CN109432413B - 一种森林脑炎病毒灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体提供一种森林脑炎病毒灭活疫苗及其制备方法，所述疫苗包含有效量的灭活森林脑炎病毒和复合疫苗佐剂，所述佐剂出人意料地增强了所述疫苗的免疫效果，可显著降低疫苗抗原的用量，利用本发明的疫苗免疫后，机体能够保持较高的抗体水平并维持较长的时间，获得了有益的免疫效果。

Description

一种森林脑炎病毒灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及森林脑炎病毒灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

森林脑炎(Tick-Borne Encephalitis,TBE)是林区的常见病及多发病，森林脑炎的发病具有季节性，每年5-7月份发病，在全球发病广泛，我国主要以东北地区为主。卫生部出台的《职业性森林脑炎诊断标准》中将职业性森林脑炎定义为劳动者在森林地区的劳动活动中因被蜱叮咬而感染的中枢神经系统的急性病毒性传染疾病，其由森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)(又称蜱传脑炎病毒)引发。

森林脑炎病毒属黄病毒科黄病毒属，病毒颗粒呈直径40-50nm球形，分子量约4×10⁶Da，为单链RNA病毒，含有三种结构蛋白，其传染性易为热灭活(72℃，10秒)，也可被蛋白酶、甲醛、过氧化氢、乙醚、β-丙内酯、Triton X-100等作用而失活。

现有预防森林脑炎发生的有效措施即接种疫苗，而常规的森林脑炎疫苗即森林脑炎病毒灭活疫苗，中国药典中规定将森林脑炎病毒经由灭活处理后与适量的氢氧化铝佐剂混合制备灭活疫苗。

佐剂是一类非特异性免疫增强剂，本身不具有抗原性，可先于抗原或与抗原同时注入机体，从而非特异性地增强或者改变机体对抗原免疫应答的物质。目前常用的佐剂按照类型可划分为以下六类，1)矿物质佐剂，主要包括氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙、氢氧化锌、磷酸锌、氢氧化铁凝胶等；2)油佐剂，主要包括弗氏佐剂、MF-59、SAF、白油Span佐剂、佐剂-65等；3)微生物佐剂，主要包括寡脱氧核苷酸(CPGODN)、短小棒状杆菌(CP)、卡介苗(BCG)、细菌脂多糖(LPS)、霍乱毒素(CT)等；4)含脂类佐剂，如脂质体、免疫刺激复合体(ISCOM)等；5)中草药类，如蜂胶、皂苷、多糖等；6)分子佐剂，如细胞因子、共刺激分子、免疫刺激调节分子、趋化因子等。多年来试验研究证实，佐剂对疫苗的免疫效果有正向帮助作用，在疫苗的生产中，选择能够与疫苗免疫机制相匹配的佐剂在增强疫苗的免疫效力以及减小副作用方面具有重要的意义。

而如前所述，森林脑炎病毒灭活疫苗中所用的佐剂为铝盐，铝盐作为疫苗佐剂已有近90年的历史，铝佐剂主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾三种，其中氢氧化铝和磷酸铝最为常用，虽然铝佐剂使用历史悠久，佐剂辅助机制相对清晰，且安全有效、耐受性良好，但其使用仍有很多限制，如接种含铝佐剂的疫苗可导致一些局部不良反应，如红斑、肉芽肿、接触性超敏等。另外，有研究认为，铝佐剂倾向于诱导Th2类免疫反应，而诱导Th1类免疫反应的能力则相对较弱。针对铝佐剂的缺点，为了获得更好的免疫反应，有研究者将铝佐剂与其他成分联合，开发了复合佐剂，如ASO4是一种已批准用于HBV疫苗和HPV疫苗的新型人用含铝复合佐剂，其成分为单磷酰脂质A和氢氧化铝的混合物。但是不同种类的复合佐剂的免疫促进作用相差较大。

因此，针对现有的森林脑炎病毒灭活疫苗有必要进一步研究其适合的佐剂，以克服现有的铝佐剂的缺陷，从而进一步增强疫苗的免疫效果以及降低毒副作用。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种复合疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝、黄芩多糖，所述复合疫苗佐剂能够大大增强森林脑炎病毒灭活疫苗的免疫效果。

进一步地，本发明提供了一种森林脑炎病毒灭活疫苗，所述疫苗包括有效量的灭活的森林脑炎病毒以及复合疫苗佐剂，优选地，所述复合疫苗佐剂包括氢氧化铝和黄芩多糖。该疫苗的免疫效果显著优于单独以氢氧化铝作为佐剂的森林脑炎病毒灭活疫苗的免疫效果，免疫血清抗体效价高且持续时间长，副反应也小。

进一步地，本发明提供了一种森林脑炎病毒灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1)森林脑炎病毒株感染宿主细胞，培养宿主细胞；2)收获细胞培养物获得病毒收获液；3)病毒收获液进行澄清处理后超滤浓缩；4)浓缩后的病毒液进行灭活处理；5)浓缩病毒液灭活后利用层析柱进行柱层析纯化，用紫外监测仪检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原；6)检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，除菌过滤后的森林脑炎病毒抗原加入权利要求1所述的复合佐剂，即获得森林脑炎病毒灭活疫苗；可选地，可进一步加入人血清白蛋白和或硫柳汞。

进一步地，所述复合佐剂中氢氧化铝的用量优选为0.1-0.7mg/ml，更优选为0.3-0.5mg/ml，最优选为0.3mg/ml。

进一步地，所述复合佐剂中黄芩多糖的用量优选为1-10mg/ml，更优选为2-5mg/ml，最优选为2mg/ml。

进一步地，所述复合佐剂包括0.3mg/ml的氢氧化铝以及2mg/ml的黄芩多糖。

进一步地，所述森林脑炎灭活疫苗还包括稳定剂和或防腐剂。

进一步地，所述稳定剂为人血清白蛋白，所述防腐剂为硫柳汞，优选地，所述人血清白蛋白的终浓度为0.1％。

进一步地，本发明提供的疫苗选用的森林脑炎病毒株为“森张”株，其保藏号为CCTCC V202004；优选地，选用的病毒株为森林脑炎病毒SZV株，其保藏号为：CGMCC 10960。

有益效果

本发明的复合疫苗佐剂相较于森林脑炎病毒灭活疫苗常规选用的氢氧化铝佐剂具有免疫效果更好、免疫保护持续时间更长、副作用更小的有益效果。

另外，黄芩多糖是一种中药多糖，能够调节细胞免疫功能，还可活化补体，诱导细胞因子分泌，显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能，因此，能够在增强森林脑炎病毒灭活疫苗免疫效果的同时额外提高机体的免疫功能。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。

实施例1：森林脑炎灭活病毒的制备

本实施例中，所选用的病毒株为森林脑炎病毒“森张”株或森林脑炎病毒SZV株，其中“森张”株的保藏号为CCTCC V202004，SZV株的保藏号为CGMCC 10960。

灭活病毒按照现有技术已知方法进行制备，具体方法如下：

取已经长成致密单层的Vero细胞，弃去细胞生长液，加入Versene溶液清洗，弃去，加入pH值为7.4终浓度为0.1％的细胞消化液进行消化，待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变后，弃去细胞消化液，用细胞生长液并分散细胞，所述细胞生长液即在199溶液中加入终浓度为4％的新生牛血清，采用7.5％NaHCO₃溶液调整pH值至6.8～7.6而获得；在细胞培养瓶进行细胞培养或采用片状载体进行生物反应器培养时，细胞的接种浓度可选择为1.0×10⁴/ml。培养温度为36～38℃。使用片状载体进行生物反应器进行培养时，可采用流加培养方式，培养48小时后，可长成致密单层细胞。

弃去生物反应器内的细胞生长液，用Earle’s液或0.01mol/L磷酸盐缓冲液冲洗细胞后弃去，加入含有森林脑炎病毒的维持液，病毒感染复数选择为0.001～0.5；所述维持液即在199溶液中加入终浓度为0.1％的新生牛血清，采用7.5％NaHCO₃溶液调整pH值至7.6～8.6而获得，培养温度为32～34℃，经24小时培养后开始进行流加收获。

病毒收获液经0.45μm滤柱进行澄清，以去除细胞碎片等杂质，取上清液待进一步纯化。

病毒收获液经澄清处理后，可以选择100KD的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数可以选择20倍、40倍等。

浓缩后的病毒液选择1/2000的β-丙内酯进行灭活，灭活时间为24小时灭活温度为2～8℃；在灭活过程中注意摇晃，使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后，在35～37℃水浴2～4小时，以使残留的β-丙内酯降解；

浓缩病毒液经灭活后，选择Sepharose 4FF介质，用pH 7.4～7.8的0.01M PBS缓冲液平衡后，进行柱层析纯化，用紫外监测仪(A＝280nm)检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1％的人血白蛋白为稳定剂；根据原液中的蛋白质含量及抗原含量，使用疫苗稀释剂进行稀释，所述疫苗稀释剂为pH值为7.4～7.8的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。

经由上述方法制备的灭活森林脑炎病毒用于后续的灭活疫苗配制。

实施例2：森林脑炎病毒灭活疫苗的制备

为了筛选获得合适的森林脑炎病毒灭活疫苗用佐剂，在经初步筛选排除的基础上，本实施例进一步选取了免疫效果较好的氢氧化铝、IL-2、黄芩多糖、MF-59、蜂胶来制备森林脑炎病毒灭活疫苗。

其中氢氧化铝佐剂购自Thermo公司，IL-2购自上海普欣生物技术有限公司，黄芩多糖购自陕西锦泰生物工程有限公司，MF-59购自Chirou公司，蜂胶购自药都药业股份有限公司。

将实施例1制备获得的浓缩的灭活森林脑炎病毒按抗原含量为1：16进行稀释后分别加入佐剂

所制备的疫苗如表1所示：

选取体重300-350g的豚鼠，随机分组，每组5只，分别用表1所示的10组森林脑炎灭活疫苗进行腹腔免疫，初次免疫后间隔一周进行加强免疫，免疫剂量为0.5ml/次，加强免疫后第10天采血并离心分离血清，分离后的血清分装放置于-20℃冰箱保存。

利用德国DRG公司生产的森林脑炎病毒IgG抗体检测试剂盒检测豚鼠血清中抗体的滴度。

抗体滴度测定结果如表2所示：

由表2的抗体滴度测定结果可知，第9组即氢氧化铝和黄芩多糖作为复合佐剂时相较于单独的氢氧化铝佐剂、MF-59佐剂、黄芩多糖佐剂、IL-2佐剂或蜂胶佐剂均获得了较高的抗体水平，不受理论限制地，氢氧化铝和黄芩多糖制备的复合佐剂是由于预料不到的协同作用而增强了森林脑炎病毒灭活疫苗的免疫效果。

实施例3：森林脑炎灭活疫苗中复合佐剂最佳免疫剂量的确定

根据利用森林脑炎病毒灭活疫苗免疫后的豚鼠的抗体滴度来确定复合佐剂中氢氧化铝和黄芩多糖的最佳免疫剂量。

基于药典对疫苗中氢氧化铝用量的规范，选择0.7mg/ml、0.5mg/ml、0.3mg/ml和0.1mg/ml共计四个梯度进行测定，而黄芩多糖则选择10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml共计三个梯度进行测定。

利用实施例1制备获得的浓缩的灭活森林脑炎病毒按抗原含量为1：16进行稀释后分别加入上述复合佐剂，进一步按照实施例2中对豚鼠的免疫方案以及抗体滴度检测方法测定上述复合佐剂的免疫效果。

复合佐剂具体试验设计及抗体滴度(抗体平均值)测定结果如表3所示：

由表3中的抗体滴度测定结果可知，当选择含0.3mg/ml或0.5mg/ml的氢氧化铝的复合佐剂时均可获得较佳的免疫效果，再结合结合现有技术中对铝佐剂的缺陷的研究，优选利用0.3mg/ml氢氧化铝和2mg/ml黄芩多糖制备复合佐剂。

实施例4：森林脑炎病毒灭活疫苗保护力实验

森林脑炎病毒灭活疫苗的配制：

将实施例1制备的浓缩灭活森林脑炎病毒按抗原含量为1：16进行稀释后加入复合佐剂(0.3mg/ml氢氧化铝和2mg/ml黄芩多糖)获得1ml疫苗A；

将实施例1制备的浓缩灭活森林脑炎病毒按抗原含量为1：32进行稀释后加入复合佐剂(0.3mg/ml氢氧化铝和2mg/ml黄芩多糖)获得1ml疫苗B；

将实施例1制备的浓缩灭活森林脑炎病毒按抗原含量为1：64进行稀释后加入复合佐剂(0.3mg/ml氢氧化铝和2mg/ml黄芩多糖)获得1ml疫苗C；

将实施例1制备的浓缩灭活森林脑炎病毒按抗原含量为1：16进行稀释后加入0.5mg/ml氢氧化铝获得1ml疫苗D。

疫苗A、B、C、D分别用于下述疫苗保护力实验。

选取4-6周龄的BALB/小鼠，每组60只进行随机分组，共分成五组，每组小鼠在第0天分别用生理盐水(即空白对照)、疫苗A、B、C或D进行初始免疫，间隔1周进行一次加强免疫，加强免疫后的第14天以适宜稀释度的“森张”株病毒悬液分别进行小鼠腹腔攻击，每个病毒稀释度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10)分别接种6只小鼠，每只0.3ml，攻击后3天内死亡者不计，观察21天判定结果。

结果显示，对照组病毒滴度为7.7lg LD₅₀/0.3ml，而疫苗A的免疫保护指数为4.5×10⁹，疫苗B的免疫保护指数为4.4×10⁹，疫苗C的免疫保护指数为4×10⁸，疫苗D的免疫保护指数为3.1×10⁸。

即疫苗A和疫苗B的免疫保护力显著强于疫苗C、疫苗D的免疫保护力(p<0.05)。

由上述疫苗保护力实验可知，在抗原用量减少且铝佐剂用量降低的情况下，使用复合佐剂的灭活疫苗相对于传统的铝佐剂灭活疫苗能够获得更好的免疫保护效果，不受理论限制地，由于复合佐剂中的氢氧化铝和黄芩多糖与森林脑炎病毒灭活抗原之间产生了协同作用从而大大增强了灭活的森林脑炎病毒的免疫原性，显著提高了灭活疫苗的免疫效果。

另外，参照上述免疫方案，以疫苗B和疫苗D分别免疫10只小鼠，并在第8周、第16周和第40周分别测定小鼠血清中森林脑炎病毒特异性IgG抗体的滴度。

抗体滴度测定结果如表4所示：

*疫苗B在小鼠中所诱导产生抗体滴度显著高于疫苗D在所对应时间诱导产生的抗体滴度，P＜0.05。

由表4可知，使用本发明的复合佐剂制备的森林脑炎病毒灭活疫苗能够在机体中诱导产生高水平的抗体滴度，且抗体能够持续较长时间，对机体起到很好的病毒保护效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种复合佐剂，其特征在于：所述复合佐剂包括氢氧化铝和黄芩多糖，所述复合佐剂能够增强森林脑炎病毒灭活疫苗的免疫效果，并且所述氢氧化铝的含量为0.3-0.5mg/ml，以及所述黄芩多糖的含量为2-5mg/ml。

2.根据权利要求1所述的复合佐剂，其特征在于：所述氢氧化铝的含量为0.3mg/ml，以及黄芩多糖的含量为2mg/ml。

3.一种森林脑炎病毒灭活疫苗，其特征在于：所述森林脑炎病毒灭活疫苗包括有效量的灭活的森林脑炎病毒以及复合佐剂；其中，单位剂量的疫苗的复合佐剂中氢氧化铝的含量为0.3-0.5mg/ml，以及黄芩多糖的含量为2-5mg/ml。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括稳定剂和/或防腐剂。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述稳定剂为人血清白蛋白，所述防腐剂为硫柳汞。

6.权利要求3所述森林脑炎病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)森林脑炎病毒株感染宿主细胞，培养宿主细胞；2)收获细胞培养物获得病毒收获液；3)病毒收获液进行澄清处理后超滤浓缩；4)浓缩后的病毒液进行灭活处理；5)浓缩病毒液灭活后利用层析柱进行柱层析纯化，用紫外监测仪检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原；6)检测蛋白质含量、抗原含量，根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，除菌过滤后的森林脑炎病毒抗原加入权利要求1所述的复合佐剂，即获得森林脑炎病毒灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在获得的森林脑炎病毒灭火疫苗中进一步加入人血清白蛋白或硫柳汞。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：感染宿主细胞的病毒株为“森张株”，其保藏号为CCTCC V202004。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：感染宿主细胞的病毒株为森林脑炎病毒SZV株，其保藏号为：CGMCC 10960。