JP2001299355A - 日本脳炎ウイルス遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターおよびそれを用いたワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトで使用するのに適した日本脳炎ウイルス
遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターおよび
それを用いたワクチンを提供すること。 【解決手段】 日本脳炎ウイルスの前駆膜（ｐｒＭ）シ
グナル配列、前駆膜（ｐｒＭ）遺伝子および外被膜
（Ｅ）遺伝子を、プロモーター、サイトメガロウイルス
由来のイントロンＡ、ＳＶ４０由来でない複製起点、カ
ナマイシン耐性遺伝子および免疫刺激配列を有する発現
ベクター中に含んで成る組み換えＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、日本脳炎ウイルス
遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む発現用組み換えＤＮ
Ａおよびそれを用いたワクチンに関する。より詳細には
本発明は、ヒトに投与するのに適した、日本脳炎ウイル
ス遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む発現用組み換えＤ
ＮＡおよびそれを用いたワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】フラビウイルス属に属する日本脳炎ウイ
ルスは、ヒト及びウマの中枢神経系での感染を引き起こ
し、ブタで死産を引き起こす（Shope, R. E. (R. W. Sc
hlesinger, ed. 1980) pp.47-82. Academic Press, New
York；およびMonath, T. P. (S. Schlesinger, et al
eds. 1986) pp.375-440. Plenum, New York）。日本脳
炎ウイルスはトリおよび蚊の間で共通伝播サイクルを有
する。その際、ブタは中間増幅体の役割を担い、ブタか
ら蚊に伝播し、蚊からヒトへとウイルスは拡散する（Sc
herer, W. F., et al (1959) Am. J. Trop. Med. Hyg.
8, 698-706；Konno, J., et al (1966) Am. J. Epidemi
ol 84, 292-300；およびOya, A (1967) Jpn. J. Med. S
ci. Biol. Suppl. 20, 26-30）。従って、ブタにワクチ
ン接種することによりブタの感染を防止し、ヒトにおけ
る日本脳炎の流行を防止できる可能性がある（Igarash
i, A. (E. Kurstak. ed., 1992), 2nd ed., pp.309-34
2. Marcel Dekker, New York）。

【０００３】現在使用されているブタ用日本脳炎ワクチ
ンは、弱毒化または不活化ウイルスから成るものである
が（Fujisaki, Y., et al (1975), Natl. Inst. Anim.
Health Q. Tokyo. 15, 15-23；Inoue, Y. K. (1975) Pr
og. Med. Virol. 19, 247-256;Kurata, K. (1980a) J.
Vet Med. Sci. 33, 85-87;Yoshida, I., et al (1981)
Biken J. 24, 47-67；およびYamagishi, A. (1989) J.
Vet. Med. 820, 14-18）、これらの産物を製造および使
用するには安全性および費用の問題がある。最近、分子
生物学を使用してあるウイルス疾患用の実験ワクチンが
開発され、既存のワクチンの欠点の幾つかは解消される
ようになった。ＤＮＡワクチンはウイルスゲノムの一部
のみをコードする安価な産物の送達に基づくシステムで
あり、従来のワクチンよりコスト面および安全面で優れ
ている（Manickan, E., et al (1997) Crit. Rev. Immu
nol. 17, 139-154）。

【０００４】また、ヒト用日本脳炎ワクチンとしては現
在以下の３種類のワクチンが使用されている。第１のワ
クチンは、日本脳炎ウイルスの中山株又は北京-1株に感
染したマウスの脳から調製したホルマリン不活化ウイル
ス調製物であり、第２のワクチンは日本脳炎ウイルスの
Ｐ３株に感染した初代ハムスター腎臓細胞の培養液から
調製したホルマリン不活化ウイルス調製物であり、第３
のワクチンは、日本脳炎ウイルスのＳＡ１４−１４−２
株に感染した初代ハムスター腎臓細胞から調製した生弱
毒化ウイルスである。

【０００５】マウス脳に由来するワクチンは、日本、韓
国、台湾を含む多くのアジア各国で使用されており、日
本脳炎の感染防止に効果を発揮しているものの、ワクチ
ンの製造及び使用においてコストが高くまた副作用など
の安全性の問題がある。組織培養物に由来するホルマリ
ン不活化ワクチンは、中国で主要な日本脳炎ワクチンと
して長年使用されてきた。マウス脳に由来するワクチン
と比較した場合、組織培養に由来する不活化ワクチンは
精製処理およびコストの点で有利である。しかし、初代
ハムスター腎臓細胞を使用するために国際的には承認さ
れておらず、他の組織培養細胞を使用した不活化日本脳
炎ワクチンの開発が進行中である。

【０００６】生弱毒化日本脳炎ワクチン（ＳＡ１４−１
４−２ワクチン）は、初代ハムスター腎臓細胞での反復
継代及びプラーク精製によって野生型株ＳＡ１４から誘
導されるものである。ＳＡ１４−１４−２ワクチンの製
造コストはマウス脳に由来するワクチンよりはるかに安
く、組織培養に由来する不活化ワクチンよりわずかに安
い。しかし、生弱毒化ワクチンは若い動物で使用した場
合、発育を阻害する可能性があるという問題があった。

【０００７】フラビウイルス疾患に対する第二世代ワク
チンの開発のために、本発明者らは日本脳炎（ＪＥ）ウ
イルのス前駆膜（ｐｒＭ）のシグナル配列、ｐｒＭおよ
び全長Ｅタンパク質をコードする遺伝子カセットをこれ
までに使用してきた。ＪＥウイルスのシグナル−ｐｒＭ
−Ｅカセットを組み込んだ組み換えポックスウイルス
は、細胞に感染した場合にウイルス様粒子を発現させ、
マウスに接種した場合に中和抗体および防御免疫を誘導
した（Mason, P. W., et al (1991) Virology 180, 294
-305；Konishi, E., et al (1991) Virology 185, 401-
410；Konishi, E., et al (1992) Virology 190, 454-4
58；およびKonishi, E., et al (1994) Vaccine 12, 63
3-638）。細胞にウイルス様粒子を産生させ、マウスに
中和抗体を誘導するシグナル−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子カセッ
トの能力は、他の株の日本脳炎ウイルス（Sato, T., et
al (1993) Virology 192, 483-490）および他のフラビ
ウイルス（Pincus, S., et al (1992) Virology 187, 2
90-297；Yamshchikov, V. F., et al (1993) Virology
192, 38-51；Fonseca, B. A. L., et al (1994), Vacci
ne 12, 279-285；およびAllison, S. L., et al (199
5), J.Virol. 69, 5816-5820）でも報告されている。日
本脳炎ウイルスのシグナル−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子カセット
はブタおよびヒトにおいて中和抗体を誘導することが報
告されている（Konishi, E., et al (1992) Virology 1
90, 454-458；およびKonishi, E., et al(1998) Vaccin
e 16, 842-849）。さらに、本発明者らはこれまでに、
メモリー細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がこの遺伝子
カセットによりマウスおよびヒトにおいて誘導されるこ
とを証明した（Konishi, E., et al (1997) Virology 2
27,353-360；およびKonishi, E., et al (1998) Vaccin
e 16, 842-849）。

【０００８】本発明者らはさらに、日本脳炎ウイルスの
シグナル−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子カセットを含有しｐｃＤＮ
Ａ−３をベクターとして使用するＤＮＡワクチン（ｐｃ
ＪＥＭＥと命名される）を開発し、ｐｃＪＥＭＥがマウ
スにおいて中和抗体、メモリーＣＴＬおよび防御免疫を
誘導する能力を実証した（Konishi, E., et al (1998b)
J. Virol. 72, 4925-4930）。他のＤＮＡワクチンによ
るフラビウイルスに対する防御免疫の誘導は日本脳炎ウ
イルスの非構造蛋白（ＮＳ）１遺伝子（Lin, Y. L., et
al (1998) J. Virol. 72, 191-200）、デング２型ウイ
ルス（Kochel,T., et al (1997) Vaccine 15, 547-55
2；およびPorter, K. R., et al (1998)Arch Virol. 14
3, 997-1003）、およびセントルイス脳炎ウイルス（Phi
llpotts,R. J., et al (1996) Arch Virol. 141, 743-7
49）およびダニ脳炎ウイルス（Schmaljohn, C., et al
(1997) J. Virol. 71, 9563-9569）のシグナル、ｐｒＭ
および全長Ｅ遺伝子を使用して報告されている。

【０００９】ｐｃＪＥＭＥは有効な日本脳炎ＤＮＡワク
チンの候補であるが、このベクターを用いたプラスミド
を屋外で使用する場合には幾つかの問題がある。例え
ば、このプラスミドは細菌選択用のアンピシリン耐性遺
伝子を含んでいるので、接種された動物の病原性細菌に
取込まれ、自然界にアンピシリン耐性細菌を生じる可能
性があった。また、このプラスミドはヒトの組織培養細
胞を形質転換する癌ウイルスであるＳＶ４０に由来する
配列を含むために癌原性を有するという問題があった
（Noonan, C. A., et al (1978) Natl. Cancer. Inst.
Monogr. 48, 227-237）。

【００１０】ヒト用のＤＮＡワクチンとしては、以下の
要件を満たすものが好ましいことが提唱されている（Ha
rtikka, J., et al (1996), Hum. Gene. Ther. 7, 1205
-1217；およびDoolan, D. L., et al (1997), Indian
J. Med. Res. 106, 109-119）：（１）トランスフォー
ムした細菌の選択にはカナマイシン耐性遺伝子を使用す
る；（２）発現量を高めるためにサイトメガロウイルス
由来のイントロンＡを付加する；（３）ＳＶ４０由来の
遺伝子を除く；および（４）免疫刺激配列（immunostim
ulatory sequence）を付加する。しかしながら、これ
ら条件を満たすヒト用の日本脳炎ＤＮＡワクチンは未だ
開発されていない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明はヒトで使用するのに適した日本脳炎
ウイルス遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクタ
ーおよびそれを用いたワクチンを提供することを解決す
べき課題とした。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、ある特定の発現ベク
ターに日本脳炎ウイルスのシグナル−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子
カセットを組み込んで作製した発現プラスミドをマウス
およびブタに接種し、免疫応答を評価した結果、この発
現プラスミドが所望の免疫原性を有することを見出し、
本発明を完成するに至った。

【００１３】即ち、本発明によれば、日本脳炎ウイルス
の前駆膜（ｐｒＭ）シグナル配列、前駆膜（ｐｒＭ）遺
伝子および外被膜（Ｅ）遺伝子を、プロモーター、サイ
トメガロウイルス由来のイントロンＡ、ＳＶ４０由来で
ない複製起点、カナマイシン耐性遺伝子および免疫刺激
配列を有する発現ベクター中に含んで成る組み換えＤＮ
Ａが提供される。好ましくは、発現ベクターのプロモー
ターはサイトメガロウイルス由来のプロモーターであ
る。好ましくは、免疫刺激配列は欠失変異アンピシリン
耐性遺伝子である。

【００１４】好ましくは、発現ベクターは、（１）配列
番号１に記載の塩基配列；または（２）配列番号１に記
載の塩基配列において１から数個の塩基が置換、欠失、
付加および／または挿入された塩基配列であって、該塩
基配列中に日本脳炎ウイルスの前駆膜（ｐｒＭ）シグナ
ル配列、前駆膜（ｐｒＭ）遺伝子および外被膜（Ｅ）遺
伝子を組み込んだ組み換えＤＮＡをヒトを含む哺乳動物
に投与した場合に日本脳炎に対する防御免疫を誘導しう
る塩基配列；の何れかを有する発現ベクターである。好
ましくは、本発明の組み換えＤＮＡは、（１）配列番号
３に記載の塩基配列；または（２）配列番号３に記載の
塩基配列において１から数個の塩基が置換、欠失、付加
および／または挿入された塩基配列であって、ヒトを含
む哺乳動物に投与した場合に日本脳炎に対する防御免疫
を誘導しうる塩基配列；の何れかを有する。

【００１５】本発明の別の側面によれば、本発明の組み
換えＤＮＡを含む日本脳炎ＤＮＡワクチンが提供され
る。本発明の日本脳炎ＤＮＡワクチンは、好ましくはブ
タ、ヒト又はウマに用いられる。本発明のさらに別の側
面によれば、本発明のワクチンの有効量をヒトを除く哺
乳動物に接種することを含む、該哺乳動物を免疫する方
法が提供される。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施方法について
詳細に説明する。本発明の組み換えＤＮＡは、日本脳炎
ウイルスの前駆膜（ｐｒＭ）シグナル配列、前駆膜（ｐ
ｒＭ）遺伝子および外被膜（Ｅ）遺伝子を、プロモータ
ー、サイトメガロウイルス由来のイントロンＡ、ＳＶ４
０由来でない複製起点、カナマイシン耐性遺伝子および
免疫刺激配列を有する発現ベクター中に含んで成ること
を特徴とする。日本脳炎ウイルスとは、日本脳炎の病原
体であり、コダカアカイエ蚊に媒介されてブタからヒト
に感染するウイルスである。日本脳炎ウイルスのゲノム
の構造を図１に示す。本発明では、日本脳炎ウイルスの
前駆膜（ｐｒＭ）シグナル配列、前駆膜（ｐｒＭ）遺伝
子および外被膜（Ｅ）遺伝子を使用する。これらの配列
および遺伝子の取得方法については、E.Konishi他、Jou
nal of Virology, 1998,Vol.72,No.6, p.4925-4930な
どに記載されている。本発明の組み換えＤＮＡは、E.Ko
nishi他、Jounal of Virology, 1998,Vol.72,No.6, p.
4925-4930においてｐｃＤＮＡ３ＪＥＭＥと命名されて
いるプラスミドから前駆膜（ｐｒＭ）シグナル配列、前
駆膜（ｐｒＭ）遺伝子および外被膜（Ｅ）遺伝子を含む
遺伝子カセットを制限酵素処理により切り出し、以下に
説明する発現ベクターのクローニングサイトに挿入する
ことによって構築することができる。

【００１７】本発明で用いる発現ベクターには少なくと
も、プロモーター、サイトメガロウイルス由来のイント
ロンＡ、ＳＶ４０由来でない複製起点、カナマイシン耐
性遺伝子および免疫刺激配列が含まれる。本発明で用い
る発現ベクターは好ましくは、ワクチンとしてヒトに投
与するのに適したものである。プロモーターとしては、
好ましくは構成性プロモーターが挙げられ、具体例とし
ては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、
ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、あるいは単純ヘル
ペスウイルス（ＨＳＶ）由来のプロモーターなどのウイ
ルス由来の強力なプロモーターが挙げられる。

【００１８】サイトメガロウイルス由来のイントロンＡ
は、発現量を高める目的で導入される配列である。複製
起点としては、ＳＶ４０由来でない複製起点が使用され
る。ＳＶ４０由来の配列は癌原性を有する可能性がある
ので本発明では使用されない。ＳＶ４０由来以外であれ
ば複製起点の種類は特に限定されず、例えば、ウイル
ス、細菌などの原核細胞、酵母または動物細胞などの真
核細胞由来の複製起点が挙げられる。カナマイシン耐性
遺伝子の種類も特には限定されない。本発明で用いる発
現ベクターはまた免疫刺激配列を含む。免疫刺激配列の
具体例としては、欠失変異アンピシリン耐性遺伝子、Ｃ
ｐＧモチーフ等が挙げられる。本発明で用いる発現ベク
ターには、上記の他、エンハンサー配列などが含まれて
いてもよく、また日本脳炎ウイルス由来の遺伝子をクロ
ーニングするためのクローニング部位を有することが好
ましい。

【００１９】本発明で用いることができる発現ベクター
の好ましい具体例としては、（１）配列番号１に記載の
塩基配列；または（２）配列番号１に記載の塩基配列に
おいて１から数個の塩基が置換、欠失、付加および／ま
たは挿入された塩基配列であって、該塩基配列中に日本
脳炎ウイルスの前駆膜（ｐｒＭ）シグナル配列、前駆膜
（ｐｒＭ）遺伝子および外被膜（Ｅ）遺伝子を組み込ん
だ組み換えＤＮＡをヒトを含む哺乳動物に投与した場合
に日本脳炎に対する防御免疫を誘導しうる塩基配列；を
有する発現ベクターが挙げられる。

【００２０】上記において、「塩基配列において１から
数個の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入され
た塩基配列」とは、該塩基配列において、例えば１〜２
０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０
個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠
失、置換、付加および／または挿入された塩基配列を意
味する。配列番号１に記載の塩基配列に対して変異を導
入するための方法としては、化学合成、遺伝子工学的手
法、突然変異誘発などの当分野で既知の任意の方法を用
いることができる。例えば、配列番号１の塩基配列を有
する組み換えＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作
用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手
法等を用いて行うことができる。部位特異的変異誘発法
は特定の位置に特定の変異を導入したい場合に有用であ
る。また、ＰＣＲ法を応用して変異を導入することもで
きる。その他、有機合成法や酵素合成法によっても所望
の変異体を得ることができる。

【００２１】本発明の組み換えＤＮＡの好ましい具体例
としては、（１）配列番号３に記載の塩基配列；または
（２）配列番号３に記載の塩基配列において１から数個
の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入された塩
基配列であって、ヒトを含む哺乳動物に投与した場合に
日本脳炎に対する防御免疫を誘導しうる塩基配列；の何
れかを有する組み換えＤＮＡが挙げられる。上記におい
て、「塩基配列において１から数個の塩基が置換、欠
失、付加および／または挿入された塩基配列」とは、該
塩基配列において、例えば１〜２０個、好ましくは１〜
１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは
１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換、付加および／
または挿入された塩基配列を意味する。配列番号３に記
載の塩基配列に対して変異を導入するための方法は、配
列番号１に記載の塩基配列について記載した場合と同様
である。

【００２２】本発明はまた、上記した本発明の組み換え
ＤＮＡを含む、日本脳炎ワクチンを提供する。本明細書
において、「ワクチン」という用語は免疫応答を生じ得
る物質を意味する。本明細書において、「日本脳炎ワク
チン」という用語は、日本脳炎ウイルス感染予防ワクチ
ン、日本脳炎ウイルス感染による日本脳炎発症の予防ワ
クチン、並びに日本脳炎の治療ワクチンを含む広い意味
で用いられる。

【００２３】本発明のワクチンはヒトまたはブタなどの
哺乳動物に投与され、投与を受けた動物には日本脳炎に
対する免疫が生じる。本発明の組み換えＤＮＡによって
コードされる日本脳炎ウイルスの蛋白質が生体内で合成
され、これが抗原となって細胞傷害性Ｔ細胞が活性化さ
れて細胞性免疫が喚起される。さらにＢ細胞は抗体産生
細胞へと分化し、体液性免疫も喚起される。このような
機構により、日本脳炎に対する免疫が生じることにな
る。細胞性免疫が喚起されることは日本脳炎の発症や進
行の抑制にも有用であることから、本発明の日本脳炎Ｄ
ＮＡワクチンを用いる免疫は、日本脳炎の予防のみでな
く治療にも役立つものである。

【００２４】本発明のワクチンは、例えば、薬学的に許
容可能な担体（トランスフェクション試薬など）または
アジュバンドと一緒に配合して医薬組成物の形態で提供
することができる。

【００２５】本発明で用いることができる薬学的に許容
可能な担体とは、生体の細胞中にＤＮＡワクチンをトラ
ンスフェクションするのに適したものである。このよう
な薬学的に許容可能な担体の具体例としては、リポソー
ム、金粒子、カチオン性ポリマーなどの公知のトランス
フェクション試薬が挙げられる。当業者はこのようなト
ランスフェクション試薬を用いて、本発明で用いるＤＮ
Ａを適宜処方することができる。

【００２６】医薬組成物を調製するために用いることが
できる免疫用アジュバントは当技術分野で周知である。
当業者は、医薬組成物を形成するための適切なアジュバ
ントを適宜選択することができる。本発明で用いること
ができるアジュバントの具体例としては、ＣｐＧアジュ
バント(Krieg A. 他、Nature 374, 546-549 (1995))な
どが挙げられる。本発明のワクチンは、カプセル剤、懸
濁液、エリキシル剤又は溶液のような任意の投与形態で
用いることができる。

【００２７】単回投与量のワクチンＤＮＡを含む医薬組
成物を調製するために担体物質と組み合わせるべきワク
チンＤＮＡの量は、一般的には、投与経路および投与方
法、用いる塩基配列および発現ベクターの種類、発現さ
れる抗原タンパク質あるいはペプチドの安定性および活
性（免疫原性）、被験者の性別、年齢、体重、全体的な
健康状態、予防または治療の対象となる日本脳炎のタイ
プ等を含む多くの要因に依存する。投与すべきＤＮＡの
量はまた、薬学的に許容可能な担体（トランスフェクシ
ョン試薬）およびアジュバンドの種類および量にも依存
する。

【００２８】本発明のワクチンをヒト、ブタ又はウマな
どの哺乳動物に投与する場合、日本脳炎の予防または治
療に有効な量で投与されるが、一般的には、１μｇ〜２
０００μｇを筋肉あるいは皮膚に直接投与する。遺伝子
銃を使用して本発明のワクチンを投与することもでき
る。皮下注入、皮内導入、経皮圧入及び他の投与法、例
えば、腹腔内、静脈内又は吸入投与、経口投与も可能で
あり、投与経路は特に限定されない。また、追加免疫接
種を行うことも可能である。以下の実施例により本発明
をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限
定されることはない。

【００２９】

【実施例】材料および方法 （１）プラスミド 日本脳炎（ＪＥ）ウイルス（中山株）のｐｒＭのシグナ
ル配列、ｐｒＭおよびＥ遺伝子を含みｐｃＤＮＡ３をベ
クターとしたプラスミドであるｐｃＪＥＭＥの構築は既
報の通りである（Konishi, E., et al (1998) J. Viro
l. 72, 4925-4930）（図５〜７および配列番号２に塩基
配列を示す）。ｐＮＧＶＬ４ａベクターはミシガン大学
のナショナル・ジーン・ベクター・ラボラトリーから供
給された(図２に構造を示し、図３と図４および配列番
号１に塩基配列を示す)。ｐＮＪＥＭＥの構築のため
に、ＪＥウイルスのシグナル−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子カセッ
トをｐｃＪＥＭＥからｐＮＧＶＬ４ａベクターにEcoRI
およびXbaI部位を用いてクローニングしてｐＮＪＥＭＥ
（図８〜１０および配列番号３に塩基配列を示す）を構
築した。ｐＮＪＥＭＥ中の遺伝子カセットのインサート
が適切かどうかはＤＮＡ配列決定装置（ＡＢＩ３７３
Ａ、Applied Biosystems社）を用いてEcoRIおよびXbaI
部位付近の配列を決定することにより確認した。プラス
ミドＤＮＡは全て（ｐｃＪＥＭＥ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＮ
ＪＥＭＥ、ｐＮＧＶＬ４ａ）Qiagen PlasmidKit（Funak
oshi社）を用いてその取扱説明書に従って精製し、マウ
スおよびブタを免疫するために使用した。

【００３０】（２）不活化ワクチン ホルマリンで不活化したマウス脳由来のヒト用ＪＥワク
チン（ＪＥＶＡＸ−Ｈ；Institute for Microbial Dise
ases of Osaka University）および動物用ＪＥワクチン
（ＪＥＶＡＸ−Ａ；Institute of Chemical and Serum
Therapy）を本実験で選択した。これらのワクチンの製
造のために中山株が使用されているためである。これら
のワクチンは供給業者の取扱説明書に従って使用した。
マウスを免疫するためには、１００μｌのＪＥＶＡＸ−
Ｈをマウス１頭当たり使用し、これはヒトを免疫するた
めの投与量の１／１０に相当する。ブタを免疫するため
には、１ｍｌのＪＥＶＡＸ−Ａをブタ１頭当たり使用
し、これはブタを免疫するための１回分の投与量に相当
する。ブタに記憶Ｂ細胞が誘導されるかどうかを調べる
ためには、２ｍｌのＪＥＶＡＸ−Ａをブタ１頭当たり使
用した。

【００３１】（３）トランスフェクションおよび免疫化
学的染色 ＣＨＯ−Ｋ１細胞に０．５μｇのｐｃＪＥＭＥまたはｐ
ＮＪＥＭＥをリポポリアミン（Transfectam、Biosepr
a、Villeneuve-ia-Garanne、フランス）を用いてその取
扱説明書に従ってトランスフェクションした。トランス
フェクション後、細胞を１０％胎児ウシ血清を含む培地
中で３７℃で２４時間インキュベートし、冷エタノール
で固定した。細胞を正常ウマ血清を１％含むリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）で水和し、ｐｒＭに対するモノク
ローナル抗体（Ｊ２−２Ｆ１；Walter Reed Army Insti
tute of ResearchのMary K.Gentry博士により供与、ワ
シントンＤＣ）またはＥに対するモノクローナル抗体
（Ｊ３−１１Ｂ９；Mason, P.W. (1989) Virology 169,
354-364）でインキュベートした。次いで、抗原抗体反
応をビオチン化抗マウスＩｇＧ、ＡＢＣ試薬、およびＶ
ＩＰ基質（Vector Laboratories社）により検出した。
０．５μｇのｐｃＤＮＡ３またはｐＮＧＶＬ４ａをトラ
ンスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞をコントロール
として使用した。

【００３２】（４）マウス実験 各群が６頭の６週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスから成る４
群に、１００μｇのｐＮＪＥＭＥ、ｐｃＪＥＭＥ、また
はｐＮＧＶＬ４ａ、または１／１０投与量のＪＥＶＡＸ
−Ｈを２週間の間隔で２回（年齢６週と８週で）接種し
た。プラスミドは各部位につきＰＢＳ中で５０μｌの容
量に希釈したものを使用し、両方の大腿に筋肉内注入に
より接種した。不活化ワクチンは１００μｌの容量で腹
膜内に接種した。第２回目の免疫の２週間後（年齢１０
週目）、これらのマウスから採血し、血清試料を血液か
ら単離し、プールし、中和抗体の誘導を評価するために
使用した。採血の１週間後（年齢１１週目）、これら６
頭のマウスにＪＥウイルスのBeijingＰ３株（Mason, P.
W., et al (1991) Virology 180, 294-305）を５０，
０００ＬＤ₅₀の投与量で腹膜内注入により投与し、３週
間観察した。

【００３３】（５）ブタ実験 １３〜１４ｋｇの体重を有する５頭の８〜１２週齢のブ
タ（ヨークシャー種の去勢した雄と雌）の５群に、１０
０μｇまたは４５０μｇのｐｃＪＥＭＥ、または４５０
μｇのｐＮＪＥＭＥを０日目と２１日目に２回、あるい
は１投与量のＪＥＶＡＸ−Ａを０日目と１４日目の２回
接種した。ＰＢＳで希釈したプラスミドＤＮＡは、１ｍ
ｌの容量で首の１部位に筋肉内注入するか、または耳の
根元の２カ所に各部位につき２００μｌの容量で皮内投
与した。ＪＥＶＡＸ−Ａを首の上に１ｍｌの容量で皮下
接種した。これら免疫原の注入のためには、初回接種
は、動物の右側を使用し、２回目の免疫のためには左側
を使用した。これらのブタは初回接種の１６日前、そし
て初回接種後１２週間に渡って毎週採血した。血清試料
を血液から単離し、プールし、中和抗体および／または
赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）抗体について試験した。４週
目と７週目に採取した血清については個体別に試験し
た。ブタは全てワクチン接種による臨床上の副作用につ
いて監視した。記憶Ｂ細胞の誘導を調べる実験は、ｐＮ
ＪＥＭＥまたはＪＥＶＡＸ−Ａで免疫した各群５頭のブ
タから成る２群を用いて１１６日目に行った。各群の５
頭のブタのうちの３頭に２ｍｌのＪＥＶＡＸ−Ａを皮下
接種により投与し、残りの２頭に２ｍｌの生理食塩水を
投与した。３頭のウイルスを投与したブタから１１６日
目（ウイルス投与の直前）と、投与後２、４および８日
目（１１８日目、１２０日目および１２４日目）に採血
した。２頭の生理食塩水を投与したブタは１１６日目と
１２４日目に採血した。これら試料の全てからの血清を
各々、ＨＡＩ抗体について試験した。抗体の持続期間を
試験するために、ｐＮＪＥＭＥ−またはＪＥＶＡＸ−Ａ
で免疫した群の各々からの２頭のブタ（これらには１１
６日目に生理食塩水を投与した）からの血清を周期的に
監視した。

【００３４】（６）血清学的試験 免疫したマウスまたはブタに誘発された中和抗体につい
て既報の通り（Konishi, E., et al (1999) J. Virol,
73, 5527-5534）、ＪＥウイルスの中山株を用いて抗体
価を測定した。中和抗体価は、プラーク数の９０％減少
を生じさせる最大の血清希釈率で表した。ＨＡＩ試験は
既報の通り行った（Mason, P. W., et al (1991) Virol
ogy 180, 294-305）が、抗原については診断用の市販の
ＪＥウイルス抗原（武田製薬株式会社）を使用した。

【００３５】結果 （１）ワクチンプラスミドのインビトロ発現 ｐｃＪＥＭＥでトランスフェクションしたＶｅｒｏおよ
びＣＯＳ７細胞が日本脳炎（ＪＥ）ウイルスＥ抗原を発
現することは既に報告されている（Konishi, E., et al
(1998) J. Virol. 72, 4925-4930）。今回、ｐｃＪＥ
ＭＥまたはｐＮＪＥＭＥによるｐｒＭおよびＥの両方の
発現をＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて測定した。トランスフ
ェクションの２４時間後に、ｐｒＭおよびＥ抗原は約５
〜１０％の細胞で検出された。ｐｃＪＥＭＥでトランス
フェクションした細胞の染色強度は、顕微鏡で判定した
場合でｐＮＪＥＭＥでトランスフェクトした細胞の染色
強度と大体同一であった。ｐｃＤＮＡ３またはｐＮＧＶ
Ｌ４ａでトランスフェクションしたコントロールＣＨＯ
−Ｋ１細胞は染色されなかった。これらの結果は、ｐｃ
ＪＥＭＥのインビトロ発現に関する以前のデータ（Koni
shi, E., et al (1998) J. Virol. 72, 4925-4930）と
一致し、ｐＮＪＥＭＥがｐｒＭおよびＥ抗原を真核細胞
中で発現することを示している。

【００３６】（２）マウスにおけるｐＮＪＥＭＥの免疫
原性 ｐＮＪＥＭＥの免疫原性をマウスで評価した。表１に、
１００μｇのｐＮＪＥＭＥ、ｐｃＪＥＭＥ、またはｐＮ
ＧＶＬ４ａベクター、または１／１０投与量の市販のヒ
ト用ＪＥワクチン（ＪＥＶＡＸ−Ｈ）で２回免疫したマ
ウスを用いた実験の結果を示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】ｐＮＪＥＭＥで免疫したマウスは、追加免
疫の２週間後に１：１０の中和抗体価を生じた。コント
ロールでは、ｐｃＪＥＭＥまたはＪＥＶＡＸ−Ｈで免疫
したマウスは同等の抗体価（１：１０）を生じたが、ｐ
ＮＧＶＬ４ａで免疫したマウスでは中和抗体は検出され
なかった。ＪＥウイルスのＰ３株の致死量を投与した後
において、ｐＮＪＥＭＥで免疫したマウスは６頭のうち
５頭が２１日間生存した（表１）。同様の生存率がｐｃ
ＪＥＭＥまたはＪＥＶＡＸ−Ｈで免疫したマウスで得ら
れたが、ｐＮＧＶＬ４ａを接種したマウスは全て攻撃に
より死亡した。これらの結果は、ｐＮＪＥＭＥによる免
疫はマウスにおいて中和抗体と防御免疫を誘導すること
を示す。ｐｃＪＥＭＥによる中和抗体および防御免疫の
誘導は既に報告されている（Konishi, E., et al (199
8) J. Virol. 72, 4925-4930）。

【００３９】（３）ブタにおける中和抗体およびＨＡＩ
抗体の誘導 各群５頭のブタから成る５群に、ｐＮＪＥＭＥ、ｐｃＪ
ＥＭＥ、または市販の動物用ＪＥワクチン（ＪＥＶＡＸ
−Ａ）を２回接種し、初回接種後１２週間まで毎週採血
した。中和抗体価およびＨＡＩ抗体価を各々８週目、１
週目まで評価した。プールした血清中の中和抗体および
ＨＡＩ抗体の時間経過を表２に示す。プラスミドＤＮＡ
を筋肉内または皮内接種した後、全てのブタにおいて全
身応答または局所応答は見出されなかった。

【００４０】

【表２】

【００４１】４５０μｇのｐｃＪＥＭＥの筋肉内投与に
より免疫したブタでは、初回接種後２週間目に１：１０
の中和抗体価を生じ、追加免疫後１週間目に１：８０の
抗体価を生じた（表２）。中和抗体価は２週間１：８０
に維持された後に、少しずつ減少した。１００μｇを接
種した群では、追加免疫の前に検出可能な中和抗体値は
見られず、追加免疫の１週間後に１：４０の中和抗体価
が検出された。ｐｃＪＥＭＥを１００μｇ筋肉内接種し
た後よりも４５０μｇ筋肉内接種した後の方がより高い
抗体価の誘導が得られることが、ＨＡＩ抗体抗体価の経
過中（表２）に観察された。これらの結果は、ｐｃＪＥ
ＭＥも１００μｇおよび４５０μｇの投与量でブタ中に
中和抗体およびＨＡＩ抗体を誘導できることを示し、ま
たこの範囲内でのｐｃＪＥＭＥの投与量に依存した応答
を示している。

【００４２】４５０μｇのｐｃＪＥＭＥの皮内接種によ
り誘導した抗体価の経過を、同一量のｐｃＪＥＭＥの筋
肉内接種により誘導した抗体価の経過と比較した。皮内
接種により免疫したブタは第２回目の免疫の前に検出し
うる値の中和抗体を生じず、第２回目の免疫の１週間後
に１：４０の中和抗体価を誘導した（表２）。筋肉内接
種したブタよりも皮内接種したブタの方が中和抗体価が
より低いことは、ＨＡＩ抗体（表２）で得られた結果と
一致した。これらの結果は、ｐｃＪＥＭＥを４５０μｇ
の投与量で免疫したブタにおいては筋肉内接種の方が皮
内接種よりも高い免疫原性を生じることを示している。

【００４３】４５０μｇのｐＮＪＥＭＥを筋肉内接種し
たブタは、初回接種の２週間後に１：１０の中和抗体価
を、第２回目の免疫の１週間後に１：８０の抗体価を生
じた。これは、４５０μｇのｐｃＪＥＭＥを筋肉内接種
したブタで示された中和抗体価のものと同様の時間経過
を示している（表２）。ｐｃＪＥＭＥとｐＮＪＥＭＥの
同様の免疫原性値がＨＡＩ結果（表２）でも観察され
た。これらの結果はｐＮＪＥＭＥがブタにおいて中和抗
体およびＨＡＩ抗体を誘導することを示す。ＪＥＶＡＸ
−Ａで２回ワクチン接種したブタは１２週間の実験期間
内に最大で１：１０のＨＡＩ抗体を生じたが、検出可能
な値の中和抗体は初回接種の８週間後の期間に渡りプー
ルした血清中に観察されなかった。

【００４４】（４）ｐＮＪＥＭＥで免疫したブタにおけ
る２次抗体応答 メモリーＢ細胞およびヘルパーＴ細胞を誘導するｐＮＪ
ＥＭＥの能力を試験するために、ｐＮＪＥＭＥまたはＪ
ＥＶＡＸ−Ａで２回免疫した５頭のブタから成る２群に
抗原を投与し、投与後のＨＡＩ抗体価の推移を調べた。
抗原としてＪＥＶＡＸ−Ａを各群の３頭のブタに、また
対照として生理食塩水を各群２頭のブタに投与した（表
３）。ｐＮＪＥＭＥを免疫したブタは３頭全て、抗原投
与前に１：２０のＨＡＩ抗体価を有していた。抗原投与
後、これらのブタは２日目に１：２０〜１：４０、４日
目に１：４０〜１：８０、そして８日目に１：２，５６
０のＨＡＩ抗体価を生じた。ＪＥＶＡＸ−Ａで免疫した
３頭のブタは、抗原投与前に＜１：１０〜１：１０、８
日目に１：１０〜１：８０のＨＡＩ抗体価を有してい
た。生理食塩水を投与したブタは両方の群で０日目と８
日目に同一のＨＡＩ抗体価を有していた。これらの結果
は、ｐＮＪＥＭＥがメモリーＢ細胞およびＴ細胞をブタ
中で誘導すること、そして２次抗体応答はＪＥＶＡＸ−
Ａで免疫したブタよりもｐＮＪＥＭＥで免疫したブタの
方が強いことを示している。

【００４５】

【表３】

【００４６】（５）ブタにおけるｐＮＪＥＭＥ ｐＮＪＥＭＥまたはＪＥＶＡＸ−Ａで２回免疫した２頭
のブタから成る群から初回接種後２４５日目まで定期的
に血清を採取し、ＨＡＩ抗体価を調べた（図１１）。ｐ
ＮＪＥＭＥで免疫した２頭のブタは８４日目から２４５
日目まで検出可能な値のＨＡＩ抗体を示した。ＨＡＩ抗
体価は免疫後の期間が増大するにつれて増大する傾向が
あった。対照的に、ＪＥＶＡＸ−Ａで免疫した２頭のブ
タではこの期間中に検出可能な値のＨＡＩ抗体が得られ
なかった。この結果は、ｐＮＪＥＭＥで免疫したブタは
少なくとも２４５日間は検出可能な値のＨＡＩ抗体を維
持することを示す。

【００４７】

【発明の効果】本発明により、ヒトに用いることができ
る新規な日本脳炎ＤＮＡワクチンが提供されることにな
った。本発明のワクチンは、アンピシリン耐性遺伝子を
含まないため自然界にアンピシリン耐性細菌を生じる危
険がなく、またＳＶ４０由来の遺伝子を含まないために
癌原性の問題もない。また、本発明のワクチンは哺乳動
物において中和抗体の産生を誘導し、また防御免疫を誘
導するので、日本脳炎の感染・発症の予防または治療に
有用である。

【００４８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> EIJI KONISHI et al <120> An Expression Vector Comprising an Japanese Encephalitis Virus DNA and a vaccine using the same <130> 99622H <160> 3 <210> 1 <211> 4478 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 1 tggccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca 60 acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 120 tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180 cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240 gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360 ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420 cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 480 aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 540 aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc 600 gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 660 cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 720 agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc 780 cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata ggcccacccc cttggcttct 840 tatgcatgct atactgtttt tggcttgggg tctatacacc cccgcttcct catgttatag 900 gtgatggtat agcttagcct ataggtgtgg gttattgacc attattgacc actccaacgg 960 tggagggcag tgtagtctga gcagtactcg ttgctgccgc gcgcgccacc agacataata 1020 gctgacagac taacagactg ttcctttcca tgggtctttt ctgcagtcac cgtcgtcgac 1080 ggtatcgata agcttgatat cgaattcacg tgggcccggt accgtatact ctagagcggc 1140 cgcggatcca gtctttttcc ctcgccaaaa attatgggga catcatgaag ccccttgagc 1200 atctgacttc tggctaataa aggaaattta tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt 1260 gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttaaaacatc agaatcagta 1320 tttggtttag agtttggcaa catatgccat tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 1380 cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 1440 tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 1500 aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 1560 catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 1620 caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 1680 ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 1740 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 1800 gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 1860 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 1920 ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 1980 tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 2040 tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 2100 cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 2160 tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 2220 tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 2280 tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 2340 cgttcatcca tagttgcctg actccggggg gggggggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 2400 aggtgttgct gactcatacc agggcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 2460 acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 2520 atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 2580 aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 2640 tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 2700 agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 2760 gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 2820 ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacctgaatc 2880 gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg 2940 gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga 3000 tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc 3060 gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa 3120 actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt 3180 tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg 3240 caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt 3300 tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg 3360 gtgagaatgg caaaagctta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac 3420 gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag 3480 cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc 3540 ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta 3600 atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag 3660 tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga 3720 ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg 3780 gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc 3840 gagcccattt atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgagc 3900 aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa caccccttgt attactgttt atgtaagcag 3960 acagttttat tgttcatgat gatatatttt tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt 4020 gagacacaac gtggctttcc cccccccccc attattgaag catttatcag ggttattgtc 4080 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 4140 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 4200 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 4260 aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 4320 agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac 4380 tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac 4440 agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcaga ttggctat 4478

【００４９】 <210> 2 <211> 7486 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 2 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtctctt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctcaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 900 gagctcggat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcaccatgg aaggctcaat 960 catgtggctc gcgagcttgg cagttgtcat agcctgcgca ggagccatga agttgtcaaa 1020 tttccagggg aagcttttga tgaccgtcaa caacacggac attgcagacg ttatcgtgat 1080 tcccacctca aaaggagaga acagatgttg ggtccgggca atcgacgtcg gctacatgtg 1140 tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gctcaccatg ggcaatgatc cagaggacgt 1200 ggactgttgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca cgcggaccag 1260 gcattccaag cgaagcagga gatccgtgtc ggtccaaaca catggggaga gttcactagt 1320 gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatacctca tgaaaactga 1380 gaactggatc gtaaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcgatacttg gctggatgct 1440 tggcagtaac aacggtcaac gcgtggtatt caccatcctc ctgctgttgg tcgctccggc 1500 ttacagtttc aactgtctgg gaatgggcaa tcgtgacttc atagaaggag ccagtggagc 1560 cacttgggtg gacttggtgc tagaaggaga cagctgcttg acaattatgg caaacgacaa 1620 accaacattg gacgtccgca tgatcaacat cgaagctgtc caacttgctg aggtcagaag 1680 ttactgctat catgcttcag tcactgatat ctcgacggtg gctcggtgcc ccacgactgg 1740 agaagctcac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag gcttcactga 1800 tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca catgtgcaaa 1860 attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca tcaaatacga 1920 agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ttcggaaaac catgggaatt attcagcgca 1980 agttggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt cgataaccct 2040 taaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgag ccaaggagtg gactaaacac 2100 tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ttggtccaca gggaatggtt 2160 tcatgatctc gctctccctt ggacgccccc ttcgagcaca gcgtggagaa acagagaact 2220 cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc ttgggtcaca 2280 ggaaggaggc ctccatcagg cgttggcagg agccatcgtg gtggagtact caagctcagt 2340 gaagttaaca tcaggccacc taaaatgcag gctgaaaatg gacaaactgg ctctgaaagg 2400 cacaacctat ggcatgtgca cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg cggacactgg 2460 tcacggaaca gttgtcattg aactttccta ctctgggagt gatggccctt gcaaaattcc 2520 gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtc gggcggctgg tgacagtgaa 2580 ccccttcgtc gcgacttcca gcgccaactc aaaggtgcta gtcgagatgg aacccccctt 2640 cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag attaaccacc attggcacaa 2700 ggctggaagc acgctgggca aagccttttc aacgactttg aagggagctc aaagactggc 2760 agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggttttca actccatagg 2820 gaaagccgtt caccaagtgt ttggtggtgc cttcagaaca ctcttcgggg gaatgtcttg 2880 gatcacacaa gggctaatgg gggccctact actctggatg ggcgttaacg cacgagaccg 2940 atcaattgct ttggccttct tagccacagg aggtgtgctc gtgttcttag cgaccaatgt 3000 gcatgcttaa ctcgagcatg catctagagg gccctattct atagtgtcac ctaaatgcta 3060 gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 3120 cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg 3180 aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 3240 aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct 3300 ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct 3360 gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 3420 ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 3480 gctttccccg tcaagctcta aatcggggca tccctttagg gttccgattt agtgctttac 3540 ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 3600 gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 3660 tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 3720 tggggatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 3780 aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc caggcaggca 3840 gaagtatgca aagcatgcat ctcaattact cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 3900 ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 3960 ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 4020 gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc 4080 agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt 4140 gtatatccat tttcggatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 4200 aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 4260 gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 4320 gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg 4380 cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 4440 tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 4500 catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 4560 atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 4620 cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 4680 ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc 4740 tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 4800 ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 4860 ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 4920 acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 4980 tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg 5040 agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga 5100 cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa 5160 cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 5220 taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 5280 tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt 5340 tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 5400 gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 5460 gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 5520 ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 5580 ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 5640 cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 5700 gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 5760 tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 5820 ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 5880 atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag 5940 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 6000 tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 6060 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 6120 cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 6180 tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 6240 cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 6300 cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 6360 gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 6420 gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 6480 gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 6540 ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 6600 atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 6660 agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 6720 ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 6780 tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 6840 ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 6900 caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 6960 gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 7020 atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 7080 accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 7140 aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 7200 gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 7260 tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 7320 aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgagacat 7380 ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttagt aaaataaaca 7440 aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 7486

【００５０】 <210> 3 <211> 6536 <212> DNA <213> Artificial DNA <400> 3 tggccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca 60 acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 120 tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180 cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240 gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360 ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420 cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 480 aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 540 aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc 600 gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 660 cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 720 agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc 780 cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata ggcccacccc cttggcttct 840 tatgcatgct atactgtttt tggcttgggg tctatacacc cccgcttcct catgttatag 900 gtgatggtat agcttagcct ataggtgtgg gttattgacc attattgacc actccaacgg 960 tggagggcag tgtagtctga gcagtactcg ttgctgccgc gcgcgccacc agacataata 1020 gctgacagac taacagactg ttcctttcca tgggtctttt ctgcagtcac cgtcgtcgac 1080 ggtatcgata agcttgatat cgaattcacc atggaaggct caatcatgtg gctcgcgagc 1140 ttggcagttg tcatagcctg cgcaggagcc atgaagttgt caaatttcca ggggaagctt 1200 ttgatgaccg tcaacaacac ggacattgca gacgttatcg tgattcccac ctcaaaagga 1260 gagaacagat gttgggtccg ggcaatcgac gtcggctaca tgtgtgagga cactatcacg 1320 tacgaatgtc ctaagctcac catgggcaat gatccagagg acgtggactg ttggtgtgac 1380 aaccaagaag tctacgtcca atatggacgg tgcacgcgga ccaggcattc caagcgaagc 1440 aggagatccg tgtcggtcca aacacatggg gagagttcac tagtgaataa aaaagaggct 1500 tggctggatt caacgaaagc cacacgatac ctcatgaaaa ctgagaactg gatcgtaagg 1560 aatcctggct atgctttcct ggcggcgata cttggctgga tgcttggcag taacaacggt 1620 caacgcgtgg tattcaccat cctcctgctg ttggtcgctc cggcttacag tttcaactgt 1680 ctgggaatgg gcaatcgtga cttcatagaa ggagccagtg gagccacttg ggtggacttg 1740 gtgctagaag gagacagctg cttgacaatt atggcaaacg acaaaccaac attggacgtc 1800 cgcatgatca acatcgaagc tgtccaactt gctgaggtca gaagttactg ctatcatgct 1860 tcagtcactg atatctcgac ggtggctcgg tgccccacga ctggagaagc tcacaacgag 1920 aagcgagctg atagtagcta tgtgtgcaaa caaggcttca ctgatcgtgg gtggggcaac 1980 ggatgtggac ttttcgggaa gggaagcatt gacacatgtg caaaattctc ctgcaccagt 2040 aaggcgattg ggagaacaat ccagccagaa aacatcaaat acgaagttgg catttttgtg 2100 catggaacca ccacttcgga aaaccatggg aattattcag cgcaagttgg ggcgtcccag 2160 gcggcaaagt ttacagtaac acccaatgct ccttcgataa cccttaaact tggtgactac 2220 ggagaagtca cactggactg tgagccaagg agtggactaa acactgaagc gttttacgtc 2280 atgaccgtgg ggtcaaagtc atttttggtc cacagggaat ggtttcatga tctcgctctc 2340 ccttggacgc ccccttcgag cacagcgtgg agaaacagag aactcctcat ggaatttgaa 2400 gaggcgcacg ccacaaaaca gtccgttgtt gctcttgggt cacaggaagg aggcctccat 2460 caggcgttgg caggagccat cgtggtggag tactcaagct cagtgaagtt aacatcaggc 2520 cacctaaaat gcaggctgaa aatggacaaa ctggctctga aaggcacaac ctatggcatg 2580 tgcacagaaa aattctcgtt cgcgaaaaat ccggcggaca ctggtcacgg aacagttgtc 2640 attgaacttt cctactctgg gagtgatggc ccttgcaaaa ttccgattgt ctccgttgcg 2700 agcctcaatg acatgacccc cgtcgggcgg ctggtgacag tgaacccctt cgtcgcgact 2760 tccagcgcca actcaaaggt gctagtcgag atggaacccc ccttcggaga ctcctacatc 2820 gtagttggaa ggggagacaa gcagattaac caccattggc acaaggctgg aagcacgctg 2880 ggcaaagcct tttcaacgac tttgaaggga gctcaaagac tggcagcgtt gggcgacaca 2940 gcctgggact ttggctctat tggaggggtt ttcaactcca tagggaaagc cgttcaccaa 3000 gtgtttggtg gtgccttcag aacactcttc gggggaatgt cttggatcac acaagggcta 3060 atgggggccc tactactctg gatgggcgtt aacgcacgag accgatcaat tgctttggcc 3120 ttcttagcca caggaggtgt gctcgtgttc ttagcgacca atgtgcatgc ttaactcgag 3180 catgcatcta gagcggccgc ggatccagat ctttttccct cgccaaaaat tatggggaca 3240 tcatgaagcc ccttgagcat ctgacttctg gctaataaag gaaatttatt tcattgcaat 3300 agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt 3360 aaaacatcag aatcagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgccattc ttccgcttcc 3420 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 3480 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 3540 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 3600 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 3660 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 3720 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 3780 tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 3840 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 3900 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 3960 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 4020 tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 4080 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 4140 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 4200 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 4260 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 4320 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 4380 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccggggggg gggggcgctg 4440 aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag ggcaacgttg ttgccattgc 4500 tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 4560 acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 4620 tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 4680 actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 4740 ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 4800 aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 4860 ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 4920 cactcgtgca cctgaatcgc cccatcatcc agccagaaag tgagggagcc acggttgatg 4980 agagctttgt tgtaggtgga ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg 5040 tctgcgttgt cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt tcgatttatt 5100 caacaaagcc gccgtcccgt caagtcagcg taatgctctg ccagtgttac aaccaattaa 5160 ccaattctga ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag 5220 gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga 5280 ggcagttcca taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat 5340 caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat 5400 gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt 5460 caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca 5520 ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa 5580 caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg 5640 aatcaggata ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta 5700 accatgcatc atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg 5760 tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat 5820 gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg 5880 attgcccgac attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat 5940 ttaatcgcgg cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat 6000 tactgtttat gtaagcagac agttttattg ttcatgatga tatattttta tcttgtgcaa 6060 tgtaacatca gagattttga gacacaacgt ggctttcccc ccccccccat tattgaagca 6120 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 6180 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 6240 ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt cctcgcgcgt 6300 ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt 6360 ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg 6420 tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 6480 cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcagatt ggctat 6536

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は日本脳炎ウイルスのゲノムの構造を示
す。

【図２】図２はｐＮＧＶＬ４ａベクターの遺伝子地図を
示す。

【図３】図３はｐＮＧＬＡａの塩基配列の一部を示す。

【図４】図４はｐＮＧＬＡａの塩基配列の一部を示す。

【図５】図５はｐｃＪＥＭＥの塩基配列の一部を示す。

【図６】図６はｐｃＪＥＭＥの塩基配列の一部を示す。

【図７】図７はｐｃＪＥＭＥの塩基配列の一部を示す。

【図８】図８はｐＪＥＭＥの塩基配列の一部を示す。

【図９】図９はｐＪＥＭＥの塩基配列の一部を示す。

【図１０】図１０はｐＪＥＭＥの塩基配列の一部を示
す。

【図１１】図１１は、ｐＮＪＥＭＥによりブタに誘導さ
れる免疫の持続性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 ピーター・ダブリュー・メイソン フット・アンド・マウス・ディジーズ・リ サーチ・ユニット、プラムアイランドアニ マルディジーズセンター、アグリカルチャ ルリサーチサービス、ユナイテッドステー ツディパートメント・オブ・アグリカルチ ャー、ピーオーボックス848、グリーンポ ート、ニューヨーク、11944、米国 (72)発明者 小西 英二 神戸市須磨区友が丘７−10−２ 神戸大学 医学部保健学科医療基礎学講座 (72)発明者 山岡 政興 神戸市兵庫区荒田町２−１−29 兵庫県立 衛生研究所微生物部 (72)発明者 倉根 一郎 東京都新宿区戸山１−23−１ 国立感染症 研究所ウイルス第１部 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 CA04 DA02 EA04 FA02 FA18 FA20 GA13 GA18 4B064 AG01 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4C085 AA03 BA62 BB23 CC08 DD62 EE01 GG03 GG04 GG05 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA01 DA86 EA31 EA50 FA74

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 日本脳炎ウイルスの前駆膜（ｐｒＭ）シ
   グナル配列、前駆膜（ｐｒＭ）遺伝子および外被膜
   （Ｅ）遺伝子を、プロモーター、サイトメガロウイルス
   由来のイントロンＡ、ＳＶ４０由来でない複製起点、カ
   ナマイシン耐性遺伝子および免疫刺激配列を有する発現
   ベクター中に含んで成る組み換えＤＮＡ。
2. 【請求項２】 発現ベクターのプロモーターがサイトメ
   ガロウイルス由来のプロモーターである、請求項１に記
   載の組み換えＤＮＡ。
3. 【請求項３】 免疫刺激配列が欠失変異アンピシリン耐
   性遺伝子である、請求項１または２に記載の組み換えＤ
   ＮＡ。
4. 【請求項４】 発現ベクターが、（１）配列番号１に記
   載の塩基配列；または（２）配列番号１に記載の塩基配
   列において１から数個の塩基が置換、欠失、付加および
   ／または挿入された塩基配列であって、該塩基配列中に
   日本脳炎ウイルスの前駆膜（ｐｒＭ）シグナル配列、前
   駆膜（ｐｒＭ）遺伝子および外被膜（Ｅ）遺伝子を組み
   込んだ組み換えＤＮＡをヒトを含む哺乳動物に投与した
   場合に日本脳炎に対する防御免疫を誘導しうる塩基配
   列；の何れかを有する発現ベクターである、請求項１か
   ら３の何れか１項に記載の組み換えＤＮＡ。
5. 【請求項５】 （１）配列番号３に記載の塩基配列；ま
   たは（２）配列番号３に記載の塩基配列において１から
   数個の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入され
   た塩基配列であって、ヒトを含む哺乳動物に投与した場
   合に日本脳炎に対する防御免疫を誘導しうる塩基配列；
   の何れかを有する請求項１から４の何れか１項に記載の
   組み換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１から５の何れか１項に記載の組
   み換えＤＮＡを含む日本脳炎ＤＮＡワクチン。
7. 【請求項７】 ブタ、ヒト又はウマに用いることを特徴
   とする請求項６に記載の日本脳炎ＤＮＡワクチン。
8. 【請求項８】 請求項６に記載のワクチンの有効量をヒ
   トを除く哺乳動物に接種することを含む、該哺乳動物を
   免疫する方法。