CN1421531A - 抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了分泌抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体的人-鼠杂交瘤和人-人杂交瘤的制备方法。采用体外模拟人体抗原递呈加工过程,以及采用SCID小鼠建立人体免疫系统的方法,获得乙肝表面抗原特异性的人B细胞,将B细胞与人骨髓瘤细胞或鼠骨髓瘤细胞融合,利用ELISA方法判断阳性克隆,不断筛选和克隆抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体的杂交瘤细胞系。经多孔微载体培养杂交瘤细胞,可获得抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体,这类单抗可用于乙型肝炎的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的制备方法,更确切地说是利用细胞程和抗体工程技术,获得分泌抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体的人-鼠杂交瘤和人-人杂交瘤细胞系,并通过杂交瘤细胞的多孔微载体培养,及采用亲和层析方法纯化细胞培养上清,制备可用于乙型肝炎的预防和治疗的抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染引起的一种严重威胁人体健康的疾病,传染性强,危害性大,并且难于治愈。全世界慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者中中国人占一半以上,近年的大样本人群调查,我国人口的HBsAg检出率约10%,包括抗HBs和抗HBc的HBV流行率50~60%。由一些数据估计,我国的慢性无症状HBV携带者(AsC)可能超过1.2亿,现患乙型肝炎病人为2800万人,现患率约为2770/10万,年发病率为230/10万,慢性乙肝的流行率为0.1~1%,累计现行的和既往的,我国已约有一半以上人口经受HBV感染。我国在新生儿中广泛推行的乙肝疫苗接种,控制HBV的曙光已展现,但流行的现状仍很严峻,因此研究新的预防和治疗乙型肝炎的药物和方法,在我国意义尤为重要。
抗体被动免疫能够有效地预防和治疗病毒感染,从anti-HBsAg阳性的人血浆中提取的乙肝免疫球蛋白(Hepatitis B Immune Globulin,HBIG)Nabi-HBTM已经在1999年获得FDA批准用于预防和治疗乙肝。我国也有类似的产品上市,如深圳市卫武光明生物制品有限公司生产的人乙型肝炎免疫球蛋白(批准文号:国药准字SF20010049,国药准字SF20010050)。人Anti-HBsAg抗体能够中和血液循环中的乙肝病毒,大大减小血液中的病毒颗粒数和HBV DNA,以减轻症状。也可与其他抗病毒药物如干扰素、拉夫米定等联合使用,以增强疗效。这些治疗方法正处于临床实验中。但是,由于乙肝免疫球蛋白从人血浆中提取,虽经过严格的灭毒提纯工艺,但仍存在传播传染性疾病的危险,并且来源有限价格昂贵,因而大大限制了其在临床中的应用。利用基因工程、抗体工程和细胞工程等生物技术,开发基因工程或抗体工程的人Anti-HBsAg抗体以取代目前的乙肝免疫球蛋白,将会大大促进乙型肝炎的防治。
鼠源单抗由于存在半衰期短、Fc段与人体细胞的FcR结合能力差以及反复使用可使人体产生人抗鼠抗体(HAMA)引起过敏反应等原因,限制了鼠源单抗在疾病治疗中的应用。治疗用抗体药物开发的最主要的障碍是如何获得人源抗体。目前批准用于临床治疗的单抗药物都是基于鼠源单抗,通过基因工程手段改造而获得的。鼠源抗体的人源化极大地促进了抗体药物开发的进展,但也有一些不足,如(1)技术路线较复杂,开发的难度大、周期长;(2)在人源化过程中,抗体与抗原的亲和能力可能会大大下降,从而影响其治疗效果;(3)由于人源化抗体中还包含部分鼠源序列,在使用过程中仍有部分病人会产生人抗嵌合抗体抗体(HACA)。
从理论上说利用杂交瘤技术制备人—人杂交瘤细胞是生产人源单克隆抗体最理想的方法,但是难度很大,主要问题有:(1)缺乏理想的亲本人骨髓瘤细胞株。许多人骨髓瘤细胞自身分泌抗体,且融合后不稳定。(2)难于获得大量的抗原特异性人B淋巴细胞。(3)人单克隆抗体的大量生产问题。由于免疫排斥,人杂交瘤细胞不能在小鼠或其他动物体内生长,在裸鼠体内生长的效果也很不理想。比较理想的方法是利用生物反应器大规模高密度培养人杂交瘤细胞。因此,尽管抗体药物在许多领域表现出较好的治疗效果,但至今还没有一种利用杂交瘤技术生产的人源(而非人源化)单克隆抗体药物问世。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的分离:先用0.1%的甲基纤维素生理盐水溶液初步沉降乙肝表面抗体阳性的健康人外周血中的红细胞,再利用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque,d=1.077)分离其中的单个核细胞。获得的细胞中包含分泌乙肝抗体的B细胞及可以在SCID鼠体内形成类似于人体免疫系统的一些造血干细胞。
(2)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的的体外培养:通过体外混合培养外周血单个核细胞以活化、致敏和增殖其中的HBsAg特异的B细胞。
(3)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞培养增殖后B细胞和T细胞的分离:采用植物凝聚素等方法,去除混合培养外周血单个核细胞中的T细胞,以获得分泌anti-HBsAg滴度较高并且相对较纯的人B细胞供细胞融合使用。
(4)用SCID鼠体内培养乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞;也可通过将人外周血单个核细胞移植到SCID小鼠体内,来活化、致敏和增殖其中的HBsAg特异的B细胞,经过一段时间收集SCID小鼠的脾细胞做细胞融合。
(5)收集含表达乙肝表面抗体的人B细胞,与人骨髓瘤细胞SP2或小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0融合:将体外混合培养或SCID小鼠体内培养获得的可分泌抗HBsAg抗体的的人B细胞与人骨髓瘤细胞SP2或小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0融合。
(6)选择性培养基培养筛选杂交细胞,检测筛选阳性细胞,克隆化培养,进一步克隆筛选阳性细胞,阳性克隆扩增与冻存,单克隆抗体性质的鉴定,获得分泌抗乙肝表面抗原的单克隆抗体的人-人杂交瘤或人-鼠杂交瘤细胞系。
(7)培养杂交瘤细胞,获得大量的含抗乙肝表面抗原的单克隆抗体的培养上清。
(8)收集细胞培养上清,用亲和层析柱纯化上清中的抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体。
本发明的优点是:(1)安全性好。用本方法生产乙肝表面抗体,不需要从乙肝表面抗体阳性人血中提取,从而避免了血液制品中可能污染其他致病原如丙肝、HIV等而导致用药者感染这些疾病的可能性。(2)来源方便。目前生产的乙肝免疫球蛋白是从乙肝表面抗体阳性人血中提取,原料来源非常有限,并且价格昂贵,采用本发明中可分泌乙肝表面抗体的杂交瘤细胞的大规模培养技术可以无限制大量生产乙肝表面抗体,并且随着生产规模的扩大可以大大降低生产成本。(3)产品质量可控性好。由于细胞的背景、细胞培养基的成分以及细胞培养上清的纯化都是明确可控的,用这种方法生产出的单克隆抗体的质量具有很强的可控性和可重复性,而血液来源的乙肝免疫球蛋白,由于人血成分的复杂及其不同捐血者的个体差异,其产品质量容易受到不同批次血液原料的影响。(4)可节约大量宝贵的血液资源。
具体实施方式
实施例1、表达抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体(human anti-HBsAgMcAb)的人-人杂交瘤细胞的制备
一、乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的获得
购买乙肝表面抗体阳性的健康志愿捐血者全血1份(200ml),先用800ml0.15%的甲基纤维素生理盐水溶液初步沉降全血中的红细胞,取上清用BeckmanJ6-HC离心机于4℃,2500~3000rpm下离心15min,弃去离心上清,沉降的细胞用含3%胎牛血清的0.1M PBS洗涤2遍,再用约10ml含3%胎牛血清的0.1MPBS悬浮细胞,制成细胞悬液。取10ml的玻璃离心管,加入3ml淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque,d=1.077),将2ml细胞悬液加至淋巴细胞分离液的上部,于500×g下离心20min。此时,离心管中形成5层,从上至下依次是:血浆层,外周血单个核细胞层(在界面上),淋巴细胞分离液层,粒细胞层和最下面的红细胞层。吸去血浆,收集外周血单个核细胞,加含5IU/ml肝素、3%胎牛血清的0.1M PBS悬浮单个核细胞,500×g离心10min,弃上清,再用同样方法洗涤2次,以洗去残留的淋巴细胞分离液。用血球记数板记数细胞,一般200ml外周血可获得2~4×108单个核细胞。
二、体外培养获得供细胞融合的可分泌抗HBsAg抗体的的人B细胞
1、乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的体外培养:将第步骤一获得的单个核细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)的培养基将细胞配成1×106/ml浓度,用细胞培养瓶培养,培养基中添加适量的细胞因子如IL-2、IL-4和(或)IL-6,~0.1μg/ml乙肝表面抗原,适量的可促进淋巴细胞分裂的植物凝聚素如商陆促有丝细胞分裂原,2-巯基乙醇5×10-5mol/mL,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml。
2、单个核细胞中的T细胞删除:经过7天体外培养,收集培养的单个核细胞,将细胞用PBS配成4×108/mL,取0.5mL细胞悬液与0.5mL 2mg/mL的大豆凝聚素混合,室温反应5~10min,使B细胞凝聚。在15mL离心管中加入10mL2%BSA溶液,垂直放置离心管,将上述细胞悬液慢慢加至BSA溶液上面,令细胞自然沉降,凝聚的B细胞可在10~15min内沉降至管底,而未凝聚的T细胞则在BSA溶液上部,吸出未凝聚细胞,收集沉降的B细胞,用D-半乳糖溶液解聚,便可获得纯度较高的单个B细胞。
三、SCID鼠体内培养获得供细胞融合的可分泌抗HBsAg抗体的的人B细胞
将步骤一获得的单个核细胞用DMEM/F12(1∶1)的培养基将细胞配成1~2×108/ml的细胞悬液,经尾静脉或腹腔注射到8~11周的SCID小鼠体内,每只小鼠注射的人单个核细胞数为5×107~1×108,5μg含Al(OH)3佐剂的乙肝疫苗。也可事先将SCID小鼠用2.5Gy的γ射线照射,再移植人单个核细胞。将SCID鼠置于SPF等级的动物房中饲养。14天后取小鼠眼球血一滴,用ELISA法测定anti-HBsAg抗体滴度,视情况决定是否再接种乙肝疫苗。20~30天左右,引颈法处死小鼠,无菌操作取小鼠脾脏,在小平皿中压碎研磨,加入少许不含血清的培养基,用100目的不锈钢网过滤,收集过滤后的细胞悬液于离心管中,记数,取1×108个细胞离心,弃上清,置室温待用。
四、人骨髓瘤细胞SP2的准备
复苏冻存的人骨髓瘤细胞SP2,用含10~20%的优级胎牛血清(美国Hyclone公司生产)的DMEM/F12(1∶1)培养基培养,融合前2天,将1瓶细胞传至3瓶培养,使细胞处于对数生长期,活力最好,收集此时的SP2细胞,记数,取1~2×107个细胞,离心,弃上清,置室温待用。
五、细胞融合
将准备好的人骨髓瘤细胞SP2和体外培养或SCID体内培养获得的含分泌anti-HBsAg抗体的人B细胞的混合细胞移至一50mL离心管中,加入10~20mL不含血清的RPMI1640培养基,离心,弃上清。将离心管放在掌心摇动,使细胞团成松散的糊状。将离心管置37℃水浴中,吸取~1mL 50%的PEG溶液,慢慢加入细胞中,边加边搅,1min加完。静置1min,在2min内慢慢加入2mL无血清培养基,再在2min内加入8mL无血清培养基,边加边搅。离心,吸去上清,将细胞团摇散,加入5mL新鲜的RPMI1640培养基。
六、融合细胞的筛选、扩增和抗体类型鉴定
1、融合细胞的选择性培养与阳性克隆检测:
用人间充质干细胞或人骨髓细胞做饲养细胞,用前用10Gy的γ射线照射,将融合细胞和饲养细胞移至一250mL盐水瓶中,加入50mL含20%胎牛血清的HAT选择性培养基,混匀后接种到两块96孔细胞培养板或两块24孔细胞培养板中培养。96孔板每孔加250μL,含细胞5×105(不包括饲养细胞);24孔板每孔加1mL,含细胞2×106。培养7~10d换HT培养基。按厂家说明书中所述方法和步骤,用乙肝表面抗体ELISA检测试剂盒检测各孔上清中的乙肝表面抗体,并做好阳性孔标记。
2、阳性杂交瘤的克隆化培养:
收集乙肝表面抗体阳性的培养孔中的细胞,记数,按100,000、10,000、1000、100和10倍的密度用RPMI1640培养基做系列稀释,取一96孔培养板,预先按每孔105~106加入饲养细胞和100μL RPMI1640培养基,然后加入8~10个/mL的低密度细胞悬液100μL。将培养板置于5%CO2、37℃培养7~10d。2~4d左右对确为1个细胞克隆生长的孔做好标记,若该孔再进行克隆化培养,并及时冻存获得的阳性杂交瘤细胞。我们从中筛选到几株可分泌乙肝表面抗体的杂交瘤细胞。
3、抗体类型鉴定:
用0.1M的PBS配置1%的琼脂溶液,趁热倒入小平皿中,凝结后打孔,中间打一个,周围打4~8个。取杂交瘤细胞培养上清1mL,加硫酸铵0.3g,沉淀抗体。1000rpm离心5min,弃上清,加入100μL PBS,溶解沉淀物。取上述溶液10μL加至中央孔中,周边孔中分别加入不同抗人Ig类的抗体10μL,4℃保湿放置24h以上,出现沉淀线者对应着周边孔中的Ig类型。
七、杂交瘤细胞的扩增
用100mL方瓶培养得到的可分泌anti-HBsAg单克隆抗体的杂交瘤细胞Hu-atHb28,每瓶加入10mL培养基,培养基为我们自行配制,以DMEM/F12(1∶1)为基础,添加了适量氨基酸、维生素、微量元素及白介素-2、白介素-4、白介素-6等细胞因子,胎牛血清含量为5~10%,待细胞长满后转入1000mL转瓶培养,一般3个方瓶可传一个转瓶,转瓶中加入100mL 2%血清的培养基,转速为0.3rpm。细胞在转瓶中长满后,3~5瓶转瓶中的细胞可转入一个1.5L搅拌瓶中继续培养,培养基体积为300~500mL,采用Cytopore-2多孔微载体培养杂交瘤细胞,多孔微载体的使用浓度为1~2g/L培养基。培养的初始阶段,血清浓度为1~2%,待细胞密度大于5×106后,可使用低血清(0.1%~0.5%)或无血清培养基培养。收集培养上清纯化其中的单抗。
八、单克隆抗体的纯化
利用蛋白A亲和层析法,纯化培养上清中的抗乙肝表面抗原的单克隆抗体。先用2~3倍柱床体积的PBS(0.1mol/L,pH7.1)平衡亲和柱,取培养上清过柱,流速为1~2ml/min,使单抗充分结合在亲和柱上,用PBS(0.1mol/L,pH7.1)洗涤亲和柱至OD值接近于零,再用0.5mol/L NaCl-PBS溶液洗柱以去除非特异性吸附,之后用三倍柱床体积的PBS洗涤亲和柱。以50mmol/L的甘氨酸-HCl溶液(pH2.3)洗脱,流速为1~2ml/min,收集洗脱液,并用1mol/L的Tris溶液迅速将洗脱液的pH调至中性。
实施例2、表达抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的hu-NS-1人-鼠杂交瘤细胞的制备
用小鼠骨髓瘤细胞NS-1替代人骨髓瘤细胞SP2,按照实施例1的相同方法与获得的分泌anti-HBsAg抗体的人B细胞融合,可以获得表达抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的人-鼠杂交瘤细胞。
实施例3、表达抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的hu-SP2/0人-鼠杂交瘤细胞的制备
用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0替代人骨髓瘤细胞SP2,按照实施例1的相同方法与获得的分泌anti-HBsAg抗体的人B细胞融合,可以获得表达抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的人-鼠杂交瘤细胞。
实施例4、抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的初步鉴定
按照实施例1中步骤六(2)所述方法,在周边孔上分别加入10μL羊抗人IgG、羊抗人IgM、羊抗人IgA,将实施例1纯化得到的单克隆抗体加入中间孔,4℃保湿放置24h后,与IgG对应的一边出现沉淀线,表明人-人杂交瘤细胞Hu-atHb28表达的是人IgG抗体。
用北京四环生物工程制品厂生产的乙肝表面抗体ELISA检测试剂盒(批准文号:(91)卫药准字(京环)S-05号)检测实施例1纯化得到的单克隆抗体,呈现阳性反应,表明人-人杂交瘤细胞Hu-atHb28表达的IgG抗体是抗乙肝表面抗原的特异性人源单克隆抗体。
Claims (9)
1、抗乙肝病毒表面抗原的人源单克隆抗体的制备方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
(1)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的分离;
(2)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的的体外培养;
(3)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞培养增殖后B细胞和T细胞的分离;
(4)用SCID鼠体内培养乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞;
(5)收集含表达乙肝表面抗体的人B细胞,与人骨髓瘤细胞SP2或小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0融合;
(6)选择性培养基培养筛选杂交细胞,检测筛选阳性细胞,克隆化培养,进一步克隆筛选阳性细胞,阳性克隆扩增与冻存,单克隆抗体性质的鉴定;
(7)培养杂交瘤细胞;
(8)收集细胞培养上清,用亲和层析柱纯化上清中的抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体。
2、根据权利要求书1所述方法,其特征在于:所述步骤(1)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的分离是指:先用0.1%的甲基纤维素生理盐水溶液初步沉降外周血中的红细胞,再利用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque,d=1.077)分离其中的单个核细胞。
3、根据权利要求书1所述方法,其特征在于:所述步骤(2)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞的的体外培养是指:在体外混合培养分离获得的外周血单个核细胞,培养基为DMEM/F12(1∶1),添加IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子,并添加适量的促有丝细胞分裂原、乙肝疫苗、适量氨基酸、维生素、微量元素及20%的小牛血清,培养条件:37℃温箱。
4、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞培养增殖后B细胞和T细胞的分离是指:采用植物凝聚素法,去除收集的体外混合培养的外周血单个核细胞中的T细胞,以富集和纯化B细胞,提高细胞融合效率。
5、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(4)用SCID鼠体内培养乙肝表面抗体阳性的健康人外周血单个核细胞是指:将获得的外周血单个核细胞腹腔注射或尾静脉注射至经过2.5Gy照射处理的SCID鼠或用未经处理的SCID鼠体内,建立hu-PBMC-SCID混合免疫系统,模拟人体的免疫系统,使人B细胞在SCID鼠体内活化、增殖、致敏。
6、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(5)收集含表达乙肝表面抗体的人B细胞,与人骨髓瘤细胞SP2或小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0融合是指:在培养上清或hu-PBMC-SCID小鼠血清中的乙肝表面抗体滴度较高时,收集体外培养得到的去除了T细胞的外周血单个核细胞或收集hu-PBMC-SCID的脾脏,经过一定方法处理,得到富含人B细胞的细胞悬液,按照制备杂交瘤细胞的经典方法,与人骨髓瘤细胞SP2或小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0融合。
7、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(6)选择性培养基培养筛选杂交细胞,检测筛选阳性细胞,克隆化培养,进一步克隆筛选阳性细胞,阳性克隆扩增与冻存,单克隆抗体性质的鉴定是指:用内含HAT的选择性培养基培养融合后的细胞,并且用经过10Gyγ-射线照射的人间充质干细胞做滋养细胞,将融合后的细胞和滋养细胞用选择性培养基混匀后,按5×105/孔接种到96孔板中培养;用乙肝表面抗体试剂盒检测阳性孔,取阳性空中的细胞用有限稀释法进行克隆筛选,直至获得分泌均一的单克隆抗体的杂交瘤细胞,将细胞扩增和冻存,并鉴定单抗类型。
8、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(7)培养杂交瘤细胞是指:用Cytopore-2纤维素多孔微载体在搅拌瓶中培养获得的杂交瘤细胞,培养基为自行研制的以DMEM和F12为基础的添加了某些营养成分的低/无血清培养基,视培养基中的葡萄糖浓度和抗体滴度决定换液量和换液频率,收集培养上清。
9、根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(8)收集细胞培养上清,用亲和层析柱纯化上清中的抗乙肝表面抗原的人源单克隆抗体是指:先用2~3倍柱床体积的PBS(0.1mol/L,pH7.1)平衡亲和柱,取培养上清过柱,流速为1~2ml/min,使单抗充分结合在亲和柱上,用PBS(0.1mol/L,pH7.1)洗涤亲和柱至OD值接近于零,再用0.5mol/L NaCI-PBS溶液洗柱以去除非特异性吸附,之后用三倍柱床体积的PBS洗涤亲和柱;以50mmol/L的甘氨酸-HCl溶液(pH2.3)洗脱,流速为1~2ml/min,收集洗脱液,并用1mol/L的Tris溶液迅速将洗脱液的pH调至中性。
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