CN110506634B - 一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法,通过构建鸢尾无性系组培苗,并将鸢尾无性系组培苗,用不同剂量化学诱变剂秋水仙素进行化学诱变处理,处理后继续培养,选取诱变处理40天时的组培苗,测定H2O2含量和POD活性,根据测定结果进行筛选,通过测定诱变处理后40天时的H2O2含量和POD活性判断适宜的化学诱变剂量,指标测得值越大,对应材料成活率越低,对应的化学诱变剂量越不合适,测得值越小,成活率越高,对应的化学诱变剂量越合适。本发明先构建鸢尾无性系组培苗作为诱变材料,克服了杂交后代种子为诱变材料时本身存在一定的性状分离的问题;本发明通过生理生化指标与成活率的相关性分析,筛选出2个与化学诱变显著相关的生理生化指标,可以用于化学诱变剂量和诱变时间的筛选,可快速缩小诱变系范围,减轻育种工作量。
Description
技术领域
本发明涉及化学诱变育种领域,具体涉及一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法。
背景技术
鸢尾属(Iris)为鸢尾科(Iridaceae)最大的属,属于多年生草本植物。鸢尾属植物不仅拥有较好的观赏价值和药用价值,而且还用于烟草、食品、化妆品、纺织等方面,因此具有较高的经济效益和社会效益,和巨大的市场潜力(姬常平,2013)。
在鸢尾众多类别中,路易斯安那鸢尾(Louisiana irises)作为一类杂种鸢尾,具有花色鲜艳丰富、适应性强、抗寒性强等优点,是较好的观花、观叶类水体绿化材料。路易斯安那鸢尾原产于美国,我国虽已开展了引种栽培、生长习性调查、组培快繁体系构建、抗性评价、育种等工作,但目前市场仍大量使用国外引进品种,缺乏我国自主育成的新优品种。近年来,路易斯安那鸢尾育种工作,主要为杂交授粉方法、杂交果实收获、杂交种子筛选以及通过离体胚培养促进杂交种子萌发。
诱变育种是指利用人工诱变的方法获得生物新品种的育种方法,主要通过辐射、激光、化学物质、太空(辐射、失重)的方法选育新品种,可提高突变率,并加速育种进程,但缺点是需要处理大量生物材料。在诱变育种中,辐射诱变和化学诱变使用较为广泛,已应用于不同物种和组织材料的诱变。化学诱变是通过化学试剂使生物DNA发生损伤和错误修复,产生突变体的技术。化学诱变剂大致包括碱基类似物、碱基修饰剂、嵌入染料、叠氮类化合物和一些抗生素等;具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点,因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术之一。此外,对于突变数量而言,化学诱变比辐射诱变更有效,有利于更好地培育花卉新品的优点。目前,常用的化学诱变剂主要包括:甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)、叠氮化钠(Sodium azide,NaN3)、秋水仙素。其中,秋水仙素作为一种高效的多倍体诱导剂,利用秋水仙素诱导多倍体目的性强,能达到定向改良花卉的目的,其诱导、选择、快繁都可在离体条件下完成,短期内繁殖出大量的多倍体植株。
总结以往的研究结果,不同物种的最佳秋水仙素浓度存在较大差异。例如红掌的最佳处理浓度为0.3%,处理时间为9d,其再生苗变异率可达60%,杂交兰为0.1%秋水仙素处理48h时诱导效果最佳;荷兰水仙适宜的浓度则为0.05%-0.01%处理1-2d。
鸢尾化学诱变育种的研究极少,基本集中在杂交育种和辐射诱变。利用秋水仙素开展鸢尾多倍体诱变育种可完善鸢尾育种体系,加快新优种质育种进程。然而,秋水仙素具有一定的剧毒性,对外植体有毒害作用,在诱变过程中常常使材料在处理过程中死亡,影响种子萌发、根的生长等。因此,鸢尾化学诱变剂量快速筛选的方法,对于提高诱变效率和诱导频率均有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法。
技术方案:本发明提供了一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法,包括以下步骤:
S1,构建鸢尾无性系组培苗;
S2,将S1中鸢尾无性系组培苗,用不同剂量化学诱变剂进行化学诱变处理,处理后继续培养,所述化学诱变剂为秋水仙素;
S3,选取步骤2中诱变处理40天时的组培苗,测定H2O2含量和POD活性;
S4,化学诱变剂量筛选,根据所述步骤S3的测定结果进行筛选,通过测定诱变处理后40天时的H2O2含量和POD活性判断适宜的化学诱变剂量,指标测得值越大,对应材料成活率越低,对应的化学诱变剂量越不合适,测得值越小,成活率越高,对应的化学诱变剂量越合适。
作为优选,步骤S1中,以鸢尾当年新萌发幼芽的茎尖为外植体,使用0.1%HgCl2对外植体消毒7min,初代培养基配方为MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.2mg/L,继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。培养温度为25℃±2℃,湿度60%-70%,光照强度2000lx,光照时间12h/d。
作为优选,所述步骤S2中化学诱变剂秋水仙素的浓度范围为0.1%~0.5%。
作为优选,步骤S1中以路易斯安那鸢尾品种‘Heather Stream’为试验材料,步骤S3中测定的H2O2含量和POD活性,2个指标的测定值分别不高于0.448μmol/g和942.57U/g·FW时,所述无性系组培苗成活率不低于30%。
有益效果
本发明先构建鸢尾无性系组培苗作为诱变材料,克服了杂交后代种子为诱变材料时本身存在一定的性状分离的问题;本发明使用组培苗作为诱变材料,更容易观测其表型(叶色、长势)变化,且可测定其叶片生理生化指标,通过综合指标评价不同剂量对鸢尾的影响;本发明通过生理生化指标与成活率的相关性分析,筛选出2个与化学诱变显著相关的生理生化指标,可以用于化学诱变剂量和诱变时间的筛选,可快速缩小诱变系范围,减轻育种工作量。
附图说明
图1:不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗MOD含量的影响。
图2:不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗H2O2含量的影响。
图3:不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗O2 -·生成速率影响。
图4;不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗SOD活性的影响。
图5:不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗CAT活性的影响。
图6:不同秋水仙素浓度对鸢尾组培苗POD活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,但不作为对本发明的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照本领域的公知手段。
1、鸢尾无性系的构建
以路易斯安那鸢尾品种‘Heather Stream’为试验材料,试验材料种植于双层塑料大棚内,构建其组培苗无性系。具体操作为:以当年新萌发幼芽的茎尖为外植体,使用0.1%HgCl2对外植体消毒7min,初代培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.2mg/L,继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。培养温度为25℃±2℃,湿度60%-70%,光照强度2000lx,光照时间12h/d。
2、秋水仙素诱变处理
选择长势一致、株高为2~3cm的‘Heather Stream’组培苗用于诱变处理。使用秋水仙素(Colchicine,美国SIGMA)进行化学诱变处理,秋水仙素浓度共设3个梯度,分别为0.1%、0.2%和0.3%,将不同剂量秋水仙素添加至培养基中,培养2d后将组培苗转接至新的继代培养基中。秋水仙素诱变处理后,培养条件(培养基、光照强度和周期、温湿度)与无性系构建时期一致,每30d转接至新配置的继代培养基。
3、诱变系叶片生理生化测定和成活率统计
诱变处理后的0、5、10、15、20、30和40d时取鸢尾组培苗叶片,按照各项生理生化指标测试需求称重后,冻存于-80℃冰箱。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量;利用羟胺氧化法测定超氧阴离子自由基(O2 -)产生速率;采用紫外吸收法测定H2O2含量;采用氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性;采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性;于40d时统计不同剂量诱变处理的成活率。
4、诱变处理后生理生化指标和成活率
如图所示,不同剂量秋水仙素处理后,0-30d期间均导致叶片中丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)的积累、超氧阴离子(O2 -)生成速率提高以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的增强;在30-40d期间,随着转接至新的培养基,以上生理生化指标均有所下降。相同生理生化指标,秋水仙素浓度越高其丙二醛和过氧化氢含量越高,超氧阴离子生成速率快,且抗氧化酶活性(SOD、CAT、POD)显著增强。0.1%、0.2%和0.3%秋水仙素处理后的成活率分别为55.56%、35.56%和32.22%。结合生理生化指标的检测结果,初步认为秋水仙素剂量、生理生化指标及成活率间可能存在一定的相关性。
5、诱变剂量、生理生化指标及成活率的相关性分析
通过SPSS 17.0软件,对不同诱变剂量处理后的生理生化指标(MDA、H2O2、O2 -、SOD、CAT和POD)与成活率进行相关性分析,相关性分析结果见下表1。对于秋水仙素处理的鸢尾组培苗叶片,部分生理生化指标间存在一定的相关性,例如O2 -生成速率与抗氧化酶(SOD、CAT和POD)活性存在显著相关性,CAT活性与SOD、POD活性显著相关;然而,MDA含量与其他5项生理生化指标不相关。
由相关性分析数据可见,不同浓度的秋水仙素处理后的诱变苗,其成活率与H2O2含量和POD活性在0.01水平上显著负相关。即H2O2含量高和POD活性高诱变苗成活率低。H2O2、和POD可作为预估秋水仙素诱变系成活率的指标,用于快速筛选合适的剂量。
表1各项生理生化指标与成活率相关性分析
注:**在0.01水平(双侧)上显著相关;*在0.05水平(双侧)上显著相关。
综上所述,H2O2含量和POD活性与秋水仙素诱变苗成活率密切相关,表现为这2个指标测得值越高,成活率越低。秋水仙素诱变处理后,对组培苗造成一定胁迫伤害,导致以上指标在0-30d期间测得的值随着时间的延长而增长,但在30d时转接至新配制的继代培养基后,30-40d期间这2个指标明显下降。因此,对于不同剂量的秋水仙素诱变处理,可通过测定诱变处理后40d时的H2O2含量和POD活性,2个指标测得值越大,对应材料成活率越低,所用诱变剂量越不合适,测得值越小,成活率越高,所用化学诱变剂量越合适。对于路易斯安那‘Heather Stream’品种,0.1%、0.2%和0.3%秋水仙素处理后的成活率分别为55.56%、35.56%和32.22%。因此,进行秋水仙素诱变处理时,在40d时测定其H2O2含量和POD活性,2个指标的测定值分别不高于0.448μmol/g和942.57U/g·FW时,可保证其一定的成活率,即不低于30%。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种鸢尾化学诱变剂量筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、构建鸢尾无性系组培苗,以路易斯安那鸢尾品种'Heather Stream'为试验材料;
具体为:以鸢尾当年新萌发幼芽的茎尖为外植体,使用0.1%HgCl2对外植体消毒7min,初代培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.2mg/L, 继代培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L,培养温度为25℃土2℃, 湿度60%~70%, 光照强度2000lx, 光照时间12h/d;
S2、将S1中鸢尾无性系组培苗,用不同剂量化学诱变剂进行化学诱变处理,处理后继续培养,所述化学诱变剂为秋水仙素;其中,化学诱变剂秋水仙素的浓度范围为0.1%~0.5%;
S3、选取步骤2中诱变处理40天时的组培苗,测定H2O2含量和POD活性;
测定的H2O2含量和POD活性,2个指标的测定值分别不高于0.448μmol/g和942.57U/g·FW时,所述无性系组培苗成活率不低于30%;
S4、化学诱变剂量筛选,根据所述步骤S3的测定结果进行筛选,通过测定诱变处理后40天时的H2O2含量和POD活性判断适宜的化学诱变剂量,指标测得值越大,对应材料成活率越低,对应的化学诱变剂量越不合适,测得值越小,成活率越高,对应的化学诱变剂量越合适。
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