CN108849528B - 一种获得假俭草突变体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种获得假俭草突变体的方法，属于草坪草生物技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：1)诱变愈伤组织的获得；2)诱变愈伤组织进行分化培养，得诱导苗；3)诱导苗接种进行生根培养，得完整植株；4)完整植株进行筛选，得变异植株；5)变异植株进行扦插繁育，鉴定突变性状，获得稳定遗传的假俭草突变体。利用本发明的方法，一次诱变可获得23～35株完整植株，有5～10株完整植株在一种或多种性状上发生变异，性状变异率为21.73～28.57％；有2～3株发生DNA变异，变异率为5.7～8.7％。
Description
技术领域
本发明属于草坪草生物技术领域，具体涉及一种获得假俭草突变体的方法。
背景技术
假俭草(Eremochloa ophiuroides(Munro.)Hack.)是起源于我国的优良暖季型草坪草和牧草，具有叶形优美、绿期长、耐瘠薄、病虫害少、养护水平低等优点，因此被誉为“中国最好的暖季型草坪草”，广泛用于庭院草坪、休憩草坪及护坡草坪的建植，尤其适合水土保持和大面积的景观建设。随着全球水资源和能源的日益枯竭以及生态文明建设重要性日益突出，对假俭草尤其是品质好、性状优良的假俭草品种的需求日益增加。然而现有假俭草品种单一，难以满足生产需求。目前生产上所用的假俭草品种都是通过对野生资源的筛选培育或是通过杂交育种得来，但是其育种周期长，工作量大，变异幅度小，短时间内难以获得优良品种，显著影响假俭草的育种进程。因此，为了满足生产上对假俭草优良品种的需要，研究开发快速、高效的育种创新技术具有重要的意义。
低温等离子体技术是促使农作物增产的现代生态农业新技术，广泛用于化工、医药、环保等领域，在农业上应用尚属新的研究领域。目前，低温等离子体在微生物突变体创制中得到应用。此外，低温等离子体诱变在小麦(CN103999593A)、玉米(CN104186060A)、花生(CN104012208B)、大豆(CN104620719A)、甘蓝(CN105580727A)、西葫芦(CN104855281A)、苜蓿(CN103718848A)等植物育种中也获得较好的进展，诱变材料均为种子。然而到目前为止，尚未见低温等离子体处理植物体细胞诱变育种的研究报道，也未见对草坪草(包括假俭草)诱变育种的研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种获得假俭草突变体的方法，该方法成本低、简便易行、安全环保，在较短时间内获得优良突变体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种获得假俭草突变体的方法，包括以下步骤：
1)取假俭草愈伤组织进行低温等离子诱变，得诱变愈伤组织；
2)将步骤1)得到的所述诱变愈伤组织接种到分化培养基中进行分化培养，得诱导苗；所述分化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.8～3.5mg/L的激动素、0.05～0.2mg/L的萘乙酸、25～40g/L的蔗糖和1～5g/L的植物凝胶；
3)将步骤2)得到的所述诱导苗接种至生根培养基中进行生根培养，得完整植株；所述生根培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.2～1mg/L的萘乙酸、20～40g/L的蔗糖和1～5g/L的植物凝胶；
4)对步骤3)得到的所述完整植株进行筛选，得变异植株；
5)将步骤4)所述变异植株进行扦插繁育，获得假俭草突变体。
优选的，步骤1)所述假俭草愈伤组织的制备方法，包括：以消毒后假俭草幼穗为外植体，接种到诱导培养基中诱导培养18～25d，得假俭草愈伤组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括2,4-二氯苯氧乙酸1～5mg/L、6-苄氨基嘌呤0.04～0.2mg/L、蔗糖20～40g/L和植物凝胶1～5g/L。
优选的，所述诱导培养为暗培养，培养温度为25±1℃。
优选的，所述低温等离子体诱变的条件为：处理功率为300～450W，处理时间为90s，介质为氦气和空气混合气体。
优选的，所述氦气和空气的体积比为(5～10)：1。
优选的，步骤2)所述分化培养为暗培养，培养时间为25～35d，培养温度为25±1℃。
优选的，步骤3)所述生根培养的温度为25±1℃，培养的光照时间12h/d，光照强度2000～3000lx，培养时间为10～18d。
优选的，步骤4)所述筛选的方式包括植株表型性状测定及DNA变异检测。
优选的，所述植株表型性状包括叶色、叶形、匍匐茎长度、匍匐茎颜色、分枝数和茎粗。
优选的，步骤5)所述扦插繁育后，还包括：对得到的繁育植株进行PCR鉴定，筛选得到突变体。
本发明提供了一种获得假俭草突变体的方法，将低温等离子体应用于假俭草体细胞诱变育种，该方法成本低(诱变一次仅几元钱，传统的钴60等诱变一次要几千元)、简便易行、安全环保。通过低温等离子体诱导假俭草体细胞创制突变体，为假俭草遗传育种研究创制种质资源，降低育种成本，缩短假俭草育种周期，加快育种进程。
附图说明
图1为对照组假俭草植株；
图2为假俭草茎色和叶色突变体；
图3为假俭草大叶型突变体；
图4为假俭草多分枝突变体；
图5为假俭草匍匐茎快速伸长突变体；
图6为假俭草SSR分子标记的结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种获得假俭草突变体的方法，包括以下步骤：
1)取假俭草愈伤组织进行低温等离子诱变，得诱变愈伤组织；
2)将步骤1)得到的所述诱变愈伤组织接种到分化培养基中进行分化培养，得诱导苗；所述分化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.8～3.5mg/L的激动素、0.05～0.2mg/L的萘乙酸、25～40g/L的蔗糖和1～5g/L的植物凝胶；
3)将步骤2)得到的所述诱导苗接种至生根培养基中进行生根培养，得完整植株；所述生根培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.2～1mg/L的萘乙酸、20～40g/L的蔗糖和1～5g/L的植物凝胶；
4)对步骤3)得到的所述完整植株进行筛选，得变异植株；
5)将步骤4)所述变异植株进行扦插繁育，获得假俭草突变体。
本发明所述获得假俭草突变体的方法，包括取假俭草愈伤组织进行低温等离子诱变，得诱变愈伤组织。本发明对所述假俭草的种类和来源并没有特殊限定，利用本领域的常规假俭草即可。本发明所述假俭草愈伤组织的制备方法，优选的包括：以消毒后假俭草幼穗为外植体，接种到诱导培养基中诱导培养18～25d，得假俭草愈伤组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括2,4-二氯苯氧乙酸1～5mg/L、6-苄氨基嘌呤0.04～0.2mg/L、蔗糖20～40g/L和植物凝胶(固定支撑愈伤组织)1～5g/L。本发明所述假俭草幼穗优选为去除叶鞘后的假俭草幼穗，本发明对所述去除的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述消毒优选包括酒精消毒，所述酒精的体积浓度优选为75％。本发明所述诱导培养基包含2,4-二氯苯氧乙酸，所述2,4-二氯苯氧乙酸在诱导培养基中的浓度优选为1.5～4.5mg/L，更优选为2～3.5mg/L，最优选为3mg/L。本发明所述2,4-二氯苯氧乙酸具有诱导愈伤组织的作用。本发明所述诱导培养基包含6-苄氨基嘌呤，所述6-苄氨基嘌呤在诱导培养基中的浓度优选为0.05～0.18mg/L，更优选为0.08～0.15mg/L，最优选为0.1mg/L。本发明所述6-苄氨基嘌呤可以促进生芽。本发明所述诱导培养基包含蔗糖，所述蔗糖在诱导培养基中的浓度优选为25～38g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。本发明所述蔗糖可以提供碳源。本发明所述诱导培养基包含植物凝胶，所述植物凝胶在诱导培养基中的浓度优选为1.5～4.5g/L，更优选为2～3.8g/L，最优选为3g/L。本发明所述植物凝胶可以固定支撑愈伤组织。本发明对所述诱导培养基的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可，优选的将制备得到的诱导培养基调节pH至5.8。本发明对所述诱导培养的各组分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述诱导培养优选为暗培养，所述暗培养的培养温度优选为25±1℃。本发明所述诱导培养的时间优选为20～24d，更优选为21d。
本发明所述等离子诱变优选为将愈伤组织进行低温等离子体处理，所述处理时，优选将所述愈伤组织置于培养皿内，更优选的用封口膜封口。本发明对所述低温等离子诱变的仪器并没有特殊要求，优选为利用低温等离子体处理机，使培养皿内的愈伤组织接受辉光放电产生的低温等离子体处理。本发明所述低温等离子体处理的条件优选为：处理功率为400W，处理时间为90s，介质为氦气和空气混合气体。本发明所述氦气和空气的体积比优选为(5～10)：1，更优选为(6～9)：1，最优选为8:1。
得诱变愈伤组织后，本发明将所述诱变愈伤组织接种到分化培养基中进行分化培养，得诱导苗；所述分化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.8～3.5mg/L的激动素、0.05～0.2mg/L的萘乙酸、25～40g/L的蔗糖和1～5g/L的植物凝胶。本发明对所述接种的接种量并没有特殊限定，利用本领域的常规接种量即可。本发明所述分化培养基中包含有激动素，所述激动素在分化培养基中的浓度优选为2～3mg/L，更优选为2.2～2.6mg/L，最优选为2.5mg/L。本发明所述激动素可以促进细胞增殖。本发明所述分化培养基中包含有萘乙酸，所述萘乙酸在分化培养基中的浓度优选为0.06～0.18mg/L，更优选为0.08～0.15mg/L，最优选为0.1mg/L。本发明所述萘乙酸可以促进细胞增殖。本发明所述分化培养基中包含有蔗糖，所述蔗糖在分化培养基中的浓度优选为26～38g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。本发明所述蔗糖提供碳源。本发明所述分化培养基中包含有植物凝胶，所述植物凝胶在分化培养基中的浓度优选为1.5～4.5g/L，更优选为2～3.8g/L，最优选为3g/L。本发明所述植物凝胶固定支撑愈伤组织。本发明对所述分化培养基的各组分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明对所述分化培养基的制备方法并没有特殊限定，优选将制备得到的分化培养基调节pH至5.8。
本发明所述分化培养优选为暗培养，所述暗培养的培养时间优选为25～35d，更优选为26～30d，最优选为28d。本发明所述暗培养的培养温度优选为25±1℃。
得到诱导苗后，本发明将所述诱导苗接种至生根培养基中进行生根培养，得完整植株；所述生根培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.2～1mg/L的萘乙酸、20～40g/L的蔗糖和1～5g/L的植物凝胶(固定支撑分化苗)。本发明对所述接种的接种量并没有特殊限定，利用本领域的常规接种量即可。本发明所述生根培养基内包含萘乙酸，所述萘乙酸在生根培养基中的浓度优选为0.3～0.8mg/L，更优选为0.4～0.6mg/L，最优选为0.5mg/L。本发明所述萘乙酸诱导生根。本发明所述生根培养基内包含蔗糖，所述蔗糖在生根培养基中的浓度优选为25～35g/L，更优选为28～32g/L，最优选为30g/L。本发明所述蔗糖提供碳源。本发明所述生根培养基内包含有植物凝胶，所述植物凝胶在生根培养基中的浓度优选为1.5～4.8g/L，更优选为2.6～3.5g/L，最优选为3g/L。本发明所述植物凝胶固定支撑分化苗。本发明对所述生根培养基的各组分及制备方法并没有特殊限定，优选的将制备得到的生根培养基调节pH至5.8。本发明所述生根培养优选为光照培养，所述光照培养的光照强度优选为2000～3000lx，更优选为2300～2800lx，最优选为2500lx。本发明所述光照培养的光照时间优选为12h/d。本发明所述生根培养的温度优选为25±1℃。本发明所述生根培养的时间优选为10～18d，更优选为12～16d，最优选为14d。
得完整植株后，本发明将得到的所述完整植株进行筛选，得变异植株。本发明在进行所述筛选前，优选的还包括炼苗，所述炼苗的温度优选为25±1℃。本发明所述炼苗的光照强度优选为2000～3000lx，光照时间优选为12h/d。本发明所述炼苗的时间优选为5d。本发明在所述炼苗后优选的单株移栽至盆钵中进行培养，所述培养的基质优选包括棕壤、沙和泥炭的混合物，所述棕壤、沙和泥炭的体积比优选为2:2:1。本发明优选对所述盆钵中的植物进行筛选，所述筛选的方式优选包括植株表型性状测定及DNA变异检测。本发明所述植株表型性状包括叶色、叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎颜色、匍匐茎直径和分枝数。植株生长60天后，分别统计分析对照组和辐射组每株植株叶色、叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎颜色、匍匐茎直径和分枝数。本发明从辐射组假俭草植株中挑选出叶片或匍匐茎颜色发生变异或者叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎直径、分枝数发生变异的植株(对应数据与对照组平均值相差20％以上)作为候选样本。利用SSR引物S1-S30对每个候选样本和对照组样本进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较DNA变异情况。本发明所述对DNA变异检测的方法并没有特殊限定，优选为SSR，当采用SSR方法对DNA变异进行检测时，所述SSR的引物序列优选如表1所示：
表1.SSR引物序列表
本发明所述DNA检测的PCR扩增体系优选为10μL体系，包括：5μL2×Taq PCRMaster Mix、1.0μL引物、1.5μLDNA模板、2.5μLddH2O。本发明所述DNA检测的扩增程序优选为：95℃预变性5min、95℃变性40s、55℃退火30s、72℃延伸1min、进行35个循环后再72℃延伸10min，反应结束后15℃保存。本发明优选对DNA检测后的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，与比较凝胶DNA条带数目、条带位置和条带强弱的差异情况。
得变异植株后，本发明对所述变异植株进行扦插繁育，获得假俭草突变体。本发明所述扦插繁育的外植体优选为表型性状且DNA结构发生明显变异的植株茎段。本发明在所述扦插繁育后，优选的还包括：对得到的繁育植株进行PCR鉴定，筛选得到突变体，所述PCR鉴定的引物如表1所示。本发明对所述PCR鉴定的方法并没有特殊限定。
下面结合实施例对本发明提供的获得假俭草突变体的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取假俭草品系‘Common’新鲜幼穗，剥去叶鞘，用75％酒精消毒灭菌后接接种到诱导培养基中(培养基配方为：MS培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸3mg/L和6-苄氨基嘌呤0.1mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)，25±1℃条件下暗培养3周，得到淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。
将20个直径0.5cm左右的胚性愈伤组织放于玻璃培养皿内，用封口膜封口，置于低温等离子体处理机中，接受辉光放电产生的低温等离子体处理。处理参数如下：处理功率为300W，处理时间为90s，介质为氦气和空气混合气体(He：空气＝8:1)。
将低温等离子体处理后的胚性愈伤组织接种到分化培养基(培养基配方为：MS培养基，添加激动素2.5mg/L和萘乙酸0.1mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)中，25±1℃条件下暗培养4周，得到诱导苗；
然后将诱导苗转到生根培养基(培养基配方为：MS培养基，添加萘乙酸0.5mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)中，在25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2000～3000lx条件下培养2周，得到完整植株；打开组培苗瓶盖，置于25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2000～3000lx条件下炼苗5天，炼苗后单株分开移栽至盆钵中进行培养，培养基质为棕壤、沙和泥炭的混合物(体积比2:2:1)。
植株生长60天后，分别统计分析对照组和辐射组每株植株叶色、叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎颜色、匍匐茎直径和分枝数。本发明从辐射组假俭草植株中挑选出叶片或匍匐茎颜色发生变异或者叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎直径、分枝数发生变异的植株(对应数据与对照组平均值相差20％以上)作为候选样本。利用30对SSR引物(表1所示S1～S30)对候选植株和对照组植株进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较DNA变异情况。
统计发现：获得完整植株35株，经表型性状分析，发现有10株完整植株在一项或多项指标发生了明显变异，其中的2株完整植株发生了DNA变异。其中1株叶色变红，匍匐茎长度较对照植株减少60％(图2a)，对应引物S3扩增产物中250bp左右多出一条带(图6a)，引物S13扩增产物中220bp左右条带消失，200bp左右条带变弱(图6b)，引物S28扩增产物中180bp多出一条带；1株叶色和匍匐茎颜色均变红(图2b)，对应引物S3扩增产物中250bp左右多出一条带(图6a)，引物S13扩增产物中220bp左右条带消失，160bp和200bp左右条带变弱(图6b)，引物S28扩增产物中180bp多出一条带(图6c)。将有表型性状且DNA结构发生明显变异的植株茎段进行扦插繁殖，进一步鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。
实施例2
取假俭草品种‘Tifblair’新鲜幼穗，剥去叶鞘，用75％酒精消毒灭菌后接接种到诱导培养基中(培养基配方为：MS培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸3mg/L和6-苄氨基嘌呤0.1mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)，25±1℃条件下暗培养3周，得到淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。
将20个直径0.5cm左右的胚性愈伤组织放于玻璃培养皿内，用封口膜封口，置于低温等离子体处理机中，接受辉光放电产生的低温等离子体处理。处理参数如下：处理功率为400W，处理时间为90s，介质为氦气和空气混合气体(He：空气＝8:1)。
将低温等离子体处理后的胚性愈伤组织接种到分化培养基(培养基配方为：MS培养基，添加激动素2.5mg/L和萘乙酸0.1mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)中，25±1℃条件下暗培养4周，得到诱导苗；然后将诱导苗转到生根培养基(培养基配方为：MS培养基，添加萘乙酸0.5mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)中，在25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2000～3000lx条件下培养2周，得到完整植株苗；打开组培苗瓶盖，置于25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2000～3000lx条件下炼苗5天，炼苗后单株分开移栽至盆钵中进行培养，培养基质为棕壤、沙和泥炭的混合物(体积比2:2:1)。炼苗后单株分开移栽至盆钵中进行培养，培养基质为棕壤、沙和泥炭的混合物(体积比2:2:1)。
植株生长60天后，分别统计分析对照组和辐射组每株植株叶色、叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎颜色、匍匐茎直径和分枝数。本发明从辐射组假俭草植株中挑选出叶片或匍匐茎颜色发生变异或者叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎直径、分枝数发生变异的植株(对应数据与对照组平均值相差20％以上)作为候选样本。利用30对SSR引物(表1所示S1～S30)对候选植株和对照组植株进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较DNA变异情况。
统计发现：获得完整植株35株，经表型性状分析，发现有6株完整植株在一项或多项指标发生了明显变异，其中的3株完整植株发生了DNA变异。其中1株植株匍匐茎变红且叶面积较对照增加1.4倍(图3)，对应引物S3扩增产物中250bp左右多出一条带(图6a)，引物S13扩增产物中220bp左右条带消失，200bp左右条带变弱(图6b)，引物S28扩增产物中180bp多出一条带(图6c)；1株分枝数较对照植株增加2倍(图4a),匍匐茎直径增加1.3倍，对应引物S3扩增产物中250bp左右多出一条带(图6a)，引物S28扩增产物中180bp多出一条带(图6c)；1株匍匐茎茎色变红且分枝数较对照植株增加1.8倍(图4b)，对应引物S3扩增产物中250bp左右多出一条带(图6a)，引物S13扩增产物中220bp左右条带变弱(图6b)，引物S28扩增产物中180bp多出一条带(图6c)。将有表型性状且DNA结构发生明显变异的植株茎段进行扦插繁殖，进一步鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。
实施例3
取假俭草新品种‘翠绿1号’新鲜幼穗，剥去叶鞘，用75％酒精消毒灭菌后接接种到诱导培养基中(培养基配方为：MS培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸3mg/L和6-苄氨基嘌呤0.1mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)，25±1℃条件下暗培养3周，得到淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。
将20个直径0.5cm左右的胚性愈伤组织放于玻璃培养皿内，用封口膜封口，置于低温等离子体处理机中，接受辉光放电产生的低温等离子体处理。处理参数如下：处理功率为450W，处理时间为90s，介质为氦气和空气混合气体(He：空气＝8:1)。
将低温等离子体处理后的胚性愈伤组织接种到分化培养基(培养基配方为：MS培养基，添加激动素2.5mg/L和萘乙酸0.1mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)中，25±1℃条件下暗培养4周，得到诱导苗；然后将诱导苗转到生根培养基(培养基配方为：MS培养基，添加萘乙酸0.5mg/L，附加蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH为5.8)中，在25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2000～3000lx条件下培养2周，得到完整植株苗；打开组培苗瓶盖，置于25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2000～3000lx条件下炼苗5天，炼苗后单株分开移栽至盆钵中进行培养，培养基质为棕壤、沙和泥炭的混合物(体积比2:2:1)。炼苗后单株分开移栽至盆钵中进行培养，培养基质为棕壤、沙和泥炭的混合物(体积比2:2:1)。
植株生长60天后，分别统计分析对照组和辐射组每株植株叶色、叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎颜色、匍匐茎直径和分枝数。本发明从辐射组假俭草植株中挑选出叶片或匍匐茎颜色发生变异或者叶面积、匍匐茎长度、匍匐茎直径、分枝数发生变异的植株(对应数据与对照组平均值相差20％以上)作为候选样本。利用30对SSR引物(表1所示S1～S30)对候选植株和对照组植株进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较DNA变异情况。
经统计发现：获得完整植株23株，经表型性状分析，发现有5株完整植株在一项或多项指标发生了明显变异，其中的2株完整植株发生了DNA变异。其中1株匍匐茎长度较对照增加1.9倍(图5a)，对应引物S3扩增产物中250bp左右多出一条带(图6a)，引物S13扩增产物200bp左右条带变弱(图6b)，引物S28扩增产物中180bp多出一条带(图6c)；1株匍匐茎茎色变红且匍匐茎长度较对照增加1.9倍(图5b),对应引物S3扩增产物中250bp左右多出一条带(图6a)，引物S13扩增产物200bp左右条带变弱(图6b)，引物S28扩增产物中180bp多出一条带(图6c)。将有表型性状且DNA结构发生明显变异的植株茎段进行扦插繁殖，进一步鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。
本发明提供了一种本获得假俭草突变体的方法，将低温等离子体应用于假俭草体细胞诱变育种，一次诱变可获得23～35株完整植株，有5～10株完整植株在一种或多种性状上发生变异，性状变异率为21.73～28.57；有2～3株发生DNA变异，变异率为5.7～8.7％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种获得假俭草突变体的方法
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgtgtgtgt gcttggttgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtgcctcac aaatcgagac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaggcgat agacgagtgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggtggtga gtcgttgttg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtgatgaaa gcacctgaga 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggctacct tccctgcac 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
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<400> 7
atagcagaag cgaagatggc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagtactcc gtggtcgtgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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gcccaatcat ctcatcaaca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
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<400> 10
gatgaggacg aagaggacga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agagaagaaa ggccacacga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctacctgtt gctggctctc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agggctagaa ttaggaggcg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgtgaacgc tcactcact 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agggtaccat ccccttcctt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttcccaacac ctgaatcacc 20
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttgggctgc cgatattaag 20
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<400> 18
cagggtgctt ctctctcgtc 20
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<211> 20
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<400> 19
aaacaattgg cggcagtatc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 20
tgttttggtt tgttccaacg 20
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<212> DNA
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<400> 21
cgcaacagat caagcaagag 20
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<212> DNA
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ggctgctgat gatgatgatg 20
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<211> 20
<212> DNA
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actcccaaac tggacaatgc 20
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<212> DNA
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agccatctgc ccaacataat 20
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<212> DNA
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acgttctgat ggtgatgctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acagactgga tgatgcacga 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 27
aacaacagca acagcagcag 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 28
attttcgacc gggttagctt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgacgagat gagaatgaga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctaggtggga ggatgcgag 19
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<211> 19
<212> DNA
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acctgctcag gctcagctc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atagctctcc agcgacgatt 20
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<212> DNA
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cacctgctca agcaccatc 19
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<212> DNA
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<400> 34
tcaaggaacg aaacgaaacc 20
<210> 35
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<212> DNA
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<400> 35
ctttcagaac gcgagtttcc 20
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<400> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aaaatccatc caacagagcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atgggtcctg taagcagtgg 20
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcaattcaag ttgtggagca 20
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ttttgtaggc caacattctg c 21
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<212> DNA
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<400> 41
tgtagtgccg agcaattgag 20
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<212> DNA
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gctggccaac ctgtagagag 20
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<212> DNA
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<400> 43
gcaaccacaa caccaaacac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cttagccacc accacatcct 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtgacctcta gccatcggag 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
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acccaccaga cagtgagacc 20
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<212> DNA
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cattttcctt ccctgacacg 20
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tgagagaacc ctcataacac aga 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaaaggctg tctatgctgc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ccgttatctt gaggcagctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggaagacgaa tggctttcag 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
catgagcatc cacctcctct 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gtaaatggtt ttgcagcggt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
agagcagtac taggccgcac 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctcatctcc atggttcgat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tgtgccatat ttttcaagcg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ggaatgctcg agaaacgaag 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ggccacactg ctttaaccat 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tcgcggtaaa tcttttcgac 20
Claims (9)
1.一种获得假俭草突变体的方法，包括以下步骤：
1)取假俭草愈伤组织进行低温等离子体诱变，得诱变愈伤组织；所述低温等离子体诱变的条件为：处理功率为300～450W，处理时间为90s，介质为氦气和空气混合气体；
2)将步骤1)得到的所述诱变愈伤组织接种到分化培养基中进行分化培养，得诱导苗；所述分化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.8～3.5mg/L的激动素、0.05～0.2mg/L的萘乙酸、25～40g/L的蔗糖和1～5g/L的植物凝胶；
3)将步骤2)得到的所述诱导苗接种至生根培养基中进行生根培养，得完整植株；所述生根培养基以MS培养基为基本培养基，还包括0.2～1mg/L的萘乙酸、20～40g/L的蔗糖和1～5g/L的植物凝胶；
4)对步骤3)得到的所述完整植株进行筛选，得变异植株；
5)将步骤4)所述变异植株进行扦插繁育，获得假俭草突变体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述假俭草愈伤组织的制备方法，包括：以消毒后假俭草幼穗为外植体，接种到诱导培养基中诱导培养18～25d，得假俭草愈伤组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括2,4-二氯苯氧乙酸1～5mg/L、6-苄氨基嘌呤0.04～0.2mg/L、蔗糖20～40g/L和植物凝胶1～5g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述诱导培养为暗培养，培养温度为25±1℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氦气和空气的体积比为(5～10)：1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述分化培养为暗培养，培养时间为25～35d，培养温度为25±1℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述生根培养的温度为25±1℃，培养的光照时间12h/d，光照强度2000～3000lx，培养时间为10～18h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述筛选的方式包括植株表型性状测定及DNA变异检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植株表型性状包括叶色、叶形、匍匐茎长度、匍匐茎颜色、分枝数和茎粗。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述扦插繁育后，还包括：对得到的繁育植株进行PCR鉴定，筛选得到突变体。
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