CN101113177B - 从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法。该方法是将筛选出抗乙肝免疫球蛋白效价不小于2IU/ml的血浆并进行混合;对多糖类高分子亲水性物质基质上的羟基引入高反应活性的小分子化学基团,得到层析基质悬浮液;将含有抗原决定簇的乙肝表面抗原溶液,加入到层析基质悬浮液中进行偶联,得到亲和层析介质;将混合血浆经低温乙醇法得到的含有丙种免疫球蛋白的组分,或直接以血浆作为生产纯化抗乙肝免疫球蛋白的原料;利用亲和层析介质,收集抗乙肝免疫球蛋白组分;将纯化后的抗乙肝免疫球蛋白浓缩后进行两步病毒灭活,加入稳定剂后灌装,得到纯化抗乙肝免疫球蛋白药用制剂。该方法的抗乙肝免疫球蛋白回收率接近100%。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体地说,是一种从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法。
背景技术
慢性乙型肝炎已成为严重威胁人类健康的世界性疾病,也是我国目前流行最为广泛,危害最为严重的一种传染病。目前全世界有3.5亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者,我国HBV携带者达1.21亿,占全国人口的9.75%。慢性乙肝患者约3000万,每年死亡人数达30万。而且,我国每年乙肝新发病人约50万人,约占全国传染病发病人数的1/4。目前全国每年用于肝病的防治费用高达1000多亿元,给社会造成极大的负担。在乙肝的预防和治疗方面国家投入了大量的研究力量,抗乙肝免疫球蛋白在临床应已用于肝移植手术和阻断乙肝病毒母婴两个方面,并取得了很好的效果。肝移植后HBV的感染率可达到80%,再感染的患者病情进展迅速而且难以治疗,预后极差。抗乙肝免疫球蛋白可以使乙肝复发的几率降到30%左右,和其他药物,如拉米夫定联合使用,复发几率可降低到20%。乙肝病毒表面抗原阳性和e抗原阳性的怀孕妇女,所生婴儿乙肝病毒的感染率可高达88.1%,单项乙肝表面抗原阳性所生婴儿乙肝病毒的感染率为38%。而且婴儿一旦感染乙肝病毒,他们中85%-90%会发展成慢性带乙肝病毒状态,其中25%于成年后将死于肝硬化和肝癌。临床上应用抗乙肝免疫球蛋白,对新生儿的保护率可达86.65%。如果在出生后立即及生后一个月在注射乙肝疫苗的同时注射1支抗乙肝免疫球蛋白,则保护率可高达97.13%。因此,在肝移植手术和阻断乙肝病毒母婴传播两个方面,抗乙肝免疫球蛋白是非常重要的治疗药物。
抗乙肝免疫球蛋白的制备是用经乙型肝炎表面抗原疫苗免疫的健康人血浆,经提取、灭活病毒等步骤完成。药物剂型一般为肌肉注射和静脉注射两种。目前我国市场上销售的只有肌注型制剂,每瓶抗乙肝抗体效价约为200国际单位(IU),浓度为50IU/ml,蛋白浓度约为18%。全国有四家血液制品厂正在开发静注型制剂,每瓶2000IU,浓度为50IU/ml,蛋白浓度约为10%,预计2007年初可以投放市场。
由于目前抗乙肝免疫球蛋白的制备是延用成熟的正常免疫球蛋白的纯化工艺,只是增加了蛋白的浓缩倍数,没有针对抗乙肝免疫球蛋白进行纯化,因此,制剂只有小于1%的免疫球蛋白分子是抗乙肝表面抗原的,其余大部分免疫球蛋白都没有抗乙肝效果。对于肝移植手术的病人,由于病人肝脏功能已经很低,大量输入这些没有抗乙肝效果的免疫球蛋白有可能增加病人的负担,对病人造成不良影响。在防止乙肝病毒母婴传播方面,大量输入外源性免疫球蛋白对婴儿的正常生长发育不利。因此,开发纯化的抗乙肝的免疫球蛋白制剂非常有必要。
另外,由于血浆是一种特殊的稀缺资源,来源随着人们生活水平的提高日益紧张。而且随着血制品临床用量的进一步扩大,要采集经过乙肝疫苗免疫后的特免血浆更加的困难。传统的抗乙肝免疫球蛋白制造工艺要求原料混合血浆乙型肝炎表面抗体效价每毫升不得低于8IU。这使得大量效价低于8IU/ml但明显高于普通血浆的血浆原料不能用做抗乙肝免疫球蛋白的制备,从而造成血浆原料的浪费,血浆资源的利用率大大降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是,该方法包含以下步骤:
A.从经乙肝疫苗免疫过的献血员采得的血浆中,筛选出抗乙肝免疫球蛋白效价不小于2IU/ml的血浆;
B.以含有多糖类高分子亲水性物质为基质,对基质上羟基进行化学修饰引入高反应活性的小分子化学基团,得到层析基质悬浮液;
C.将含有抗原决定族的乙肝表面抗原溶液,加入到层析基质悬浮液中进行偶联,得到可用于纯化抗乙肝免疫球蛋白的亲和层析介质;
D.将步骤A中的血浆混合后经冷乙醇沉淀得到含有丙种免疫球蛋白的组分(通常为组分II),或直接以步骤A中的血浆作为生产纯化抗乙肝免疫球蛋白的原料;
E.以步骤C中的亲和层析介质,收集步骤D中的原料中的抗乙肝免疫球蛋白组分;
F.将纯化后的抗乙肝免疫球蛋白浓缩后进行两步病毒灭活,第一步为低pH条件下的孵化,第二步为纳米膜过滤,得到纯化抗乙肝免疫球蛋白经添加保护剂和灌装,制成药物制剂。
所述的基质是采用葡聚糖、琼脂糖、或其它多孔性的多糖类高分子亲水性物质;或采用多孔刚性支撑、表面覆盖为多糖类高分子亲水性物的介质。
所述的高反应活性的小分子化学基团是溴化氰、环氧基团或巯基。
在步骤C中,含有抗原决定簇的乙肝表面抗原(HbsAg)材料来源于基因工程重组方法,即从乙肝疫苗生产厂家或乙肝表面抗原试剂(所述的乙肝表面抗原是adr亚型,adw亚型,ayr亚型或ayw亚型中的一种或其组合)生产厂家获得利用哺乳动物细胞或酵母菌表达乙肝表面大S抗原及S1,S2抗原的蛋白溶液进行透析、超滤、浓缩、缓冲液置换,调节pH至8.0-10.0、蛋白浓度每毫升1-10毫克后,加入到步骤B中的层析基质悬浮液中进行偶联;在4℃-40℃温度条件下,偶联反应1-24小时后,乙肝表面抗原通过活化基团与层析基质完成共价偶联;洗涤去除游离、未参与偶联的乙肝表面抗原,封闭多余未参与偶联反应的活化基团,再对层析介质进行稳定化处理,得到可用于纯化抗乙肝免疫球蛋白的亲和层析介质。
纯化抗乙肝免疫球蛋白的工艺是采用亲和层析的方法,理论上对于原料血浆中的抗体最低效价没有要求。但是,从实用的方面考虑,此项发明将乙肝抗体阳性且效价不低于2IU/ml的合格血浆作为原料,用一种亲和层析的方法从这些血浆或其组分中来分离纯化抗乙肝免疫球蛋白,将大大提高血浆的综合利用率,并提供更安全高效的抗乙肝免疫球蛋白药物。
从经乙肝疫苗免疫过的献血员采得的血浆中,筛选出抗乙肝免疫球蛋白效价不小于2IU/ml的血浆。将筛选出的血浆混合后经低温乙醇法沉淀得到组分II,将组分II用pH7.0-pH8.0的缓冲溶液复溶,调节样品溶液pH7.0-pH8.0后,上样连接了基因工程乙肝表面抗原的亲和层析柱。若血浆不经低温乙醇法沉淀,也可将血浆pH调至7.0-8.0后直接上样亲和层析柱。上样流速为每分钟0.5-100毫升,然后用pH2.0-pH5.0缓冲盐溶液洗脱,收集抗乙肝免疫球蛋白组分。
将纯化后的抗乙肝免疫球蛋白浓缩到至蛋白浓度每毫升1-200毫克后进行两个病毒灭活步骤。第一步为低pH条件下的孵化,即用浓度为1M的盐酸将蛋白溶液得pH调至4.0,并在室温孵化21天。然后用1M浓度的NaOH将pH回调至7.0-8.0。第二步病毒灭活为纳米膜过滤,即使用Pall公司生产的DV50过滤膜进行过滤。两步病毒灭活后的成品添加1%山梨醇和1%甘氨酸作为保护剂后,即可分装为肌注和静注两种剂型的纯化抗乙肝免疫球蛋白。
本发明所用的制备亲和介质由基因工程方法制备的乙肝表面抗原以共价键方式连接在层析材料基质上而成,具有安全性好、亲和力高的特点。而且,由于基因工程乙肝表面抗原具有多抗原决定簇,可以免疫吸附多克隆的抗乙肝丙种免疫球蛋白。最终获得的抗乙肝免疫球蛋白在功能上与从传统血浆级分工艺制备的抗乙肝免疫球蛋白基本保持一致,具有很高的纯度和抗体效价。
本发明通过用亲和层析的方法从血浆或其组分中来分离纯化抗乙肝免疫球蛋白,将大大提高血浆的综合利用率,并提供更安全高效的抗乙肝免疫球蛋白药物。
具体实施方式
实施例1亲和层析介质的制备
层析介质的基质可采用葡聚糖、琼脂糖、或其它多孔性的多糖类高分子亲水性物质;或采用多孔刚性支撑、表面覆盖为多糖类高分子亲水性物的介质。通过控制化学反应条件,对基质上羟基进行化学修饰引入高反应活性的小分子化学基团溴化氰、环氧基团或巯基等。洗涤去除未反应完全的小分子化学基团,稳定反应活性基团后,完成对层析介质基质的化学活化。
含有抗原决定簇的乙肝表面抗原(HbsAg)材料来源于基因工程重组方法,即从乙肝疫苗生产厂家或乙肝表面抗原试剂生产厂家获得利用哺乳动物细胞或酵母菌表达乙肝表面大S抗原及S1,S2抗原的蛋白溶液进行透析、超滤、浓缩、缓冲液置换,调节pH8.0-10.0、蛋白浓度每毫升1-10毫克后,加入到活化好的层析基质悬浮液中进行偶联。在4℃-40℃温度条件下,偶联反应1-24小时后,乙肝表面抗原通过活化基团与层析基质完成共价偶联。洗涤去除游离、未参与偶联的乙肝表面抗原,封闭多余未参与偶联反应的活化基团,再对层析介质进行稳定化处理,得到可用于纯化抗乙肝免疫球蛋白的亲和层析介质。
实施例2组分II亲和层析分离抗乙肝免疫球蛋白
蛋白含量为18.2%的组分II样品100ml,加入100ml pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液稀释均匀,作为亲和层析纯化前样品。基因工程乙肝表面抗原亲和层析柱50ml经pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液平衡5个柱体积,上样组分II稀释液200ml,收集穿透峰300ml。上样完毕后,用磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液淋洗至基线。采用pH2.5的甘氨酸/盐酸缓冲溶液洗脱抗乙肝免疫球蛋白,收集洗脱抗乙肝免疫球蛋白组分峰80ml。
从乙肝抗体活性试验结果(表一)可以看出,组分II经亲和层析纯化后抗乙肝免疫球蛋白回收率接近100%,抗乙肝免疫球蛋白比活性被提高274倍(表二)。因此,新的纯化工艺达到并超过技术设计要求。
表一、酶标法对倍稀释活性检测结果
表二、活性单位比较
纯化前样 | 纯化穿透峰 | 纯化后样 | |
体积(ml) | 100 | 300 | 80 |
蛋白浓度(mg/ml) | 182 | 57 | 0.85 |
总蛋白(mg) | 18200 | 17100 | 68 |
比活性(IU/mg) | 70.3 | 2.1 | 19265 |
总活性(万国际单位) | 128 | 3.6 | 131 |
活性收率(%) | 2.8 | 102.4 | |
纯化倍数 | 274 |
实施例3血浆亲和层析分离抗乙肝免疫球蛋白
抗乙肝活性为8IU/ml的血浆样品2000ml,加入2000ml pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液稀释均匀,作为亲和层析纯化前样品。基因工程乙肝表面抗原亲和层析柱50ml经pH7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液平衡5个柱体积,上样血浆样品稀释液4000ml,收集穿透峰4150ml。上样完毕后,用磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液淋洗至基线。采用pH2.5的甘氨酸/盐酸缓冲溶液洗脱抗乙肝免疫球蛋白,收集洗脱抗乙肝免疫球蛋白组分峰94ml。
从乙肝抗体活性检测结果(表三)可以看出,活性为8IU/ml的血浆样品经亲和层析纯化后抗乙肝免疫球蛋白回收率接近95%(表四)。因此,新的纯化工艺达到并超过技术设计要求。
表三、酶标法对倍稀释活性检测结果
表四、活性单位比较
纯化前样 | 纯化穿透峰 | 纯化后样 | |
体积(ml) | 2000 | 4150 | 94 |
蛋白浓度(mg/ml) | 0.83 | ||
总蛋白(mg) | 78 | ||
活性(IU/ml) | 768 | 4 | 15360 |
比活性(IU/mg) | 18564 | ||
总活性(x10,000IU) | 153.6 | 1.66 | 144.8 |
活性收率(%) | 3.2 | 94.3 |
以上对本发明所提供的从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想;同时,对于本领域的一般技术人员,依据本发明的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (6)
1.一种从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法,其特征在于,包含以下步骤:
A.从经乙肝疫苗免疫过的献血员采得的血浆中,筛选出抗乙肝免疫球蛋白效价不小于2IU/ml的血浆;
B.以含有多糖类高分子亲水性物质为基质,对基质上羟基进行化学修饰引入高反应活性的小分子化学基团,得到层析基质悬浮液;
C.将含有抗原决定族的乙肝表面抗原溶液,加入到层析基质悬浮液中进行偶联,得到可用于纯化抗乙肝免疫球蛋白的亲和层析介质;
D.将步骤A中的血浆混合后经冷乙醇沉淀得到含有丙种免疫球蛋白的组分,或直接以步骤A中的血浆作为生产纯化抗乙肝免疫球蛋白的原料;
E.以步骤C中的亲和层析介质,收集步骤D中的原料中的抗乙肝免疫球蛋白组分;
F.将纯化后的抗乙肝免疫球蛋白浓缩后进行两步病毒灭活,第一步为低pH条件下的孵化,第二步为纳米膜过滤,得到纯化抗乙肝免疫球蛋白经添加保护剂和灌装,制成药物制剂。
2.根据权利要求1所述的从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法,其特征在于:所述的基质是采用葡聚糖、琼脂糖、或其它多孔性的多糖类高分子亲水性物质;或采用多孔刚性支撑、表面覆盖为多糖类高分子亲水性物的介质。
3.根据权利要求1所述的从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法,其特征在于:所述的高反应活性的小分子化学基团是溴化氰、环氧基团或巯基。
4.根据权利要求1所述的从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法,其特征在于:在步骤C中,含有抗原决定簇的乙肝表面抗原HbsAg材料来源于基因工程重组方法,是从乙肝疫苗生产厂家或乙肝表面抗原试剂生产厂家获得利用哺乳动物细胞或酵母菌表达乙肝表面大S抗原及S1,S2抗原的蛋白溶液;所述的乙肝表面抗原是adr亚型,adw亚型,ayr亚型或ayw亚型中的一种或其组合。
5.根据权利要求1所述的从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法,其特征在于:在步骤C中,含有抗原决定族的乙肝表面抗原HbsAg溶液进行透析、超滤、浓缩、缓冲液置换,调节pH至8.0-10.0、蛋白浓度每毫升1-10毫克后,加入到步骤B中得到的层析基质悬浮液中进行偶联;在4℃-40℃温度条件下,偶联反应1-24小时后,乙肝表面抗原通过活化基团与层析基质完成共价偶联;洗涤去除游离、未参与偶联的乙肝表面抗原,封闭多余未参与偶联反应的活化基团,再对层析介质进行稳定化处理,得到可用于纯化抗乙肝免疫球蛋白的亲和层析介质。
6.根据权利要求1所述的从血浆或血浆组分中分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的方法,其特征在于:在步骤D中,用来分离纯化抗乙肝免疫球蛋白的原料为从乙肝疫苗免疫过的人群中采得的效价不小于2IU/ml的血浆,或者是该血浆经低温乙醇法制备的含有丙种免疫球蛋白的组分。
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