CN112813154A - 一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法 - Google Patents

一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法。本发明利用优化的内生菌高效提取技术，把根表微生物去除彻底，结合宏基因组‑单菌草图组装技术，去除植物宿主质体和线粒体的干扰，获得纯根内生菌的菌群信息，再进一步对根内生菌群落功能及其功能基因进行鉴定。本发明方法通过内生菌高效提取技术，能够把根表微生物去除彻底，大大降低了根表微生物残留对判断根内生菌群功能的影响；另外，把根内生菌DNA提取后，利用宏基因组‑单菌草图组装技术，可以在不明确植物宿主基因序列的情况下，对植物宿主质体和线粒体进行直接去除。本发明方法可以避开根系中根际、根表等微生物的干扰，直接了解植物根内生菌群落功能及其功能基因。

Description

一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法
技术领域
本发明属于微生物生态学领域，具体涉及一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法。
背景技术
植物内生菌具有重要的环境生态和植物生理作用。有研究表明，根内微生物可以促进宿主植物体的生长，增强宿主植物对病原体、养分缺乏、金属污染等胁迫的抗逆性，在环境污染治理和生态农业领域中的巨大应用潜力。
虽然近些年在植物根部内生菌的生态和生理作用方面展开了一系列的研究，但还有许多问题需要进一步探讨。例如，由于绝大多数微生物无法通过纯培养技术获得，大量的内生菌仍然未被发现，植物根部内生菌的作用机理仍然不清，内生菌对植物根部的相互作用有待深入认识等。
目前，学界也不断发展基于不同分子生物学技术的非培养研究，而各种非培养研究的基础就是提取高质量的基因组DNA，以及排除植物宿主本身的质体和线粒体的干扰。因此，需要一种能去除植物根表微生物及植物宿主干扰的研究方法，来帮助深入了解植物根部内生菌对污染物(例如砷)的抗性及代谢作用机制。
发明内容
现有技术由于很难排除植物宿主本身的质体和线粒体干扰，因此少有对植物根内生菌群落功能及其功能基因的鉴定研究。为了克服这个技术缺陷，本发明利用优化的内生菌高效提取技术，把根表微生物去除彻底，结合宏基因组-单菌草图组装技术，去除植物宿主质体和线粒体的干扰，获得纯根内生菌的菌群信息，再进一步对根内生菌群落功能及其功能基因进行鉴定。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法，包括以下步骤：
(1)去除植物根表杂菌
抖落植物根表附着土，将植物根依次置于MgSO4溶液、含有Tween 20的MgSO4溶液、MgSO4溶液、含有Tween 20的次氯酸钠溶液、MgSO4溶液中旋涡震荡或超声处理，去除植物根表杂菌；
MgSO4极容易吸收水分，利用MgSO4能使细菌脱水，从而达到杀菌的目的。此外，MgSO4还是一种强氧化剂，可以进一步破坏细菌的细胞结构。旋涡震荡或超声处理目的是使缓冲液和植物根部充分接触，除菌更彻底。
步骤(1)和(2)所述的MgSO4溶液优选浓度为10mM；
步骤(1)所述含有Tween 20的MgSO4溶液，Tween 20的浓度为0.01％(v/v)；
步骤(1)所述含有Tween 20的次氯酸钠溶液，次氯酸钠浓度为1％(v/v)，Tween 20的浓度为0.01％(v/v)；
(2)分离内生菌并提取总DNA
将去除根表杂菌的植物根在MgSO4溶液中破壁匀浆，滤布过滤取滤汁；滤汁在500×g下离心10min，将上清液再于9500rpm下离心15min，利用离心形成重量差，重量较大的细菌细胞会沉到底部，保留菌体细胞沉淀物；
将菌体细胞沉淀物重悬于无菌NaCl溶液中，再缓慢加入到碘海醇溶液上方，然后于15000×g下离心60min，通过离心作用，菌体细胞沉淀物会在碘海醇梯度密度中分层，内生菌细胞显示为乳白色条带，回收乳白色条带部分；随后去除回收部分的碘海醇，加入等体积的无菌NaCl溶液，在7500×g下离心20min，去除上清液后加入无菌NaCl溶液重新悬浮；最后于7500×g下离心20min，取沉淀，加入无菌NaCl溶液重悬，即为回收的内生菌，提取内生菌总DNA；
步骤(2)所述滤布的孔径优选25μm；
步骤(2)所述无菌NaCl溶液的浓度优选0.8％(W/V)；
步骤(2)所述碘海醇溶液的浓度优选1.3g/ml；
(3)内生菌宏基因组DNA测序及分析
3.1、在Illumina Hiseq 4000平台建立根内生菌的DNA宏基因组文库，获得原始测序Reads；利用Trimmomatic-0.36进行测序数据质控，过滤低质量数据；使用Megahit进行序列拼接，得到Contigs；使用Bowtie 2进行序列比对，把Contigs的独立数据集的Reads进行映射用来评估其丰度；利用KEGG数据库对Contigs进行序列物种注释；利用Blobtools进行可视化，根据序列种属、GC比以及覆盖度，结合Bowtie评估的丰度，对原始序列进行过滤，去除植物宿主序列；对Contigs使用默认设置的CONCOCT(版本0.4.0)、Metabat2、Maxbin2进行组装，并利用Metawrap去除冗杂信息，得到高质量的宏基因组拼接基因组(MAGs)；
所述的利用Trimmomatic-0.36进行测序数据质控，参数设置为LEADING:3，TRAILING:3，SLIDINGWINDOW:4:15，MINLEN:36；
3.2、取完整度>50％和冗余度<10％的MAGs进行下游分析，分析这些MAGs所属的门类，基于Ghostkoala(https://www.kegg.jp/ghostkoala/)比对KEGG数据库中污染物(如多环芳烃、石油烃、抗生素等)代谢相关功能基因，若MAG序列中具有与数据库高度相似的基因序列，则认为MAG中具有该功能基因，检测(同样基于Ghostkoala比对KEGG数据库)这些MAG中是否含有相同的碳氮硫等典型关键元素代谢的相关功能基因序列；
利用blastp比对抗生素及金属抗性功能数据库，对比分析MAGs所含的植物促生基因与污染物代谢相关功能基因序列；
所述的抗生素及金属抗性功能数据库优选CARD(https://card.mcmaster.ca/)和/或BacMet(http://bacmet.biomedicine.gu.se/)；
利用Salmon工具将所得到的MAG在宏基因组中对各个基因拷贝数进行定量，通过MAGs中各功能基因拷贝数判断植物根部内生菌参与关键物质循环的强度，所含碳氮硫等典型关键元素代谢的基因拷贝数越大，证明所参与的关键营养元素循环作用越重要，污染物抗性及代谢基因拷贝数越大，则对污染物抗性表现越强、利用污染物参与自身代谢的作用越强。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法，通过内生菌高效提取技术，能够把根表微生物去除彻底，大大降低了根表微生物残留对判断根内生菌群功能的影响；另外，把根内生菌DNA提取后，利用宏基因组-单菌草图组装技术，可以在不明确植物宿主基因序列的情况下，对植物宿主质体和线粒体进行直接去除。本发明方法可以避开根系中根际、根表等微生物的干扰，直接了解植物根内生菌群落功能及其功能基因，对于了解植物根内微生物在植物体内对土壤污染的响应、抗性、及对污染物代谢功能过程的认知有着重大的意义。
附图说明
图1是植物根部预处理各步骤缓冲液涂布结果。
图2是回收植物根内生菌涂布结果。
图3是植物根内生菌宏基因组分类注释。
图4是植物根内生菌宏基因组拼接基因组。
图5是植物根内生菌宏基因组中关键元素代谢的相关功能基因分析结果。
图6是植物根内生菌宏基因组中植物促生基因与砷代谢相关功能基因分析结果。
图7是溶液中砷的氧化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法，包括以下步骤：
一、样本采集
蜈蚣草植物样本采集于广西河池一个矿区附近，采集包括蜈蚣草根系在内的整棵植株，采集地长期受到砷污染，蜈蚣草样本可能富集了砷代谢微生物。将植物样本低温保存运送至实验室。
二、植物根部内生菌DNA的提取
(1)植物根部预处理：
1.1、抖落蜈蚣草根部表面附着的土，将蜈蚣草根部在10ml 10mM MgSO4缓冲液中旋涡振荡5min，更换缓冲液，再振荡5min，如此重复总计5次振荡，保留最后一道缓冲液涂布，可以观察到还有较多微生物生长(图1培养皿1)；
1.2、将蜈蚣草根部在加入0.01％(v/v)Tween 20的10mM MgSO4缓冲液中旋涡振荡5min，超声15min，保留缓冲液涂布，可以观察到还有不少微生物生长(图1培养皿2)；
1.3、将蜈蚣草根部在10mM MgSO4缓冲液中旋涡震荡5min，再重复1次；在1％(v/v)NaClO溶液中加入0.01％(v/v)Tween 20，将根浸入其中，旋涡震荡20min，超声15分钟，保留缓冲液涂布，观察到只有极少数微生物生长(图1培养皿3)；
1.4、在10mM MgSO4缓冲液中旋涡震荡5min，再重复4次，保留最后一道缓冲液涂布，已无微生物生长，证明根部表面无菌(图1培养皿4)。
涂布观察方法如下：用保留的缓冲液100μL在固体LB平板培养基上涂抹，在25℃培养7天，观察平板内微生物生产情况。
(2)内生菌分离：
用步骤(1)的表面无菌的根部在10mM MgSO4缓冲液中用破壁机打碎为匀浆，后通过25um的滤布过滤，去除较大点植物组织碎片；再经过500×g下离心10min，将上清液再在9500rpm下离心15min，弃掉上清液，保留剩下的菌体细胞沉淀物；将菌体细胞沉淀物重悬于25ml 0.8％的无菌NaCl溶液中；缓慢加入至10ml密度为1.3g/ml的碘海醇溶液上方；在15000×g下离心60min，回收乳白色带部分，加入等体积的无菌NaCl溶液；在7500×g下离心20min，去除上清液后加入20ml的无菌NaCl溶液重新悬浮；在7500×g下离心20min，去除上清液后，加入约5ml的无菌NaCl溶液重悬，即为回收的内生菌，其涂布培养结果如图2所示。
(3)用DNA提取试剂盒，按照产品说明方法提取内生菌总DNA。
三、内生菌宏基因组DNA测序及分析
(1)宏基因组分析，并进行分箱组装
在Illumina Hiseq 4000平台建立根内生菌的DNA的宏基因组文库，获得原始测序Reads；
利用Trimmomatic-0.36进行测序数据质控，过滤参数设置为LEADING:3，TRAILING:3，SLIDINGWINDOW:4:15，MINLEN:36，过滤低质量数据；
使用Megahit进行序列拼接，得到Contigs；
使用Bowtie 2进行序列比对，把Contigs的独立数据集的Reads进行映射用来评估其丰度；
利用KEGG数据库对Contigs进行序列物种注释；
利用Blobtools进行可视化，根据序列种属、GC比以及覆盖度，结合Bowtie评估的丰度，对原始序列进行过滤，图3中Eukaryote对应的所有序列均为真核宿主序列，去除植物宿主序列；
对Contigs使用默认设置的CONCOCT(版本0.4.0)、Metabat2、Maxbin2进行组装，并利用Metawrap对所得的MAG进行提纯，取完整度>50％和冗余度<10％的MAGs进行下游分析。
(2)宏基因组-分箱组装揭示根内生菌代谢相关的功能基因
基于宏基因组分析蜈蚣草根内菌的代谢潜能及其对植物宿主的代谢能力的影响，将原始序列经过去宿主后进行分箱，得到20个高质量的宏基因组拼接基因组(MAGs)(图4)，这些MAGs分属于Proteobacteria,Patescibacteria,Actinobacteria,Gemmatimonadetes,Chloroflexi,Planctomyce和Acidobacteria共7个门类，与Ghostkoala数据库中已知的功能基因序列对比，若MAG序列中具有与数据库高度相似的基因序列，则认为MAG中具有该功能基因，在这些MAG中检测到了柠檬酸循环、丙酮酸氧化途径、3-羟基丙酸循环、还原性三羧酸循环、反硝化作用、同化硫酸盐还原等中心代谢及碳氮硫等关键元素代谢的相关功能基因(图5)。
同时，通过与已报道的植物促生基因序列和Fungene数据库序列比对，若MAG序列中具有与数据库高度相似的基因序列，则认为MAG中具有该功能基因。
在得出的MAG中也发现了铁核蛋白、固氮、解磷、植物荷尔蒙合成等多种植物促生基因与砷氧化、还原、解毒、甲基化等砷代谢相关功能基因。如图6中显示，横轴为不同的MAG，纵轴为不同的功能基因，图6中数字表明该MAG中编码有几个该功能基因。
将回收得到的蜈蚣草根内菌活性微生物群落(即步骤二之(2)所得到的)进行培养，验证其进行砷代谢的相关功能。具体步骤为：
将菌落接种到50mL西林瓶中，加入25mL液体培养基，培养基组成为：1.5g/LKH2PO4，10.55g/L Na2HPO4·12H2O，0.3g/L NH4Cl，0.1g/L MgCl2，0.672g/L NaHCO3，0.13g/LNaAsO2。接种后采用橡胶塞封口，置于30℃摇床中，以150rpm震荡培养。于0天，1天，2天，3天，4天分别取一次样品，并过滤保存于4℃备用；将样品稀释500倍后，用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光(HPLC-HG-AFS)测As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度。As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度绘制砷氧化曲线图，如图7所示。图7中：X轴为时间(天)，取样时间为0天，1天，2天，3天，4天；Y轴为砷浓度(mg/L)。
从图7可以看出根内生菌群能在4天内把34.41mg/L的As(III)全部氧化成As(V)，此结果揭示了蜈蚣草根内菌具有显著的砷代谢相关潜能，与宏基因组分箱结论想吻合，从而验证了蜈蚣草根内菌参与宿主体内金属代谢过程。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鉴定植物根内生菌群落功能及其功能基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)去除植物根表杂菌
抖落植物根表附着土，将植物根依次置于MgSO4溶液、含有Tween 20的MgSO4溶液、MgSO4溶液、含有Tween 20的次氯酸钠溶液、MgSO4溶液中旋涡震荡或超声处理，去除植物根表杂菌；
(2)分离内生菌并提取总DNA
将去除根表杂菌的植物根在MgSO4溶液中破壁匀浆，滤布过滤取滤汁；滤汁在500×g下离心10min，将上清液再于9500rpm下离心15min，保留菌体细胞沉淀物；
将菌体细胞沉淀物重悬于无菌NaCl溶液中，再缓慢加入到碘海醇溶液上方，然后于15000×g下离心60min，回收乳白色条带部分；随后去除回收部分的碘海醇，加入等体积的无菌NaCl溶液，在7500×g下离心20min，去除上清液后加入无菌NaCl溶液重新悬浮；最后于7500×g下离心20min，取沉淀，加入无菌NaCl溶液重悬，即为回收的内生菌，提取内生菌总DNA；
(3)内生菌宏基因组DNA测序及分析
3.1、建立根内生菌的DNA宏基因组文库，获得原始测序Reads；利用Trimmomatic-0.36进行测序数据质控，过滤低质量数据；进行序列拼接，得到Contigs；进行序列比对，把Contigs的独立数据集的Reads进行映射用来评估其丰度；利用KEGG数据库对Contigs进行序列物种注释；利用Blobtools进行可视化，根据序列种属、GC比以及覆盖度，结合Bowtie评估的丰度，对原始序列进行过滤，去除植物宿主序列；对Contigs使用默认设置的CONCOCT、Metabat2、Maxbin2进行组装，并利用Metawrap对所得的MAG进行提纯，得到高质量的宏基因组拼接基因组(MAGs)；
3.2、取完整度>50％和冗余度<10％的MAGs进行下游分析，分析这些MAGs所属的门类，基于Ghostkoala比对KEGG数据库中污染物代谢相关功能基因，若MAG序列中具有与数据库高度相似的基因序列，则认为MAG中具有该功能基因，检测这些MAG中是否含有相同的碳氮硫代谢的相关功能基因序列；
利用blastp比对抗生素及金属抗性功能数据库，对比分析MAGs所含的植物促生基因与污染物代谢相关功能基因序列；
利用Salmon工具将所得到的MAG在宏基因组中对各个基因拷贝数进行定量，通过MAGs中各功能基因拷贝数判断植物根部内生菌参与关键物质循环的强度，所含碳氮硫等典型关键元素代谢的基因拷贝数越大，证明所参与的关键营养元素循环作用越重要，污染物抗性及代谢基因拷贝数越大，则对污染物抗性表现越强、利用污染物参与自身代谢的作用越强。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)和(2)所述的MgSO4溶液，浓度为10mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述含有Tween 20的MgSO4溶液，Tween 20的浓度为0.01％(v/v)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述含有Tween 20的次氯酸钠溶液，次氯酸钠浓度为1％(v/v)，Tween 20的浓度为0.01％(v/v)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述滤布的孔径为25μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述无菌NaCl溶液的浓度为0.8％(W/V)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述碘海醇溶液的浓度为1.3g/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3.1所述的利用Trimmomatic-0.36进行测序数据质控，参数设置为LEADING:3，TRAILING:3，SLIDINGWINDOW:4:15，MINLEN:36。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3.2所述的抗生素及金属抗性功能数据库为CARD和/或BacMet。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤3.1中，所述建立根内生菌的DNA宏基因组文库，是在Illumina Hiseq4000平台建立根内生菌的DNA宏基因组文库；
所述序列拼接，是使用Megahit进行序列拼接；
所述序列比对，是使用Bowtie 2进行序列比对。
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