CN104208667A - 一种三联灭活疫苗制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种三联灭活疫苗制备方法，本发明制备的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗能够达到较好的免疫效果，同时可以达到一针多防、降低成本、减少猪只应激的目的。

Description

一种三联灭活疫苗制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种三联灭活疫苗制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪肺炎支原体是当今危害养猪业的重要病原，常作为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环病毒病及猪流感的并发或继发感染病原，严重危害我国乃至世界养猪业的发展。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis of Swine,HPS)是副猪嗜血杆菌病的病原体，是猪上呼吸道的一种共栖菌，它可在特定条件侵入机体而引起以纤维素性多发性桨膜炎、关节炎、脑膜炎和高热为主要特征的全身性疾病。副猪嗜血杆菌病又称猪革拉泽氏病(Glsser’s Disease)，可以侵害2周龄至4月龄猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，多发于5-8周龄，发病率达40％，严重时高达50％。副猪嗜血杆菌血清型较复杂，按热稳定可溶抗原和琼脂扩散试验(AGPT)血清分型方法将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，但仍有20％分离株型特异性抗原表达量不足而不能分型。我国主要流行血清型为4、5、12、13型(VetMicrobiol.2005,1:231-236)，其中血清型4、5型最为流行。由于抗生素等药物的滥用导致该菌的耐药性越来越强，采用疫苗免疫成为预防副猪嗜血杆菌病经济而有效的途径。在研制和开发副猪嗜血杆菌灭活苗时，显著增强体液免疫作用的佐剂对提高疫苗的效力十分重要。

猪链球菌(Streptococcus Suis,SS)是猪链球菌病的病原，属革兰氏阳性兼性厌氧菌，猪链球菌病是一种人兽共患病。其临床表现不同症状：败血症、脑膜炎、心内膜炎、肺炎、淋巴结脓肿及多发性关节炎等。可侵害不同品种、年龄、性别猪只，大多数在3-12周龄仔猪暴发流行，断奶及混群时易出现发病高峰，集约化猪场尤为严重。猪链球菌根据菌体荚膜抗原特性的不同，可以分为35个血清型(1～34型及1/2型)，其中2型流行最广，对猪的致病性最强，其次是1型。猪链球菌所致的猪链球菌病在猪群的流行情况、发病率及死亡率均有很大差别。发病率可以小于1％直至大于50％，但一般不超过5％，卫生条件差及存在并发感染时发病率升高，流行一般超过数周。近年，猪链球菌2型发病率有上升趋势，引起人们的高度重视。

猪支原体肺炎(Mycoplasmal Pneumonia of Swine,MPS)是一种慢性接触性呼吸道传染病，也称地方流行性肺炎或喘气病。主要临床特征表现为咳嗽和喘气。不同季节不同日龄猪只均易感，多发于生长育肥阶段猪只，发病猪生长缓慢、饲料报酬低下，从而使饲养期延长。该病发病率高，死亡率低，且难以根除。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mph)是引起猪支原体肺炎的原发性病原，当猪肺炎支原体与多杀性巴士杆菌(Pasteurella Multocida)、猪链球菌(Streptococcus Suis,SS)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis of Swine,HPS)或猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumonia of Porcine,APP)等病原混合感染时，会引起猪地方流行性肺炎；当猪肺炎支原体与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)等病原混合感染时，又会引起猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的发生，PRDC不仅可以引起猪的呼吸系统疾病，同时也会导致猪的繁殖能力下降。猪肺炎支原体营养条件要求十分苛刻，一般培养基中难以生长，其鉴定方法也非常繁琐，且不易成功。目前，广泛使用的疫苗株为猪肺炎支原体J株，疫苗免疫是目前避免感染及有效防控的最有效办法。

细胞免疫和体液免疫是机体抵抗感染的两大保护机制，淋巴细胞对猪肺炎支原体抗原的特异性应答及相应细胞因子的释放与抗猪肺炎支原体感染能力之间呈明显正相关，因此，猪支原体肺炎的预防中，细胞免疫应答起非常重要作用。在免疫猪支原体肺炎灭活疫苗后，能明显的从免疫动物血液中检测到特异性血清IgG抗体，但研究者一致认为全身体液免疫在猪支原体肺炎免疫过程中仅能提供有限的保护。而副猪嗜血杆菌和猪链球菌灭活疫苗中，促进体液免疫作用的佐剂对提高疫苗的效力十分重要，因此制备副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗，筛选佐剂时应同时兼顾其对细胞免疫和体液免疫的刺激能力。

目前，市场上使用的疫苗只有单一的或二联的预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病或猪支原体肺炎的灭活苗或活疫苗，而这三种病中的一种或几种通常与猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病等并发或继发感染，或者这三种病的混合感染，市售商品疫苗需多次免疫，成本高，对猪的应激较大。另外，同时预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎的灭活疫苗，国内外还未见有报道。因此，需要发明一种新的能同时预防副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎的三联灭活疫苗及其制备方法以解决当前面临的问题。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种三联灭活疫苗制备方法，以实现通过该方法制备的产品对副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪肺炎支原体均产生免疫作用，从而起到更加可靠的预防作用。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；

2)利用甲醛分别对步骤1)制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；

3)利用超滤方法对步骤2)灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至10⁷～10¹²CFU/mL；

4)取步骤3)调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)(v/v)的比例混匀得到混合抗原溶液；

5)取步骤4)得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。

优选的，步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方：牛心浸出液300份；双蒸水360份；Hank’s溶液40份；0.25(w/v)酚红10份；马血清200份；5％(w/v)水解乳蛋白100份；25％(w/v)酵母浸出液20份；10万单位青霉素10份。

优选的，步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下：取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其pH值调至7.2～7.6，灭菌，再加入无菌的配方量的Hank’s溶液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。

优选的，步骤5)具体包括以下流程：取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；取白油佐剂与上述水相以(55％～45％):(45％～55％)(v/v)的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。在此基础上可以进行一下优选：优选的，所述白油佐剂制备方法为：取司本80与白油按(3～6):(94～97)(v/v)的比例混合，再向该混合物中加入1.5～2.5％(v/v)的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。优选的，所述水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入2～8％(v/v)的吐温80混匀至完全溶解即为水相。优选的，所述水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200mg/mL，即为水相。优选的，所述水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335mg/mL，即为水相。优选的，所述水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10mg/mL，即为水相。

优选的，步骤5)具体包括以下流程：取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，以4～16％(v/v)的比例向其中加入GEL 01 ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；

副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗及猪支原体肺炎灭活疫苗相比，相应病原的免疫保护力基本相当，但可以达到一针多防、降低成本、减少猪只应激的目的。

具体实施方式

实施例1一种三联灭活疫苗制备方法

一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗的制备方法，其步骤如下：

1生产菌种制备

1.1一级种子繁殖

将副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD平板上，37℃培养18～24小时，挑取单菌落接种于TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12～16小时，为一级种子；猪肺炎支原体冻干菌种划线接种于固体培养基上，37℃培养7日，挑取单菌落接种斜面固体培养基上，37℃培养7日，为一级种子。

1.2二级种子繁殖

将制备的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型一级种子按1％的体积比接入TSB/NAD培养基中，37℃培养12～16小时，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子；将制备的猪肺炎支原体一级种子按体积比1％接入到液体培养基中，37℃培养7日，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。

2抗原制备

2.1菌液制备

将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型二级种子按1％体积比接种到TSB/NAD培养基中，37℃培养18小时；将鉴定合格的猪肺炎支原体二级种子按1％体积比接入到液体基础培养基中，37℃培养24小时。

上述制得菌液分别进行纯粹检验及活菌计数，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。

2.2抗原灭活

将检验合格的菌液，按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，37℃灭活24～48小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行灭活检验，应无细菌生长。

2.3抗原浓缩

将检验合格的灭活抗原经中空纤维素超滤浓缩，根据灭活前活菌计数结果用生理盐水将灭活抗原浓度调整为1.0*10¹⁰CFU/mL或1.0*10¹⁰CCU/mL。取样做无菌检验，应无细菌生长。

3配苗

3.1副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联白油佐剂灭活疫苗配置

将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩-重悬稀释液按1∶1∶1∶1体积比混匀作为水相，与白油佐剂按体积比1∶1混合乳化，混合乳化前按体积比加入0.01％的硫柳汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎水包油白油佐剂疫苗。

3.2副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联左旋咪唑白油佐剂灭活疫苗配置

将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩-重悬稀释液按1∶1∶1∶1体积比混匀作为水相，将左旋咪唑母液加入到抗原混合液中，使其最终免疫剂量100mg/头份，与白油佐剂按体积比1∶1混合乳化，混合乳化前按体积比加入0.01％的硫柳汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎水包油型左旋咪唑白油佐剂疫苗。

3.3副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联黄芩多糖白油佐剂灭活疫苗配置

将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩-重悬稀释液按1∶1∶1∶1体积比混匀作为水相，将黄芩多糖母液加入到抗原混合液中，使其最终免疫剂量1g/头份，与白油佐剂按体积比1∶1混合乳化，混合乳化前按体积比加入0.01％的硫柳汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎水包油型黄芩多糖白油佐剂疫苗。

3.4副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联壳多糖白油佐剂灭活疫苗配置

将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩-重悬稀释液按1∶1∶1∶1体积比混匀作为水相，将壳多糖母液加入到抗原混合液中，使其最终免疫剂量100mg/头份，与白油佐剂按体积比1∶1混合乳化，混合乳化前按体积比加入0.01％的硫柳汞，制得副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎水包油型壳多糖白油佐剂疫苗。

3.5副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联GEL佐剂灭活疫苗配置

将灭活的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪肺炎支原体抗原浓缩-重悬稀释液按1∶1∶1∶1体积比混匀作为抗原混合液，按10％体积比加入GEL 01 ST佐剂，大枪吹匀，制成水佐剂的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联GEL佐剂灭活疫苗。

3.6无菌检验

取上述配制疫苗按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无细菌生长。

4分装

定量分装，加塞，密封，2～8℃保存。

实施例2：实施例1制备的疫苗安全性研究

取实施例1中制备的疫苗各肌肉注射4～5周龄健康易感断奶仔猪，每头2mL(含1头份)，每种疫苗注射5头，对照组5头，2周后，以相同方法及相同剂量进行二免，观察2周，应无局部或全身不良反应且全部健活。结果见表1。

表1安全性研究结果

安全性试验结果显示：副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联白油佐剂灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联左旋咪唑白油佐剂灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联黄芩多糖白油佐剂灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联壳多糖白油佐剂灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪支原体肺炎三联GEL 01 ST佐剂灭活疫苗对仔猪安全。

实施例3：疫苗效力研究

1试验设计

1.1疫苗免疫

取实施例1制备的疫苗，各种疫苗肌肉注射4～5周龄健康易感断奶仔猪，每头2mL(一头份)，每组20头，首免3周后二免，免疫剂量同一免，同时每组疫苗设20头作为对照，不免疫。

购买市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗(4型、5型)，购自中牧实业股份有限公司，批号为1209006；猪链球菌灭活疫苗(2型)，购自广东永顺生物制品有限责任公司，批号2012010；猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)，购自西班牙海博莱公司，批号为31KB-1。上述购买的疫苗分别按其注射方法及注射剂量注射4～5周龄健康易感断奶仔猪。

表2疫苗免疫分组

1.2攻毒

免疫后5周，副猪嗜血杆菌采用腹腔内注射攻毒，攻毒剂量为副猪嗜血杆菌4型1*10¹⁰CFU、副猪嗜血杆菌5型1*10¹⁰CFU。免疫后5周，猪链球菌2型采用静脉注射攻毒，攻毒剂量为1*10⁹CFU。免疫后10周，猪肺炎支原体采用气管注射攻毒，攻毒用强毒株CVCC345株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国兽医药品监察所报藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5mL/头(100MID)。攻毒分组如下表3。

表3攻毒分组

1.2效力检验结果

副猪嗜血杆菌、猪链球菌攻毒后观察2周，记录免疫组及对照组临床症状及死亡头数。猪支原体肺炎攻毒后观察30日，记录免疫组及对照组临床症状及死亡头数。结果见下表。

表4效力检验结果

效力检验结果显示：在白油佐剂基础上添加免疫增强剂左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖，对于副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌病的保护力并无明显增加，均达80％以上，而左旋咪唑与壳多糖却可以增加猪支原体肺炎的保护力，达80％。SEPPIC佐剂GEL 01 ST的三联苗，副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌病保护力与其他佐剂相比无明显差异，均在80％以上，但猪支原体肺炎的保护力却明显高于其他佐剂疫苗，可达100％。为此副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗选用GEL 01 ST佐剂，免疫效果可达最佳。

副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎三联灭活疫苗与市售的副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗及猪支原体肺炎灭活疫苗相比，相应病原的免疫保护力基本相当，但可以达到一针多防、降低成本、减少猪只应激的目的。

实施例4

一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；

2)利用甲醛分别对步骤1)制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；

3)利用超滤方法对步骤2)灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至10¹²CFU/mL；

4)取步骤3)调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以1:2:1:2(v/v)的比例混匀得到混合抗原溶液；

5)取步骤4)得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。

实施例5

一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；

2)利用甲醛分别对步骤1)制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；

3)利用超滤方法对步骤2)灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至10¹⁰CFU/mL；

4)取步骤3)调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以1:1:1:1(v/v)的比例混匀得到混合抗原溶液；

5)取步骤4)得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。

其中步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方：

牛心浸出液300份；

双蒸水360份；

Hank’s溶液40份；

0.25(w/v)酚红10份；

马血清200份；

5％(w/v)水解乳蛋白100份；

25％(w/v)酵母浸出液20份；

10万单位青霉素10份。

步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下：取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其pH值调至7.4，灭菌，再加入无菌的配方量的Hank’s溶液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。

步骤5)具体包括以下流程：

取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；

取白油佐剂与上述水相以50％:50％(v/v)的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。

所述白油佐剂制备方法为：取司本80与白油按3:97(v/v)的比例混合，再向该混合物中加入2％(v/v)的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。

水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入2～8％(v/v)的吐温80混匀至完全溶解即为水相；或向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200mg/mL，即为水相；或向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335mg/mL，即为水相；或向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10mg/mL，即为水相。

步骤5)具体包括以下流程：

取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，以10％(v/v)的比例向其中加入GEL 01 ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；

实施例6

一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；

2)利用甲醛分别对步骤1)制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；

3)利用超滤方法对步骤2)灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至10⁷CFU/mL；

4)取步骤3)调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以1:1:2:2(v/v)的比例混匀得到混合抗原溶液；

5)取步骤4)得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。

其中步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方：

牛心浸出液300份；

双蒸水360份；

Hank’s溶液40份；

0.25(w/v)酚红10份；

马血清200份；

5％(w/v)水解乳蛋白100份；

25％(w/v)酵母浸出液20份；

10万单位青霉素10份。

步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下：取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其pH值调至7.2，灭菌，再加入无菌的配方量的Hank’s溶液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。

步骤5)具体包括以下流程：

取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；

取白油佐剂与上述水相以55％:45％(v/v)的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。

所述白油佐剂制备方法为：取司本80与白油按5:95(v/v)的比例混合，再向该混合物中加入1.5％(v/v)的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。

水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入4％(v/v)的吐温80混匀至完全溶解即为水相；或向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200mg/mL，即为水相；或向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335mg/mL，即为水相；或向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10mg/mL，即为水相。

步骤5)具体包括以下流程：

取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，以10％(v/v)的比例向其中加入GEL 01 ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；

实施例7

一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；

2)利用甲醛分别对步骤1)制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；

3)利用超滤方法对步骤2)灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至10⁹CFU/mL；

4)取步骤3)调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以2:2:1:1(v/v)的比例混匀得到混合抗原溶液；

5)取步骤4)得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。

其中步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方：

牛心浸出液300份；

双蒸水360份；

Hank’s溶液40份；

0.25(w/v)酚红10份；

马血清200份；

5％(w/v)水解乳蛋白100份；

25％(w/v)酵母浸出液20份；

10万单位青霉素10份。

步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下：取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其pH值调至7.6，灭菌，再加入无菌的配方量的Hank’s溶液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。

步骤5)具体包括以下流程：

取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；

取白油佐剂与上述水相以45％:55％(v/v)的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。

所述白油佐剂制备方法为：取司本80与白油按6:94(v/v)的比例混合，再向该混合物中加入2.5％(v/v)的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。

水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入8％(v/v)的吐温80混匀至完全溶解即为水相；或向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200mg/mL，即为水相；或向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335mg/mL，即为水相；或向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10mg/mL，即为水相。

步骤5)具体包括以下流程：

取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，以10％(v/v)的比例向其中加入GEL 01 ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别培养副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体，制备得到活菌液；

2)利用甲醛分别对步骤1)制备得到的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行灭活；

3)利用超滤方法对步骤2)灭活后的副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型及猪肺炎支原体进行浓缩，后经生理盐水重悬浮菌体，再分别调整菌体浓度至10⁷～10¹²CFU/mL；

4)取步骤3)调整浓度后的副猪嗜血杆菌4型菌液、副猪嗜血杆菌5型菌液、猪链球菌2型菌液、猪肺炎支原体菌液以(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)(v/v)的比例混匀得到混合抗原溶液；

5)取步骤4)得到的混合抗原溶液与疫苗佐剂混合制得三联灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基为以下配方：

牛心浸出液300份；

双蒸水360份；

Hank’s溶液40份；

0.25(w/v)酚红10份；

马血清200份；

5％(w/v)水解乳蛋白100份；

25％(w/v)酵母浸出液20份；

10万单位青霉素10份。

3.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1)培养猪肺炎支原体的培养基制备方法如下：取配方量的牛心浸出液、双蒸水混匀，将其pH值调至7.2～7.6，灭菌，再加入无菌的配方量的Hank’s溶液、酚红、马血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青霉素混匀。

4.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5)具体包括以下流程：

取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，向其中加入吐温80、左旋咪唑、黄芩多糖、壳多糖的其中一种完全溶解即为水相；

取白油佐剂与上述水相以(55％～45％):(45％～55％)(v/v)的比例混合乳化，乳化过程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三联灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述白油佐剂制备方法为：取司本80与白油按(3～6):(94～97)(v/v)的比例混合，再向该混合物中加入1.5～2.5％(v/v)的硬脂酸铝，加热熔化混匀，高压灭菌。

6.根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入2～8％(v/v)的吐温80混匀至完全溶解即为水相。

7.根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑终浓度200mg/mL，即为水相。

8.根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入黄芩多糖，至黄岑多糖终浓度为335mg/mL，即为水相。

9.根据权利要求4所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于所述水相的制备具体包括以下流程：向混合抗原溶液中加入壳多糖，至终浓度为10mg/mL，即为水相。

10.根据权利要求1所述的一种三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5)具体包括以下流程：

取权利要求1步骤4)所述的混合抗原溶液，以4～16％(v/v)的比例向其中加入GEL 01 ST佐剂混匀，即得到三联灭活疫苗；