CN112825767B - 一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法 - Google Patents

一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，涉及诱变育种技术领域。本发明所述方法，将冷等离子体技术应用于结缕草体细胞诱变过程中，显著提高了结缕草的诱变频率，降低了育种成本，加快了结缕草育种进程，为其他植物体细胞诱变育种提供借鉴，具有绿色、高效、操作简单等优良特性，在生物诱变育种领域具有广泛的应用前景。利用本发明所述方法，变异频率较常规诱变育种显著提高，可达到19.1％。

Description

一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法
技术领域
本发明属于诱变育种技术领域，具体涉及一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法。
背景技术
结缕草属(Zoysis Willd.)植物是禾本科画眉草亚科的多年生草本植物，是一种优良的暖季型草坪草和牧草，广泛应用于国内外暖温带到热带区域的园林绿化、运动场、固土护坡和盐碱地绿化草坪建植，具有重要的坪用、水土保持和饲用价值。然而结缕草生长速度缓慢严重阻碍了结缕草产业的发展。目前，结缕草新品种培育以系统选育、杂交育种为主，育种周期长效率低，严重阻碍了结缕草育种进程，如何快速选育速生优质品种一直是结缕草育种的科学难题。结缕草可育种子较少，种皮较厚，且营养体表皮也较厚，常规的方法很难达到良好的诱变效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，所述方法成本低、安全环保、诱变效率高，在较短时间内可获得优良突变体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，包括以下步骤：(1)利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导得到的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min；
(2)将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株；
(3)对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。
优选的，步骤(1)所述诱导包括将消毒后的幼嫩分蘖芽接种到诱导培养基中进行诱导，获得体细胞组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D 6～8mg/L、L-脯氨酸4～5g/L、5-氨基乙酰丙酸5～7mg/L、VB12～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。
优选的，步骤(1)所述诱导在暗环境中进行，温度为25±1℃，诱导的时间为20～30d。
优选的，所述消毒包括：用质量百分含量为15％的H2O2水溶液浸泡所述幼嫩分蘖芽10～15min，蒸馏水冲洗3～5min，然后用体积百分含量为50％的乙醇水溶液浸泡8～12min，蒸馏水冲洗10～15min。
优选的，步骤(1)所述等离子体诱变时，取直径0.4～0.7cm的颗粒状体细胞组织，置于直径6cm的石英玻璃培养皿中，将培养皿置于射频放电两块极板中间，距电极板的距离为1～2cm。
优选的，步骤(2)所述分化培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃，暗培养的时间为30d；
所述分化培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：NAA0.3～0.5mg/L、5-氨基乙酰丙酸1～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。
优选的，步骤(2)所述生根培养为光暗交替培养，光周期为12h/d，光照强度为2000～2500Lx，所述生根培养的温度为25±1℃，培养时间为10～15d；
所述生根培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：GR240.5～1.0μg/L、IBA0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。
优选的，步骤(3)所述表型包括叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度。
优选的，步骤(3)所述SRAP分子鉴定包括利用20对SRAP引物对对所述诱变植株与正常植株进行PCR扩增；所述20对SRAP引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.40所示。
本发明提供了一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，将冷等离子体技术应用于结缕草体细胞诱变过程中，显著提高了结缕草的诱变频率，降低了育种成本，加快了结缕草育种进程，为其他植物体细胞诱变育种提供借鉴，具有绿色、高效、操作简单等优良特性，在生物诱变育种领域具有广泛的应用前景。利用本发明所述方法，变异频率较常规诱变育种显著提高，可达到19.1％。与氦气冷等离子体相比，氧气冷等离子体放电产生的带电离子种类和活性粒子浓度增加，因此其诱变效果更佳。
附图说明
图1为实施例1～2中冷等离子体放电装置结构示意图；
图2为野生型结缕草；
图3为实施例1冷等离子体诱变创制的结缕草突变体及SARP分子标记结果图；
图4为实施例2冷等离子体诱变创制的结缕草突变体及SARP分子标记结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，包括以下步骤：(1)利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导得到的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min；
(2)将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株；
(3)对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。
本发明利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导得到的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min。本发明所述诱导优选包括将消毒后的幼嫩分蘖芽接种到诱导培养基中进行诱导，获得体细胞组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D 6～8mg/L、L-脯氨酸4～5g/L、5-氨基乙酰丙酸5～7mg/L、VB12～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L；所述诱导优选在暗环境中进行，温度为25±1℃，诱导的时间为30d。本发明在进行所述诱导前优选还包括消毒，所述消毒优选包括：用质量百分含量为15％的H2O2水溶液浸泡所述幼嫩分蘖芽15min，蒸馏水冲洗3～5min，然后用体积百分含量为50％的乙醇水溶液浸泡8min，蒸馏水冲洗10min。本发明所述幼嫩分蘖芽的长度优选为0.5～1cm。
本发明所述诱导培养基中2,4-D具有诱导愈伤组织的作用，L-脯氨酸为愈伤组织诱导提供碳源且作为渗透调节物质保护细胞免受损伤，5-氨基乙酰丙酸可以促进生芽，VB1可以防止愈伤组织褐化，蔗糖可以提供碳源，植物凝胶可以固定支撑愈伤组织。本发明对所述诱导培养基中各原料的来源并没有特殊限定，优选为本领域的常规市售试剂。
本发明在进行所述等离子体诱变时，优选取直径0.4～0.7cm的颗粒状体细胞组织，置于直径6cm的石英玻璃培养皿中，将培养皿置于射频放电两块极板中间，距电极板的距离为1～2cm，封闭反应体系，抽真空，通入放电气体10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min。
得诱变体后，本发明将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株。本发明所述分化培养优选为暗培养，所述暗培养的温度优选为25±1℃，暗培养的时间优选为30d；所述分化培养用培养基以MS培养基为基本培养基，优选还包括：NAA 0.3～0.5mg/L、5-氨基乙酰丙酸1～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。本发明所述生根培养优选为光暗交替培养，光周期为12h/d，光照强度为2000～2500Lx，所述生根培养的温度为25±1℃，培养时间为10～15d；所述生根培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：GR240.5～1.0μg/L、IBA 0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。本发明对所述分化培养用培养基和生根培养用培养基各原料的来源并没有特殊限定，优选为本领域的常规市售试剂。
得诱变植株后，本发明对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体。本发明所述表型优选包括叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度。本发明所述SRAP分子鉴定包括利用20对SRAP引物对所述诱变植株与正常植株进行PCR扩增；所述20对SRAP引物对的核苷酸序列如表1所示。
表1 SRAP引物序列表
Figure BDA0002953741660000041
Figure BDA0002953741660000051
Figure BDA0002953741660000061
本发明所述PCR扩增的体系以10μl计，优选包括：2×TaqPCRMaster Mix 5μl、F/R引物各0.5μl、DNA模板1.5μl和ddH2O 2.5μl；且扩增程序优选包括：94℃预变性3min；94℃变性1min，37℃退火50s，72℃延伸1min，4个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，反应结束后4℃保存。本发明优选在所述PCR扩增后利用扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以比较凝胶DNA条带数目、条带位置和条带强弱的差异情况。
下面结合实施例对本发明提供的一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取结缕草品种‘Diamond’匍匐茎上长度0.5cm的幼嫩分蘖芽(图2)，15％的H2O2浸泡15min，蒸馏水冲洗3min，然后用50％酒精浸泡8min，蒸馏水冲洗10min，消毒灭菌后接接种到诱导培养基中(培养基配方为：MS培养基，添加2,4-D 6mg/L、L-脯氨酸4g/L、5-氨基乙酰丙酸5mg/L、VB12mg/L、蔗糖25g/L和植物凝胶3g/L)，25±1℃暗培养30d，获得结缕草体细胞组织。
取5个直径0.4cm的颗粒状的体细胞组织，置于如图1所示冷等离子体放电装置内直径6cm的石英玻璃培养皿中，将培养皿置于射频放电两块极板中间，距电极板的距离为1cm，封闭反应体系，抽真空，通入氧气10min，压强为15Pa，处理功率为650W，诱变8min。
将冷等离子体处理后的体细胞组织接种到分化培养基(MS培养基添加NAA 0.3mg/L、5-氨基乙酰丙酸1mg/L、蔗糖25g/L和植物凝胶3g/L)，25±1℃暗培养20d，得到诱变分化苗；将诱变分化苗转到生根培养基(培养基配方为：MS培养基添加GR240.5μg/L、IBA 0.1mg/L、蔗糖25g/L和植物凝胶3g/L，pH为6.0)，置于25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2500Lx下培养10d；打开组培苗瓶盖，置于25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2500Lx条件下炼苗7d，炼苗后单株分开移栽至盆钵(直径25cm，高度30cm)中进行培养，培养基质为黄棕壤、沙和泥炭的混合物(体积比1:1:1)。植株生长5个月后，分别统计分析未处理组(对照组)和冷等离子体诱变组植株叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度。
本发明从诱变组假俭草植株中挑选出叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度发生变异的植株(对应数据与对照组平均值相差20％以上)。利用表1所示的20对SRAP引物对变异植株和对照组植株进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较DNA变异情况。
本发明所述DNA检测的PCR扩增体系优选为10μl体系，包括：5μl 2*TaqPCRMasterMix、F/R引物各0.5μl、1.5μl DNA模板、2.5μl ddH2O。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，37℃退火50s，72℃延伸1min，4个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，反应结束后4℃保存。本发明优选对DNA检测后的扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较凝胶DNA条带数目、条带位置和条带强弱的差异情况。
统计结果如表2和图3所示，共获得诱变植株77株，经表型性状分析，发现有35株诱变植株在一项或多项指标发生了明显变异：21株叶长发生了变异，变异幅度为-27.9％-55.8％，2株叶宽发生了变异，变异幅度为24.8％-25.3％，15株节间长度发生了变异，变异幅度为-30.4％-52.2％，6株节间直径发生了变异，变异幅度为-26.5％-33.1％，18株草层高度发生了变异，变异幅度为-46.9％-69.9％。经SRAP分子鉴定，其中的15株发生了DNA变异。将表型性状且DNA发生变异的植株匍匐茎茎段(包含前三个节)进行扦插繁殖，生长三个月后，进一步鉴定突变性状，获得13个稳定遗传的突变体，诱变频率为16.9％。
表2冷等离子体诱变处理后Diamond结缕草发生变异植株数
Figure BDA0002953741660000071
实施例2
取沟叶结缕草长度1cm的幼嫩分蘖芽，用15％的H2O2浸泡15min，蒸馏水冲洗5min，然后用50％酒精浸泡8min，蒸馏水冲洗10min，消毒后的分蘖芽接种到诱导培养基(MS培养基、2,4-D 8mg/L、L-脯氨酸5g/L、5-氨基乙酰丙酸7mg/L，VB13mg/L，蔗30g/L和植物凝胶5g/L)中，25±1℃暗培养30d，获得结缕草体细胞。
取5个直径0.7cm的颗粒状的体细胞组织，置于直径6cm的石英玻璃培养皿中，将培养皿置于射频放电两块极板中间，距电极板的距离为2cm，封闭反应体系，抽真空，通入氧气12min，压强为30Pa，处理功率为750W，诱变12min。将冷等离子体处理后的体细胞组织接种到分化培养基(MS培养基添加NAA 0.5mg/L、5-氨基乙酰丙酸3mg/L、蔗糖25g/L和植物凝胶5g/L，pH为6.0)，25±1℃暗培养20d，得到诱变分化苗；
将诱变分化苗转到生根培养基(MS培养基添加GR241.0μg/L、IBA0.2mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶5g/L，pH为6.0)，置于25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2000Lx下培养10d；打开组培苗瓶盖，置于25±1℃、光照时间12h/d、光照强度2000Lx条件下炼苗7d，炼苗后单株分开移栽至盆钵(直径25cm，高度30cm)中进行培养，培养基质为黄棕壤、沙和泥炭的混合物(体积比1:1:1)。植株生长5个月后，分别统计分析未处理组(对照组)和冷等离子体诱变组植株叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度。
本发明从诱变组假俭草植株中挑选出叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度发生变异的植株(对应数据与对照组平均值相差20％以上)。利用与实施例1相同的PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较DNA变异情况。
统计结果如表3和图4所示，共获得诱变植株47株，经表型性状分析，发现有22株诱变植株在一项或多项指标发生了明显变异：11株叶长发生了变异，变异幅度为-59.8％-28.3％；5株叶宽发生了变异，变异幅度为-36.9％-24.7％；8株节间长度发生了变异，变异幅度为-41.1％-42.2％；5株节间直径发生了变异，变异幅度为-31.2％-21.2％；15株草层高度发生了变异，变异幅度为-74.7％-26.3％。经SRAP分子鉴定，其中的11株发生了DNA变异。将表型性状且DNA发生明显变异的植株匍匐茎茎段(包含前三个节)进行扦插繁殖，生长三个月后，进一步鉴定突变性状，获得9个稳定遗传的突变体，诱变频率为19.1％。
表3冷等离子体诱变处理后Diamond结缕草发生变异植株数
Figure BDA0002953741660000091
综上，利用本发明所述方法，将低温等离子体应用于结缕草体细胞诱变育中，一次诱变可获得47～77株植株，有9～13株完整植株在一种或多种性状且DNA发生变异，变异率为16.9～19.1％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法
<160> 40
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gactgcgtac gaattgag 18
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgagtccaaa ccggaca 17
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gactgcgtac gaatttga 18
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gactgcgtac gaattaat 18

Claims (6)

1.一种利用氧气冷等离子体诱变创制结缕草突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用结缕草的幼嫩分蘖芽诱导体细胞组织，对诱导的体细胞组织进行冷等离子体诱变，得诱变体；所述冷等离子体诱变在真空条件下进行，且在进行诱变时通入放电气体氧气10～12min，压强为15～30Pa，处理功率为600～750W，诱变8～12min；
(2)将所述诱变体依次进行分化培养和生根培养，得诱变植株；
(3)对所述诱变植株进行表型和SRAP分子鉴定，得变异植株；对所述变异植株进行扦插繁殖，鉴定突变性状，获得稳定遗传的突变体；
步骤(1)所述诱导包括将消毒后的幼嫩分蘖芽接种到诱导培养基中进行诱导，获得体细胞组织；所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D 6～8mg/L、L-脯氨酸4～5g/L、5-氨基乙酰丙酸5～7mg/L、VB12～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L；
所述消毒包括：用质量百分含量为15％的H2O2水溶液浸泡所述幼嫩分蘖芽10～15min，蒸馏水冲洗3～5min，然后用体积百分含量为50％的乙醇水溶液浸泡8～12min，蒸馏水冲洗10～15min；
步骤(1)所述冷等离子体诱变时，取直径0.4～0.7cm的颗粒状体细胞组织，置于直径6cm的石英玻璃培养皿中，将培养皿置于射频放电两块极板中间，距电极板的距离为1～2cm。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导在暗环境中进行，温度为25±1℃，诱导的时间为20～30d。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述分化培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃，暗培养的时间为30d；
所述分化培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：NAA 0.3～0.5mg/L、5-氨基乙酰丙酸1～3mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述生根培养为光暗交替培养，光周期为12h/d，光照强度为2000～2500Lx，所述生根培养的温度为25±1℃，培养时间为10～15d；
所述生根培养用培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：GR240.5～1.0μg/L、IBA 0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30g/L和植物凝胶3～5g/L。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述表型包括叶长、叶宽、节间长度、节间直径和草层高度。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述SRAP分子鉴定包括利用20对SRAP引物对对所述诱变植株与正常植株进行PCR扩增；所述20对SRAP引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.40所示。
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