CN103710266B - 一株超高放氢藻株及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一株放氢藻株及其应用。本发明提供重组莱茵衣藻，为将质粒pChlamiRNA3导入莱茵衣藻中，得到重组莱茵衣藻。所述莱茵衣藻为莱茵衣藻CC400。本发明的实验证明，本发明将pChlamiRNA3质粒转入莱茵衣藻藻种CC400（mt+）中，得到重组莱茵衣藻，且在重组莱茵衣藻中筛选得到突变藻株91号，在用气相色谱测定其产氢量时，突变藻株91号与野生型相比，持续产氢时间更长，达到600小时（野生型产氢时间可达到200小时）；总产氢量更高，达到13349毫升/升培养物（野生型可达到300毫升/升培养物）,是野生型的44.5倍。

Description

一株超高放氢藻株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株超高放氢藻株及其应用。
背景技术
由于矿物资源的日益枯竭，寻找清洁的替代能源已成为一项迫切的课题。氢是宇宙间最简单同时也是最为丰富的元素，被普遍认为是一种最有吸引力的替代能源。传统的化学产氢方法采用电解水或热解石油、天然气，生产成本也普遍较高。藻类光合制氢是微藻利用太阳能裂解水释放氢气的生物过程，是实现氢能可持续生产的重要途径之一。
莱茵衣藻是古老的单细胞真核绿藻，广泛用于光合作用与产氢机理研究。其遗传转化简单，基因组测序已于2007年完成，这为工程藻株的获得奠定了坚实的基础。高放氢藻株的筛选一直是国际前沿热点，主要是围绕着降低天线色素含量，提高光能利用率等方面开展相关研究工作。高放氢藻株的获得，不仅对于科学研究有重要意义，而且在氢能源的开发应用方面也有广阔的前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组莱茵衣藻。
本发明提供的重组莱茵衣藻，为将质粒pChlamiRNA3导入莱茵衣藻中，得到重组莱茵衣藻。
上述重组莱茵衣藻中，所述莱茵衣藻为莱茵衣藻CC400。
上述重组莱茵衣藻中，所述重组莱茵衣藻为莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）突变藻株91号，其保藏号为CGMCCNO.8706。
上述的重组莱茵衣藻在产氢中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种获得氢的方法。
本发明提供的获得氢的方法，为发酵上述的重组莱茵衣藻，得到氢。
上述方法中，所述发酵采用的培养基为缺硫TAP培养液。
上述方法中，所述发酵条件为25℃、连续光照、持续搅拌，所述发酵时间为0-600小时，且不为0。
上述方法中，所述光照的强度为110μEs-1m-2，所述搅拌的转速为200rpm。
本发明中莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）突变藻株91号，于2013年12月31日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCCNO.8706，分类命名为莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）。
本发明的实验证明，本发明将pChlamiRNA3质粒转入莱茵衣藻藻种CC400（mt+）中，得到重组藻株，且在重组藻株中筛选得到突变藻株91号，在用气相色谱测定其产氢量时，突变藻株91号与野生型相比，持续产氢时间更长，达到600小时（野生型产氢时间可达到200小时）；总产氢量更高，达到13349毫升/升培养物（野生型可达到300毫升/升培养物）,是野生型的44.5倍。与已有报道相比，本发明中所述藻株产氢时间更持久，产氢量更高。
附图说明
图1为重组藻株的产氢量检测（0-120h）
图2为突变藻株的产氢量检测（0-600h）
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分如下：
莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻种CC400（mt+）（以下也称为野生型藻株）和质粒pChlamiRNA3均购自杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamycenter，http://www.chlamy.org/)；质粒pChlamiRNA3中均含有巴龙霉素抗性基因。
下述实施例中所用的培养基：
1）TAP培养液：NH4Cl0.4g/L；MgSO4·7H2O0.1g/L；CaC12·2H2O0.05g/L；K2HPO40.108g/L；KH2PO40.056g/L；Trisbase2.423g/L；亨特微量元素(Hunter’straceelements)1ml/L，冰乙酸1ml/L，其余为水。
亨特微量元素(Hunter’straceelements):H3BO411.4g/L、ZnSO4·7H2O22.0g/L、MnCl2·4H2O5.06g/L、CoCl2·6H2O1.61g/L、CuSO4·5H2O1.57g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O1.10g/L、FeSO4·7H2O4.99g/L，其余为水。
2）缺硫TAP培养液（g/L）：NH4Cl0.4g/L；MgC12·6H2O0.08g/L；CaC12·2H2O0.05g/L；K2HPO40.108g/L；KH2PO40.056g/L；Trisbase2.423g/L；亨特微量元素(Hunter’straceelements)1ml/L，冰乙酸1ml/L，其余为水。
缺硫亨特微量元素(Hunter’straceelements):H3BO411.4g/L、ZnC1210.42g/L、MnCl2·4H2O5.06g/L、CoCl2·6H2O1.61g/L、CuC12·2H2O1.07g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O1.10g/L、FeCl2·4H2O3.57g/L，其余为水。
3）固体TAP培养基：在TAP培养液中加1.5%（质量百分含量）的琼脂粉。
4）含有巴龙霉素的培养基配方为：在固体TAP培养基中，加入100ug/ml巴龙霉素水溶液，使巴龙霉素在含有巴龙霉素的培养基中的终浓度为10ug/ml。
实施例1、产氢莱茵衣藻的获得
1、培养
用TAP固体培养基培养莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CC400藻株：配制TAP液体培养液，121℃高压灭菌20分钟，待培养液温度降到室温后，用接种针从固体培养基上挑取莱茵衣藻单克隆到TAP培养液中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养（25℃，60rpm，110μEs-1m-2），悬浮培养细胞，得到CC400藻液。
固体培养时，将单克隆转到TAP固体培养基上划线培养。
2、重组莱茵衣藻的获得
将质粒pChlamiRNA3线性化，并用玻璃珠法转化藻种CC400，具体步骤如下：
称取0.1g玻璃珠（425-600um，Sigma）置于1.5ml离心管中，121℃灭菌20分钟后，放于室温待用。将100ulCC400藻液和10ulpChlamiRNA3质粒（KpnI线性化）加入上述盛有玻璃珠的离心管中，在vortex（Genie2）上，7档震动15秒后，室温25℃放置4分钟。用移液器将藻液转移到新鲜的TAP培养液中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养24小时后（25℃，60rpm，110μEs-1m-2），2500rpm离心，收集沉淀用TAP培养液悬起后，涂在含有巴龙霉素（10ug/ml）的培养基平板上，能够生长的藻株，为重组莱茵衣藻。
3、产氢突变藻株的筛选
1）藻株培养
将上述2得到的重组莱茵衣藻分别接到盛150ml正常TAP培养液的三角瓶中；当OD750值达到1.5时，再将其转到已加入磁转子的500ml培养液中；待OD750值达到1.5左右时，收集培养物。
2）、产氢量的测定
（1）25℃，2500rpm，离心上述1）收集的培养物5分钟；倒掉上清液，收集细胞；
（2）用缺硫TAP培养液漂洗1）收集的细胞两次；将漂洗过的细胞用20ml左右缺硫培养液重悬细胞；
（3）取20μl悬浮细胞，加入980μl缺硫培养液，再加入4ml丙酮，混匀，5000rpm，5分钟；
（4）取离心后的上清液，测定663nm和645nm处的吸光值，根据下面的公式计算总叶绿素含量：
Chl（a+b）=8.02×OD663+20.21×OD645
（5）采用Schott培养瓶做放氢瓶，培养体系为100ml（加入缺硫TAP培养基），计算最终叶绿素浓度达到20μg/ml所需的（1）步骤中的细胞原液体积，加入细胞，用缺硫TAP培养液补足到100ml；
（6）用石蜡封住瓶口，以防止气体外漏；
（7）将培养瓶置于25℃，110μEs-1m-2培养箱中的磁力搅拌器（转速200rpm）上连续光照培养（光照强度：110μEs-1m-2），分别取不同的时间点测定放氢量。
采用SHIMADZUGC-2014气相色谱测定氢气含量，载气为氮气。测定时用1ml注射器吸取放氢瓶气体部分500μl，注入进样孔，甲烷外标法计算气体体积。
Y(甲烷体积，ul)=0.0002x（x，峰面积）+0.708，R2（相关系数）=0.9979）
结果如图1所示，可以看出，对获得的多个突变藻株进行放氢量测定，到缺硫密闭培养120小时时，突变藻株91号产氢量可达到816毫升/升培养物，是野生型的3.5倍(野生型可达到232毫升/升培养物)，其余突变藻株产氢量均与野生型相当。这说明，与野生型相比，突变藻株91号具有更高的产氢能力。
将莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）突变藻株91号，于2013年12月31日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCCNO.8706，分类命名为莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）。
实施例2、莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）突变藻株91号的CGMCCNO.8706应用
为了进一步确定突变藻株91号的持续产氢能力与产氢时间，对其产氢过程进行长时间监测，具体如下：
将莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）突变藻株91号CGMCCNO.8706按照实施例1中的3的方法进行培养和产氢检测。以野生型藻株为对照。
结果如图2所示，可以看出，到缺硫密闭培养200小时时，野生型藻株的产氢量达到最大值（300毫升/升培养物），突变藻株91号的产氢量达到5744毫升/升培养物；且突变藻株91号产氢可一直持续到600小时，总产氢量达到13349毫升/升培养物，是野生型的44.5倍。
总之，突变藻株91号的持续产氢时间（600小时）和产氢量（13349毫升/升培养物）均高于野生型(200小时，300毫升/升培养物)，高于已报道藻株，具有一定的潜在应用价值。

Claims (6)

1.重组莱茵衣藻，为将质粒pChlamiRNA3导入莱茵衣藻中，得到重组莱茵衣藻；所述莱茵衣藻为莱茵衣藻CC400；所述重组莱茵衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突变藻株91号，其保藏号为CGMCCNO.8706。
2.权利要求1所述的重组莱茵衣藻在产氢中的应用。
3.一种获得氢的方法，为发酵权利要求1所述的重组莱茵衣藻，得到氢。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵采用的培养基为缺硫TAP培养液。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵条件为25℃、连续光照、持续搅拌，所述发酵时间为0-600小时，且不为0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述光照的强度为110μEs-1m-2，所述搅拌的转速为200rpm。
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