CN108070573A

CN108070573A - 毛竹二乙烯基还原酶基因及其蛋白和应用

Info

Publication number: CN108070573A
Application number: CN201711362467.0A
Authority: CN
Inventors: 任育军; 缪颖; 黄晨星
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2018-05-25

Abstract

本发明提供毛竹二乙烯基还原酶基因及其蛋白和应用，属于生物技术领域。所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在黄和绿两种叶色毛竹实生苗中进行大量基因表达筛选鉴定，发现编码二乙烯基还原酶蛋白的基因在黄叶实生苗中缺失，提供一种来源于毛竹中的二乙烯基还原酶蛋白编码基因及其氨基酸序列，目的用于在毛竹实生苗中鉴定黄绿叶色突变体，提升毛竹实生苗的育种品质，鉴定高品质毛竹实生苗用于生产实践和工厂造林，提高毛竹竹材品质和生产效率。

Description

毛竹二乙烯基还原酶基因及其蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种来源于毛竹中的二乙烯基还原酶蛋白编码基因、其氨基酸序列及其应用。

背景技术

叶绿体（chloroplast）是植物绿色细胞中存在的有色质体。叶绿体中含有大量的叶绿素（chlorophyll，Chl），是植物进行光合作用（photosynthesis）的主要色素。它的作用是捕获光能并将光能转移到反应中心转变为化学能，因此对植物的生长发育及相关经济物质（可食用的营养器官、生殖器官或种子）的形成和积累具有重要的调节作用。高等植物的叶绿素合成是一个由许多酶共同参与的复杂过程。该过程是在所有环节的精密调控下进行的，任何一个环节发生突变都可能影响Chl的合成，从而导致植物叶色变异甚至植株死亡。

目前国内外关于植物叶色变异产生机制的研究已经有了很多的报道，除了环境因素和表观遗传修饰因素导致的叶色变异外，由基因突变导致的叶色变异在所有影响因素中占据着极大的比例。其中二乙烯基还原酶（Divinyl reductase, DVR）作为叶绿素合成过程中的一个关键酶已经在绿硫细菌、紫细菌、杜氏盐藻、拟南芥、水稻、黄瓜、玉米和柑橘中得到鉴定。其中拟南芥、水稻、黄瓜和玉米中鉴定的二乙烯基还原酶已经被证明能将联乙烯叶绿素酸酯a转化为单乙烯叶绿素酸酯a，从而在这些植物的叶绿素正常合成中发挥重要作用，这些酶编码基因的突变在拟南芥和水稻中显示会导致植株黄化、叶绿素含量下降、植株矮小、发育迟缓和结实率低等农艺性状。

毛竹（Moso bamboo, Phyllostachys heterocycla）是禾本目禾本科刚竹属单轴散生型常绿乔木状竹类植物。在毛竹实生苗培育过程中，竹种在萌发后会出现两种叶色相异的实生苗，一种为绿色叶片的实生苗（绿苗），另一种为黄色叶片的实生苗（黄苗）。黄苗较绿苗生长缓慢，且生长到一定阶段后会出现死亡现象，这种实生苗后期会被种植户大量剔除，只留下绿苗继续种植并用于林区造林和城市绿化。由于迄今为止还未找到导致黄苗产生的分子机制，给育苗前期带来了很大的筛选压力和人力物力成本。另外，由于不清楚留存的绿苗中是否还混杂有黄苗的致病因素，以不良绿苗作为原种进行竹鞭扩繁和大规模造林均存在很大的风险，对后期毛竹材品质的形成和经济价值均可能产生重大的影响。本发明通过大量筛选，发现一个导致毛竹叶色变化的关键因子——二乙烯基还原酶，这个酶编码的基因PhDVR在毛竹黄色实生苗中的表达缺失。

根据我们检索的文献和专利资料显示，目前还未在竹类中有关于二乙烯基还原酶蛋白、其基因序列、氨基酸序列和突变表型的文献和专利。因此，本发明具有极高的创新性和应用价值，可应用于竹类良种选育和品种创新。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于毛竹中的二乙烯基还原酶蛋白编码基因、其氨基酸序列及其应用，黄和绿两种叶色毛竹实生苗中进行大量基因表达筛选鉴定，发现编码二乙烯基还原酶蛋白的基因在黄叶实生苗中缺失。本发明在于提供一种来源于毛竹中的二乙烯基还原酶蛋白编码基因及其氨基酸序列，目的用于在毛竹实生苗中鉴定黄绿叶色突变体，提升毛竹实生苗的育种品质，鉴定高品质毛竹实生苗用于生产实践和工厂造林，提高毛竹竹材品质和生产效率。本发明的次要目的是利用该基因进行竹类良种选育和品种创新。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

毛竹二乙烯基还原酶基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。

毛竹二乙烯基还原酶基因编码的毛竹二乙烯基还原酶蛋白，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的毛竹二乙烯基还原酶基因在毛竹实生苗、定植苗及成熟黄、绿叶植株鉴定和绿苗培育以及竹类良种选育和品种创新中的应用。

本发明的优点在于：首次提供一种来源于毛竹中的二乙烯基还原酶蛋白编码基因及其氨基酸序列，该基因可以用于在毛竹实生苗中鉴定黄、绿叶突变体，提升毛竹实生苗的育种品质，鉴定高品质毛竹实生苗用于生产实践和工厂造林，提高毛竹竹材品质和生产效率，同时本发明还可应用于竹类良种选育和品种创新。

附图说明

图1 萌发的毛竹实生苗。

图2 毛竹DVR基因在黄苗中的表达缺失。

具体实施方式

1、毛竹实生苗黄叶突变体产生的基因突变统计学分析

毛竹为二倍体植株。以萌发5周的实生苗作为试验对象，分4批统计黄苗和绿苗所占的比例，计算黄苗和绿苗的分离比，利用卡方计算期望值和实际值之间的显著性差异，从而确定毛竹实生苗叶色突变相关基因的突变类型。

2、导致黄苗产生的突变基因的筛选和鉴定

分别收集黄苗和绿苗的叶片。按照Trizol法总RNA提取的步骤提取叶片中的总RNA，反转录后获得的全长转录组总cDNA作为模板。采用大规模基因表达筛选策略，比较各种与叶色形成相关的基因在黄、绿两种叶色毛竹实生苗中的表达水平。寻找可能与毛竹黄叶突变体形成直接相关的基因，筛选到一个在拟南芥和水稻中编码二乙烯基还原酶蛋白基因（DVR）的毛竹基因组编码的类似基因。

3、毛竹DVR基因的克隆

设计如下引物：

PhDVR-FP: 5’ - ATGCGGCAGGTGAAGGGGAGCCCCGC - 3’；

PhDVR-RP: 5’ - CTAGAAGATGGTCTGCTCACCGAGCTCC - 3’；

以毛竹（Moso bamboo, Phyllostachys heterocycla）绿色实生苗叶片提取的DNA为模板，用引物PhDVR-FP和PhDVR-RP进行高保真PCR扩增，将扩增得到的产物连接到pEASY^®-Blunt simple（Transgen Biotech）克隆载体上构建成pEASY-Blunt-PhDVR载体，然后转化到大肠杆菌DH5ɑ菌株中，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆后测序，鉴定毛竹中全长的DVR基因的序列。

4、毛竹DVR基因编码蛋白CDS序列的克隆

使用扩增引物同上。以毛竹（Moso bamboo, Phyllostachys heterocycla）绿色实生苗叶片提取的总RNA或总mRNA反转录成的cDNA为模板，用引物PhDVR-FP和PhDVR-RP进行高保真PCR扩增，将扩增得到的产物连接到pEASY^®-Blunt simple（Transgen Biotech）克隆载体上构建成pEASY-Blunt-PhDVR-CDS载体，然后转化到大肠杆菌DH5ɑ菌株中，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆后测序，鉴定毛竹中DVR基因编码蛋白的CDS序列。

5、毛竹DVR基因的结构和蛋白序列

通过比较毛竹PhDVR基因的全长序列和其对应的CDS序列，鉴定毛竹中DVR基因的外显子和内含子数量和分布情况。根据CDS的序列推算出PhDVR蛋白的氨基酸组成和分子量。

实施例1毛竹实生苗黄叶突变体相关突变基因的鉴定

一、毛竹实生苗黄叶突变体的分离比例统计

萌发5周的实生苗群体中存在两种如图1所示叶色有显著差异的实生苗，一种为黄色，一种为绿色。统计两种实生苗在每个萌发的独立群体中所占的比例，并计算可能的分离比，显示接近单基因突变的孟德尔遗传分离比3:1。按照单基因突变的分离比计算每个群体中黄、绿实生苗的期望值，利用卡方公式计算期望值和实际值之间的显著性差异，获得如下表1中的结果。显示与期望值相比，实际值没有显示出显著性差异，表明萌发的毛竹实生苗群体中黄、绿苗的比例遵循单基因突变的孟德尔遗传分离比。毛竹实生苗出现黄叶表型的原因是由单个基因的突变造成的。

表1 毛竹实生苗黄苗和绿苗分离比统计

二、毛竹实生苗黄叶突变体致病关联基因的鉴定

通过在黄苗和绿苗中进行大规模叶色相关基因的表达分析，发现一个与拟南芥和水稻中编码二乙烯基还原酶（DVR）蛋白类似的基因的表达在黄苗中缺失，而在绿苗中表达正常，如图2所示。因黄苗的叶色表型和拟南芥和水稻中DVR基因突变导致的叶色表型极为相似，确定这个在毛竹黄苗中未表达的DVR类似基因应该是导致实生苗叶色变异的直接相关基因。

可以利用本发明中所涉及的DVR基因的引物作为分子探针在毛竹实生苗中鉴定黄叶突变体从而筛选具有完整DVR基因的优良绿叶实生苗，作为竹类良种选育和品质创新的一项重要指标。

实施例2：毛竹二乙烯还原酶基因的克隆及其基因结构分析

一、毛竹二乙烯还原酶基因的克隆

以绿叶毛竹中抽提的基因组DNA作为模板，以一对PhDVR-FP和PhDVR-RP引物进行高保真PCR扩增，将片段克隆到pEASY^®-Blunt simple（Transgen Biotech）载体上后获得pEASY-Blunt-PhDVR载体，转化大肠杆菌DH5ɑ并通过蓝白斑筛选获得阳性克隆后送公司测序。测序结果表明：扩增得到的片段具有SEQ ID NO.1所示的序列，将其命名为PhDVR，即为毛竹中编码二乙烯基还原酶（DVR）蛋白的编码基因序列，长度为1564 bp。

二、毛竹二乙烯还原酶基因CDS序列克隆

以绿叶毛竹中抽提的总RNA或mRNA作为模板，反转录成模板总cDNA。以一对PhDVR-FP和PhDVR-RP引物进行高保真PCR扩增，将片段克隆到pEASY^®-Blunt simple（TransgenBiotech）载体上后获得pEASY-Blunt-PhDVR-CDS载体，转化大肠杆菌DH5ɑ并通过蓝白斑筛选获得阳性克隆后送公司测序。测序结果表明：扩增得到的片段具有以下所示的序列，将其命名为PhDVR-CDS，即为毛竹中二乙烯基还原酶（DVR）蛋白编码基因的CDS序列如SEQ IDNO.2所示，长度为837 bp。

三、毛竹二乙烯还原酶基因的结构和蛋白序列

通过比较毛竹中二乙烯还原酶基因的基因序列和CDS序列，发现在全长基因序列的第89-815 bp之间有一个长度为727 bp的内含子，而水稻和拟南芥中的DVR基因均不含有内含子，表明毛竹中的PhDVR与水稻和拟南芥中的DVR基因除了CDS的长度上存在差异外（水稻OsDVR基因长度为1218 bp，拟南芥AtDVR长度为1254 bp），在基因结构上也存在很大差异。毛竹PhDVR在植物进化上可能具有一定的标志性，可作为单子叶植物物种进化的一个分子marker。

将毛竹PhDVR基因扣除掉内含子区域的727 bp后剩下的837 bp CDS序列编码一个由278个氨基酸组成，分子量约为30 kDa的蛋白质，具有如SEQ ID NO.3所示的序列，命名为PhDVR-P。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 毛竹二乙烯基还原酶基因及其蛋白和应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1564

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcggcagg tgaaggggag ccccgcttta agaagcttct ggaaggtggg ctttactggg 60

ctaagtgtta cggcagcctt ccctgcgagg tgcttaggcc catcggcccg gatgatttga 120

gtcctgtgcc aagctctctt gactcttgtt tccgaggtgg ttttaatccg gcctatttcc 180

aagtggagat cagctgacgt aatccattgc ctccgcactc ccggataccc tcgacccgcc 240

accagtccac caccacaaac gcccgacggc tccccacgct cgatactgat actcccgcct 300

ccacgtcgcc ctccgtctcc cgcatttcgt cgagcacacc atggccgccc tcctcctctc 360

ctcccacctc cccaccgcta caccgacctc ctcctccacc tccgctcgcc ccactcctcg 420

cttcctctcc ttccccaaca ccattccaaa cgcccgcctc cgccgctgcg gcccgctcct 480

cgcatcctcc gccccacctc cgccgccaac gcctgctccg accgccgcag cccagccctt 540

tcgctccctg gccccctccg agaccaccgt cctcgtcacc ggcgccacgg gctacatcgg 600

tcgcttcgtc gtccgcgagc tgctccgccg gggacaccgt atcctcgccg tcgcccgccc 660

ccgcagcggc gtgcgcggcc gcaactcccc ggaggacgtc gtcgccgacc tggcccctgc 720

ccgcgtcgtc ttctccgacg tcaccgaccc ggacgcgctc ctcgccgacc tctccgccca 780

cggccccgtc cacgccgccg tctgctgcct cgccagccgc ggcggcggcg tgcaggactc 840

ttggagcgtc gactaccgcg ccacgctgca caccctccag gcggcccgca gcctcggcgc 900

cgcccacttc gtcctcctct ccgccatctg cgtccagaag ccgctcctcg agttccagcg 960

cgccaagctc aagttcgagg acgagctcgc cgccgaggcg gcccgggacc ccgccttcac 1020

ctacagcatc gtccgcccca ccgccttctt caagagcctc ggcggccagg tcgagaccgt 1080

caagaacggc cagccctacg tcatgttcgg cgacggcagg ctctgcgcct gcaagcccat 1140

cagcgaggag gacctcgccg ccttcatcgc cgactgcatc ttcgacgagg acaaggctaa 1200

caaggtgctc cccgtcggcg ggccggggaa ggcgctcacg ccgctggagc agggggagct 1260

gctgttccgg ctgctcggcc gcgagcccaa gttcatcaag gtgccgatcc agatcatgga 1320

tggcgtaatc tgggtgctcg atggactggc caaggtgttc ccggggctgg aggacgccgc 1380

ggagttcggc aagattggga ggtactacgc gtcggagagc atgctcctgc tggacccgga 1440

gaccggggag tacagcgacg agaagacgcc gagttatggc aaggacacgc tcgagcagtt 1500

ctttgagagg gtgataaggg aaggcatggt ggggcaggag ctcggtgagc agaccatctt 1560

ctag 1564

<210> 2

<211> 837

<212> DNA

<213> CDs序列

<400> 2

atgcggcagg tgaaggggag ccccgcttta agaagcttct ggaaggtggg ctttactggg 60

ctaagtgtta cggcagcctt ccctgcgagc cgcggcggcg gcgtgcagga ctcttggagc 120

gtcgactacc gcgccacgct gcacaccctc caggcggccc gcagcctcgg cgccgcccac 180

ttcgtcctcc tctccgccat ctgcgtccag aagccgctcc tcgagttcca gcgcgccaag 240

ctcaagttcg aggacgagct cgccgccgag gcggcccggg accccgcctt cacctacagc 300

atcgtccgcc ccaccgcctt cttcaagagc ctcggcggcc aggtcgagac cgtcaagaac 360

ggccagccct acgtcatgtt cggcgacggc aggctctgcg cctgcaagcc catcagcgag 420

gaggacctcg ccgccttcat cgccgactgc atcttcgacg aggacaaggc taacaaggtg 480

ctccccgtcg gcgggccggg gaaggcgctc acgccgctgg agcaggggga gctgctgttc 540

cggctgctcg gccgcgagcc caagttcatc aaggtgccga tccagatcat ggatggcgta 600

atctgggtgc tcgatggact ggccaaggtg ttcccggggc tggaggacgc cgcggagttc 660

ggcaagattg ggaggtacta cgcgtcggag agcatgctcc tgctggaccc ggagaccggg 720

gagtacagcg acgagaagac gccgagttat ggcaaggaca cgctcgagca gttctttgag 780

agggtgataa gggaaggcat ggtggggcag gagctcggtg agcagaccat cttctag 837

<210> 3

<211> 278

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 3

Met Arg Gln Val Lys Gly Ser Pro Ala Leu Arg Ser Phe Trp Lys Val

1 5 10 15

Gly Phe Thr Gly Leu Ser Val Thr Ala Ala Phe Pro Ala Ser Arg Gly

20 25 30

Gly Gly Val Gln Asp Ser Trp Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Leu His

35 40 45

Thr Leu Gln Ala Ala Arg Ser Leu Gly Ala Ala His Phe Val Leu Leu

50 55 60

Ser Ala Ile Cys Val Gln Lys Pro Leu Leu Glu Phe Gln Arg Ala Lys

65 70 75 80

Leu Lys Phe Glu Asp Glu Leu Ala Ala Glu Ala Ala Arg Asp Pro Ala

85 90 95

Phe Thr Tyr Ser Ile Val Arg Pro Thr Ala Phe Phe Lys Ser Leu Gly

100 105 110

Gly Gln Val Glu Thr Val Lys Asn Gly Gln Pro Tyr Val Met Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Arg Leu Cys Ala Cys Lys Pro Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala

130 135 140

Ala Phe Ile Ala Asp Cys Ile Phe Asp Glu Asp Lys Ala Asn Lys Val

145 150 155 160

Leu Pro Val Gly Gly Pro Gly Lys Ala Leu Thr Pro Leu Glu Gln Gly

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Arg Leu Leu Gly Arg Glu Pro Lys Phe Ile Lys Val

180 185 190

Pro Ile Gln Ile Met Asp Gly Val Ile Trp Val Leu Asp Gly Leu Ala

195 200 205

Lys Val Phe Pro Gly Leu Glu Asp Ala Ala Glu Phe Gly Lys Ile Gly

210 215 220

Arg Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Met Leu Leu Leu Asp Pro Glu Thr Gly

225 230 235 240

Glu Tyr Ser Asp Glu Lys Thr Pro Ser Tyr Gly Lys Asp Thr Leu Glu

245 250 255

Gln Phe Phe Glu Arg Val Ile Arg Glu Gly Met Val Gly Gln Glu Leu

260 265 270

Gly Glu Gln Thr Ile Phe

275

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcggcagg tgaaggggag ccccgc 26

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctagaagatg gtctgctcac cgagctcc 28

Claims

1.毛竹二乙烯基还原酶基因，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的毛竹二乙烯基还原酶基因，其特征在于：所述基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的毛竹二乙烯基还原酶基因编码的毛竹二乙烯基还原酶蛋白，其特征在于：所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求1所述的毛竹二乙烯基还原酶基因在毛竹实生苗、定植苗及成熟黄、绿叶植株鉴定和绿苗培育中的应用。

5.如权利要求1所述的毛竹二乙烯基还原酶基因在竹类良种选育和品种创新中的应用。