激如下：控制一束光照时间为0.05毫秒，然后黑暗时间为9.95毫秒。重复50次小周期的光束刺激(共持续0.5秒)，然后再控制黑暗时间0.5秒。以上共1秒的实验时间称为一个大周期，重复此大周期实验120次，共耗时120秒。计算微藻光合作用反应中心的叶绿素电子分离效率方法如下：将第120个大周期实验时的共50个小周期光束刺激获得的叶绿素荧光参数Fv/Fm取平均值，即为叶绿素电子分离效率。
(5)分别选取光合放氧速率最高的前10名的微拟球藻藻株，以及叶绿素电子分离效率最高的前10名的微拟球藻藻株，将同时能列入两个筛选结果中的藻株作为高生长固碳速率的优良藻株。筛选出的高生长固碳速率微拟球藻藻株的光合放氧速率为31nmol/ml/min，电子分离效率为0.46，固碳速率比诱变前原始藻株提高了15.6％。
实施例2
(1)取对数生长期的小球藻20毫升，装入容量50毫升的锥形瓶，置于剂量900GY的钴60-γ射线核辐照条件下进行诱变。将核诱变后的微藻突变体静置于20℃恒温箱进行一个月的恢复，全天24小时控制光照强度为1000Lux。
(2)取一个月后恢复生长的微藻溶液0.2微升，接种至由微藻培养基制成的琼脂板中进行单个藻株纯化培养，培养周期为7天。将96孔板每个孔中加入微藻培养基0.3毫升，然后接种单株纯化后存活的藻株，培养周期为7天。再取96个试管分别加入微藻培养基5毫升，然后一一对应接种96孔板中的每个孔藻液进行扩大培养，培养周期为7天。
(3)在96个试管中分别采集1毫升经扩大培养的微藻样品，置于溶氧测试仪的样品槽内，在黑暗条件下持续通入氩气直至测试出藻液中的氧气溶解浓度为零。然后控制溶氧测试仪的光照强度为350μmol(m2·s)-1，测量样品槽内由微藻光合作用释放的氧气溶解浓度，计算微藻光合放氧速率：R氧气＝(C2-C1)/(t2-t1)，其中C2为t2＝120秒时的氧气溶解浓度，C1为t1＝60秒时的氧气溶解浓度。
(4)在96个试管中分别采集50微升经扩大培养的微藻样品，置于快速重复荧光仪的样品槽内，对微藻样品进行6000个光束的刺激实验。一个小周期10毫秒的光束刺激如下：控制一束光照时间为0.05毫秒，然后黑暗时间为9.95毫秒。重复50次小周期的光束刺激(共持续0.5秒)，然后再控制黑暗时间0.5秒。以上共1秒的实验时间称为一个大周期，重复此大周期实验120次，共耗时120秒。计算微藻光合作用反应中心的叶绿素电子分离效率方法如下：将第120个大周期实验时的共50个小周期光束刺激获得的叶绿素荧光参数Fv/Fm取平均值，即为叶绿素电子分离效率。
(5)分别选取光合放氧速率最高的前10名的小球藻藻株，以及叶绿素电子分离效率最高的前10名的小球藻藻株，将同时能列入两个筛选结果中的藻株作为高生长固碳速率的优良藻株。筛选出的高生长固碳速率小球藻藻株的光合放氧速率为37nmol/ml/min，电子分离效率为0.49，固碳速率比诱变前原始藻株提高了21.8％。
实施例3
(1)取对数生长期的螺旋藻20毫升，装入容量50毫升的锥形瓶，置于剂量5000GY的钴60-γ射线核辐照条件下进行诱变。将核诱变后的微藻突变体静置于20℃恒温箱进行一个月的恢复，全天24小时控制光照强度为1000Lux。
(2)取一个月后恢复生长的微藻溶液0.2微升，接种至由微藻培养基制成的琼脂板中进行单个藻株纯化培养，培养周期为7天。将96孔板每个孔中加入微藻培养基0.3毫升，然后接种单株纯化后存活的藻株，培养周期为7天。再取96个试管分别加入微藻培养基5毫升，然后一一对应接种96孔板中的每个孔藻液进行扩大培养，培养周期为7天。
(3)在96个试管中分别采集1毫升经扩大培养的微藻样品，置于溶氧测试仪的样品槽内，在黑暗条件下持续通入氩气直至测试出藻液中的氧气溶解浓度为零。然后控制溶氧测试仪的光照强度为350μmol(m2·s)-1，测量样品槽内由微藻光合作用释放的氧气溶解浓度，计算微藻光合放氧速率：R氧气＝(C2-C1)/(t2-t1)，其中C2为t2＝120秒时的氧气溶解浓度，C1为t1＝60秒时的氧气溶解浓度。
(4)在96个试管中分别采集50微升经扩大培养的微藻样品，置于快速重复荧光仪的样品槽内，对微藻样品进行6000个光束的刺激实验。一个小周期10毫秒的光束刺激如下：控制一束光照时间为0.05毫秒，然后黑暗时间为9.95毫秒。重复50次小周期的光束刺激(共持续0.5秒)，然后再控制黑暗时间0.5秒。以上共1秒的实验时间称为一个大周期，重复此大周期实验120次，共耗时120秒。计算微藻光合作用反应中心的叶绿素电子分离效率方法如下：将第120个大周期实验时的共50个小周期光束刺激获得的叶绿素荧光参数Fv/Fm取平均值，即为叶绿素电子分离效率。
(5)分别选取光合放氧速率最高的前10名的螺旋藻藻株，以及叶绿素电子分离效率最高的前10名的螺旋藻藻株，将同时能列入两个筛选结果中的藻株作为高生长固碳速率的优良藻株。筛选出的高生长固碳速率螺旋藻藻株的光合放氧速率为41nmol/ml/min，电子分离效率为0.51，固碳速率比诱变前原始藻株提高了132.6％。
最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用光合放氧电子分离快速筛检核诱变固碳藻株的方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）将处于对数生长期的微藻置于钴60-γ射线核辐照条件下进行诱变，然后静置恢复一个月；具体包括：
取20毫升处于对数生长期的微藻，装入容量50毫升的锥形瓶，置于剂量500~5000GY的钴60-γ射线核辐照条件下进行诱变；然后将核诱变后的微藻突变体静置于20℃恒温箱进行一个月的恢复，全天24小时控制光照强度为1000Lux；
（2）取恢复生长后的微藻接种至由微藻培养基制成的琼脂板中进行单个藻株纯化培养，然后以96孔板接种单株纯化后存活的藻株，再取96个试管分别一一对应接种96孔板的每个孔藻液进行扩大培养，各培养周期均为7天；具体包括：
取恢复生长后的微藻溶液0.2微升，接种至由微藻培养基制成的琼脂板中进行单个藻株纯化培养，培养周期为7天；将96孔板每个孔中加入微藻培养基0.3毫升，然后接种单株纯化后存活的藻株，培养周期为7天；再取96个试管分别加入微藻培养基5毫升，然后一一对应接种96孔板中的每个孔藻液进行扩大培养，培养周期为7天；
（3）在96个试管中分别采集1毫升经扩大培养的微藻样品，置于溶氧测试仪的样品槽内，控制溶氧测试仪的光照强度，测量样品槽内由微藻光合作用释放的氧气溶解浓度，进而获得微藻光合放氧速率数据；具体包括：
在96个试管中分别采集1毫升经扩大培养的微藻样品，置于溶氧测试仪的样品槽内，在黑暗条件下持续通入氩气直至测试出藻液中的氧气溶解浓度为零；然后控制溶氧测试仪的光照强度为350μmol (m2·s)-1，测量样品槽内由微藻光合作用释放的氧气溶解浓度；计算微藻光合放氧速率：R氧气=(C2-C1)/(t2-t1)，其中C2为t2=120秒时的氧气溶解浓度，C1为t1=60秒时的氧气溶解浓度；
（4）在96个试管中分别采集50微升经扩大培养的微藻样品，置于快速重复荧光仪的样品槽内，对微藻样品进行光束刺激实验，进而获得微藻光合作用反应中心的叶绿素电子分离效率数据；具体包括：
在96个试管中分别采集50微升经扩大培养的微藻样品，置于快速重复荧光仪的样品槽内，对微藻样品进行6000个光束的刺激实验；每一个小周期10毫秒的光束刺激的控制策略为：控制一束光照时间为0.05毫秒，然后黑暗时间为9.95毫秒；重复50次小周期的光束刺激共0.5秒，然后再控制黑暗时间0.5秒；以上共1秒的实验时间称为一个大周期，重复此大周期实验120次，共耗时120秒；
计算微藻光合作用反应中心的叶绿素电子分离效率方法：将第120个大周期实验时的共50个小周期光束刺激时获得的叶绿素荧光参数Fv/Fm取平均值，即为叶绿素电子分离效率；
（5）分别选取光合放氧速率最高的前10名的藻株，以及叶绿素电子分离效率最高的前10名的藻株，将同时能列入两个筛选结果中的藻株作为高生长固碳速率的优良藻株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微藻是小球藻、微拟球藻或螺旋藻中的任意一种。
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