KR101744014B1

KR101744014B1 - 독감 바이러스의 제조 방법

Info

Publication number: KR101744014B1
Application number: KR1020107008659A
Authority: KR
Inventors: 캐서린 게르딜; 캐서린 모스테; 이사벨 레가스텔로이스; 미셀 부블롯; 프랑코이스-자비에르 르 그로스
Original assignee: 사노피 파스퇴르 에스에이; 메리얼 인코포레이티드
Priority date: 2007-09-26
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2017-07-04
Also published as: KR20100090241A; EP2195420A2; WO2009050390A2; AR068541A1; US20110212129A1; WO2009050390A3; EP2195420B1; FR2921387A1; US20090081255A1; TW200923093A; IL204361A; CA2700288A1; JP5537429B2; FR2921387B1; US7871807B2; RU2010116187A; JP2010539918A; RU2484136C2; BRPI0817247A2; ZA201001480B

Abstract

본 발명은 a) 독감 백신을 암탉에게 투여하고, b) 상기 백신화된 암탉의 계란을 수거하고, c) 배 발생(embryogenesis) 과정을 촉발하고, d) 독감 바이러스를 요막 강에 접종함으로써 상기 발육계란(embryonated egg)을 감염시키고, e) 상기 감염된 발육계란을 상기 바이러스의 복제를 허용하는 온도 및 습도 조건 하에서 배양하고, f) 상기 바이러스를 함유하는 요막 액을 수거함을 포함하는, 독감 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

독감 바이러스의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING FLU VIRUS}

본 발명은 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터 기원하는 달걀을 사용하여 상기 독감 바이러스를 제조하는 방법, 및 또한 상기와 같은 독감 백신 제조 방법의 용도에 관한 것이다.

독감 바이러스의 3 가지 유형(A, B 및 C)이 현재 공지되어 있으며, A형 바이러스는 동물 및 인간 질환의 원인인 반면 B형 및 C형 바이러스는 인간에게 특히 병원성이다. A형 바이러스는 상기 바이러스 외막의 주요 당단백질인 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)의 항원 구조에 따라 서브유형들로 세분된다. HA의 16 가지 서브유형(H1 내지 H16) 및 NA의 9 가지 서브유형(N1 내지 N9)이 두드러진다. 따라서 A형 바이러스의 서브유형은 상기 바이러스 외막 중에 존재하는 HA 서브유형과 NA 서브유형에 의해 한정된다. 야생 조류는 모든 A형 독감 서브유형의 보유숙주를 구성한다. A형 독감 바이러스의 몇몇 서브유형들은 가금류(H5N1 및 H9N2를 포함하여 다양한 서브유형들), 말(주로 H3N8), 돼지(주로 H1N1, H3N2 및 H1N2), 및 또한 인간(주로 H1N1 및 H3N2)을 풍토성으로 또는 유행성으로(연례 전염병) 감염시킨다. 개, 고양이 및 다른 야생 종들도 또한 때때로 몇몇 서브유형들(개에서 H3N8 및 H5N1; 고양이에서 H5N1)에 의해 감염될 수 있다.

수의학 분야에서, 양계장, 및 보다 특히 병아리, 닭, 암탉 및 수탉은 숫자 면에서 상기 독감 바이러스에 의해 감염되기 가장 쉬운 최대 집단을 나타낸다. 서브유형 H5 및 H7의 조류 독감 균주는 2 가지 병원형, 즉 낮은 경로(또는 LP) 병원형과 높은 경로(또는 HP) 병원형을 가질 수 있다. 상기 HP 균주는 조류 독감의 원인이며 특히 헤마글루티닌 절단 부위(다수의 염기성 아미노산의 존재)에서 돌연변이/삽입 후 상기 LP 균주 H5 및 H7으로부터 유래한다. 지금까지는, 조류 독감, 및 특히 H5 및 H7 서브유형에 의한 감염을 예방하기 위해서 농장에 엄격한 위생 조처 및 정기적인 통제를 강하게 권고하고 있다.

인간의 경우 해에 따라 다소 많은 전염병의 원인이 되는 계절적으로 순환하는 바이러스 균주들에 대해서 면역화가 권장된다. 현행 백신의 대부분은 발육계란을 사용하여 제조되며, 상기 계란은 3 가지 상이한 독감 바이러스 균주(2 개는 H3N2 및 H1N1 서브유형을 갖는 A형 독감 바이러스의 균주이고 하나는 B형 바이러스의 균주이다)에 의해 감염된다. 상기 바이러스의 복제에 유해할 수 있는 어떠한 간섭 현상도 방지하기 위해서 상기 독감에 대해 면역화되지 않은 암탉으로부터의 발육계란을 사용한다. 실제로 모계 항체는 상기 계란에서 시간을 보낸 후에 병아리로 옮겨지고 생애 처음 며칠 간 미생물 감염에 대해 상기 병아리를 보호하지만, 그 대신에 보호성 모계 항체가 미생물 작용제에 대해 여전히 존재하면서 상기 병아리가 상기 작용제에 대해 조기 면역화되는 경우 상기 모계 항체는 결핍성 면역의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 문헌[H. Stone et al., 1992, Avian Dis. 36:1048-1051]에는 갓 태어난 병아리에게 뉴캐슬 병 바이러스(NDV)에 대해 면역화된 암탉으로부터 기원하는 계란의 난황을 접종함으로써 상기 병아리를 상기 뉴캐슬 병에 대해 수동 면역화시킬 수 있음이 입증되어 있다. 그러나, 상기 난황의 투여에 이어서, 상기 병아리가 상기 NDV 바이러스에 면역화되는 경우, 상기 백신에 대한 면역 반응의 감소가 관찰된다. 또한 문헌[Hamal et al., 2006, Poultry Science 65:1364-1372]의 연구에 따르면, 보호성 모계 항체의 갓 태어난 병아리로의 전달, 특히 상기 NDV 바이러스 또는 감염성 기관지염 바이러스(IBV)에 대한 항체의 전달률은 30% 내지 40%이며(3일 된 병아리의 혈액 중에서 순환하는 상기 암탉의 혈장 중의 항체 량의 퍼센트), 이는 다량의 상기 모계 항체가 상기 계란 중에 격리됨을 가리킨다. 이는 문헌[J.R. Beck et al., 2003, Avian Dis. 47:1196-1199]의 연구에 의해 확인되었으며, 상기 문헌은 모두 상기 계란이 불활성화된 독감 바이러스의 균주로 암탉을 면역화시킨 지 대략 3 주 후에 항-HA 항체를 함유함을 보인다. 최종적으로, 문헌[Fontaine et al., 1963, Pathobiologie, 11/9:611-613]의 연구에 따르면, 발육계란을 항-독감 혈청으로 접종하는 경우, 상기 계란은 상기 독감 바이러스에 의한 감염에 대해 보호됨을 보인다. 모든 이러한 이유들은 당해 분야의 숙련가들로 하여금 상기 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터의 계란을 사용하는 경우 상기 계란이, 상기 독감에 대한 모계 항체의 상기 계란으로의 전달로 인해 독감 바이러스를 생산할 수 없게 된다고 생각하게 하였다.

2000년대 초 이래로, 양계장에서 조류 독감의 경제적인 여파는, 전체 양계장을 몰살하거나 또는 덜 심한 경우에 감염된 암탉이 알을 낳는 것을 멈추게 하는 고도로 전염성이고 병원성인 조류 바이러스 균주의 출현에 따라 증가를 멈추지 않았다. 상기 고도로 병원성인 바이러스 균주의 HA의 분류는 상기 균주의 거의 모두가 H5 또는 H7 서브유형을 가짐을 보인다. 현재 상기 H5 또는 H7 서브유형을 갖는 바이러스 균주가 인간에게 적응할 것이고 인간에서 실제 독감 대유행에 원인이 될 수 있음이 우려되며; 상기 서브유형들을 포함하여, 명백하게 단리된 인간 독감의 심각한 사례들이 이미 보고되었다.

계란 공급이 더 이상 상기 독감 백신의 제조에 항상 보장될 수는 없다는 위험에 직면하여, 상기 독감 백신의 신규의 제조 방법들은 현재 세포 배양 시스템의 사용을 향하고 있다.

독감 백신의 신규의 제조 방법들에도 불구하고, 어떠한 상황에서도 단기간에 매우 다량으로 상기 독감 백신 제조용 독감 바이러스를 생산할 수 있어야할 필요가 여전히 존재한다.

본 발명은 예기한 바와 달리, 사전에 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터 기원하는 계란을 사용함을 기본으로 하는 독감 바이러스의 제조 방법을 개시함으로써 상기 필요성을 충족시킨다.

본 발명의 주제는 실제로

a. 독감 백신을 암탉에게 투여하고,

b. 상기 면역화된 암탉으로부터 계란을 취하고,

c. 배 발생(embryogenesis) 과정을 촉발하고,

d. 독감 바이러스를 요막 강에 접종함으로써 상기 발육계란을 감염시키고,

e. 상기 감염된 발육계란을 상기 바이러스의 복제를 허용하는 온도 및 습도 조건 하에서 배양하고,

f. 상기 바이러스를 함유하는 요막 액을 수확함

에 따른 상기 독감 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 백신은 상기 암탉을 조류 독감에 대해 보호한다.

전형적으로, 상기 독감 백신은 그의 조성물 중에 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 형태로 독감 바이러스의 헤마글루티닌을 포함한다.

하나의 태양에 따라, 상기 독감 백신의 조성물은 불활성화된 전체 독감 바이러스를 함유한다.

또 다른 태양에 따라, 상기 독감 백신의 조성물은 전체 독감 바이러스로부터 유도된 산물을 함유한다.

더욱 또 다른 태양에 따라, 상기 백신의 조성물은 항원보강제를 또한 함유한다.

또 다른 태양에서, 상기 독감 백신의 조성물은 약독화된 독감 바이러스를 함유한다.

또 다른 방식에 따라, 상기 독감 백신은 독감 바이러스의 헤마글루티닌을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함한다.

바람직하게는, 상기 벡터는 폭스바이러스이다.

구체적인 태양에서, 상기 벡터는 또한 독감 바이러스의 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자를 포함한다.

또 다른 태양에 따라, 상기 백신의 조성물은 항원보강제를 또한 함유한다.

본 발명에 따른 방법의 하나의 실시태양에 따라, 상기 암탉에게 투여되는 상기 백신의 조성물 중에 함유된, 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 형태의 상기 독감 바이러스 헤마글루티닌, 및 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스의 헤마글루티닌은 상이한 서브유형들을 갖는다.

또 다른 실시태양에 따라, 상기 암탉에게 투여되는 상기 백신의 조성물 중에 함유된, 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 형태의 상기 독감 바이러스 헤마글루티닌, 및 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스의 헤마글루티닌은 동일한 서브유형을 갖는다.

더욱 또 다른 실시태양에 따라, 상기 암탉에게 투여되는 상기 백신의 조성물 중에 함유된, 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 형태의 상기 독감 바이러스 헤마글루티닌, 및 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스의 헤마글루티닌은 동일하다.

더욱 또 다른 실시태양에 따라, 상기 암탉에게 투여되는 상기 백신의 조성물 중에 함유된 상기 독감 바이러스는 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스와 동일하다.

특히 바람직한 실시태양에서, 상기 암탉에게 투여되는 상기 백신의 조성물 중에 함유된, 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 형태의 상기 독감 바이러스 헤마글루티닌, 및 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스의 헤마글루티닌은 H5, H6, H7 또는 H9 서브유형을 갖는다.

또 다른 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 암탉에게 투여되는 상기 백신의 조성물 중에 함유된, 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자 형태의 상기 독감 바이러스 헤마글루티닌, 및 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스의 헤마글루티닌은 H5 또는 H7 서브유형을 갖는다.

특정한 태양에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 바이러스의 정제 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 특정한 태양에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 바이러스의 불활성화 단계를 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 사용하여 수득한 독감 백신에 관한 것이다.

본 발명의 주제는 또한 상기 독감의 예방에 사용하기 위한 백신의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법의 용도이다.

특정한 태양에서, 본 발명에 따른 방법의 용도는 대유행성 인간 독감의 예방에 사용하기 위한 백신의 제조에 적합하다.

또 다른 특정한 태양에서, 본 발명에 따른 방법의 용도는 전염성 인간 독감의 예방에 사용하기 위한 백신의 제조에 적합하다.

본 발명은 또한 인간에게서 독감 바이러스의 전염성 균주 또는 독감 바이러스의 대유행성 균주에 의한 감염을 예방하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 인간에게 유효량의, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 수득한 독감 백신을 투여함을 포함한다.

더욱 또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 방법의 용도는 말과, 돼지과, 개과, 고양이과, 족제비 및 조류 종의 일원들에게서 상기 독감을 예방하는데 사용하기 위한 백신의 제조에 적합하다.

본 발명은 또한 말과, 돼지과, 개과, 고양이과, 족제비 및 조류 종의 일원들의 그룹 중에서 선택된 동물에게서 독감을 예방하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 동물에게 유효량의, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 수득한 독감 백신을 투여함을 포함한다.

본 발명의 주제는 또한 독감 바이러스의 제조를 위한, 상기 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터의 계란의 용도이다.

바람직한 태양에 따라, 상기 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터의 계란의 용도는 독감 백신의 제조를 위한 것이다.

최종적으로, 최종 태양에 따라, 상기 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터의 계란의 용도는 독감 바이러스의 생산 또는 독감 백신의 제조를 위한 것으로서, 상기 용도에 따라 상기 계란은 상기 독감 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체를 함유하고 특히 상기 계란은 H5, H6, H7 또는 H9 서브유형을 갖는 독감 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체를 함유한다.

본 발명은 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터 기원하는 달걀을 사용하여 상기 독감 바이러스를 제조하는 방법, 및 또한 상기와 같은 독감 백신 제조 방법을 제공한다.

도 1은 공여 플라스미드 pJY1394.1의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 2는 삽입 유전자 좌 F8에 인접한 팔, 및 또한 H6 우두 프로모터에 이어서 A/치킨/인도네시아/7/03 균주의 HA를 암호화하는, 절단 부위에서 변경된 합성 유전자를 포함하는 공여 플라스미드 pJY1394.1 중의 삽입물의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

"독감 바이러스"란 어구는 야생형 균주로부터 기원하는 독감 바이러스와, 하나 이상의 야생형 균주의 게놈 단편이 상기 계란에서의 강한 생육 가능성에 대해 선택된 "마스터" 균주에 의해 재편성되어 생성된 유전자재편성(reassortant) 균주로부터 기원하는 독감 바이러스 모두를 나타낸다. 상기 유전자재편성 균주는 상기 "마스터" 균주의 특성들을 획득하지만, 상기 야생형 균주의 HA 및 NA 특성 중 하나 이상은 유지하며, 이는 상기 유전자재편성 균주의 HA 및 NA의 단백질 서열과 상기 야생형 균주의 HA 및 NA의 단백질 서열 간의 일치성이, 전체 배열 프로그램에 의해 측정 시, 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 100%임을 의미한다. 상기 유전자재편성 균주를, 감수성 세포의 상기 야생형 균주 및 상기 "마스터" 균주에 의한 동시감염에 이어서 상기 목적하는 유전자재편성 균주의 선택을 위한 적합한 선택 수단에 의해 수득할 수 있다. 상기를 또한 상기 야생형 균주 및 상기 "마스터" 균주의 핵산으로부터의 역 유전학 및 다중 플라스미드 발현 시스템에서의 발현에 의해 수득할 수 있다(WO 01/83794 및 WO 03/091401, 및 문헌[Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:9345-9350(1999)]에 개시되어 있음). H5 및 H7 균주와 같은 높은 경로 균주의 경우에, 다수 개의 염기성 아미노산을 포함하는 절단 부위의 변경을 수행하여 상기 유전자재편성 균주를 낮은 경로로 만들 수도 있다.

언어의 용이성을 위해서, "백신 균주" 또는 "백신 바이러스"란 용어를 상기 독감 백신의 제조에 사용되는 독감 바이러스를 나타내는데 구별 없이 사용하며; 유사하게, "감염 균주" 또는 "감염 바이러스"란 용어는 생물학적 물질(계란, 동물)을 감염시키는데 사용되는 독감 바이러스를 나타내는데 사용된다.

더욱이, "면역화된 암탉으로부터의 계란"이란 용어는 사전에 면역화되고 수탁과 접촉한 암탉으로부터 기원하는 수정란을 나타내는데 사용된다.

일반적으로, 상기 암탉의 면역화에 사용되는 독감 백신을 독감 바이러스의 임의의 균주로부터 제조할 수 있다. 상기 백신 균주는 A형 바이러스일 수 있을 뿐만 아니라, B형 또는 C형 바이러스일 수도 있다. 상기 균주가 A형 바이러스의 균주인 경우, 상기 바이러스는 HA의 임의의 서브유형 및/또는 NA의 임의의 서브유형일 수 있다. 상기는 예를 들어 현재 전염성 인간 A형 독감의 원인일 수 있는 H1N1 또는 H3N2 서브유형을 갖는 바이러스 균주일 수 있다.

면역화가 조류 독감에 대한 보호를 부여하는 한 암탉을 독감 바이러스로 면역화시키는 것이 매우 이롭다.

조류 독감은 눈치채이지 않고 넘어가거나 또는 일련의 표시, 종종 호흡 및/또는 장 성질, 다소 큰 강도를 특징으로 할 수 있으며, 상기 강도는 상기 바이러스 균주가 매우 병원성인 경우 상기 암탉의 일반적인 상태를 다소 해치고 상기 동물을 사망케할 수 있다. 조류 독감은 흔히 산란 활성을 감소시키거나 또는 심지어 사라지게 한다. H6N2 또는 H9N2 또는 심지어 H5 또는 H7 서브유형에 속하는 낮은 경로 바이러스 균주는 흔히 온화한 형태의 조류 독감에 원인일 수 있으며, 이는 일반적으로 산란 능력을 감소시키거나 사라지게 하지만, 폐사율은 크지 않다. 다른 한편으로, H5 및 H7 서브유형(특히 H5N1, H5N2, H5N9, H7N1, H7N4 또는 H7N7)에 속하는 높은 경로 바이러스 균주는 독성이 매우 강하며 양계장에서 매우 높은 정도의 폐사율을 야기한다.

HA는 상기 독감에 대한 보호 면역화의 발생에 필수적인 항원이다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 백신은 그의 조성물 중에 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 형태로 적어도 독감 바이러스의 HA를 포함한다.

"유전자"란 용어는 개방 판독 상에 상응하고 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는데 사용된다. 발현을 위한 조절 서열(프로모터, 인헨서, 폴리아데닐화 신호, 전사 정지 등)의 통제 하에서 상기 유전자는 벡터, 특히 플라스미드 또는 바이러스의 핵산에 삽입되며, 이들 조절 서열은 대개 개방 판독 프레임(내생 서열)과 관련이 있거나 또는 상이한 기원(외래 서열)으로부터 오는 것들일 수 있다.

상기는 암탉에게는 병원성이 아닌 독감 바이러스의 인간 균주의 HA를 수반할 수도 있다. 바람직하게는, 상기는 관심 HA, 즉 조류 독감에 원인일 수 있고 상기 암탉을 면역화시키고 보호하고자 하는 대상 바이러스 균주의 HA와 동일한 서브유형을 갖는 HA를 함유한다. 바람직하게는, 상기 백신 중에 존재하는 HA의 단백질 서열과 상기 암탉을 보호하기 원하는 대상 균주의 상기 단백질 서열 간의 일치 정도는 전체 배열 프로그램(예를 들어 Blast 프로그램)에 의해 측정 시, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상이다.

통상적으로, 상기 HA를 포함하는 백신은 불활성화된 전체 독감 바이러스, 또는 상기 불활성화된 전체 독감 바이러스로부터 유래하는 생성물을 함유하는 조성물의 형태이다.

"상기 불활성화된 전체 바이러스로부터 유도된 생성물"이란 표현은 바이러스의 균주로부터 제조되고 적어도 상기 바이러스 균주의 HA를 포함하는 불활성화된(즉 비감염성인) 백신 조성물을 의미하는데 사용된다. 전체 바이러스의 균주로부터 유도된 생성물은 단편화된(또는 분할된) 바이러스일 수 있으며, 이 경우 "분할" 백신이라 언급된다. 전체 바이러스의 균주로부터 유도된 또 다른 생성물은 그 자체로서 상기 균주의 HA이거나 또는 추출 및 정제 방법을 사용하여 수득된 NA와 관련이 있으며, 이 경우 "서브유닛" 백신이라 언급된다. 상기 HA를 또한 바이로솜에 2차적으로 통합시킬 수 있다. 불활성화된 전체 독감 바이러스, 또는 불활성화된 전체 바이러스로부터 유도된 생성물을 함유하는 백신 조성물은 또한 하나 이상의 항원보강제 또는 항원보강제 제형을 함유할 수 있다. 비 제한적인 항원보강제 제형의 예로서, 유중 수적형 또는 수중 유적형 유화액, 예를 들어 MF59(등록상표) 유화액(Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 183), 리포솜 기재 제형, 및 MPL(Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 pages 1186-187), 아브리딘(Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 148), 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 157), 코리네박테리움 파르븀, 사포닌, 리소레시틴, 플루로닉 유도체(Hunter H. et al. 1991, vaccine, 9:250-256)(Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 200 and pages 297-311), 알루미늄 염 또는 이의 조합(Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 pages 249-276)을 기본으로 하는 제형을 들 수 있다. 바람직하게는, 상기 유중 수적형 유화액은 액체 파라핀, 친수성 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트 80 또는 폴리솔베이트 85 및 친지성 계면활성제, 예를 들어 솔비탄 올리에이트 또는 솔비탄 트라이올리에이트로 구성된다. 상기 암탉에 사용되는 유화액의 예들이 문헌[Stone, et al., 1983, Avian Dis., 27: 688-697; 1993; Avian Dis., 37: 399-405; 1991, Avian Dis., 35: 8-16]; [M. Brugh et al. (1983, Am. J; Vet. Res., 44: 72-75)]; [Woodward L. et al. (1985, Vaccine, 3: 137-144]; [Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 219]에 개시되어 있다. 상기 백신 균주는 일반적으로 암탉, 칠면조, 오리, 거위 또는 다른 조류 종들에서 단리된 야생형 균주로부터 기원하며, 상기 균주는 가장 통상적으로 암탉에 대해 낮은 경로이다. 암탉을 조류 독감 서브유형 H5 또는 H7에 대해 보호하기 위한 백신의 제조에 사용되는 단리물(야생형 균주)의 예로서, A/터키/위스콘신/68 또는 A/치킨/이탤리/22A/98 단리물(H5N9 서브유형을 갖는 바이러스 균주들이다), A/터키/잉글랜드/N-28/73, A/치킨/멕시코/238/94/CPA, A/치킨/멕시코/232/94/CPA 또는 A/덕/포츠담/1402/86 단리물(H5N2 서브유형을 갖는 바이러스 균주들이다), A/구스/광동/1/1996 단리물(H5N1 서브유형을 갖는 HP 바이러스 균주이다), A/치킨/이탤리/AG-473/1999 또는 A/치킨/이탤리/1067/1999 단리물(H7N1 서브유형을 갖는 바이러스 균주들이다), A/치킨/파키스탄/95 단리물(H7N3 서브유형을 갖는 HP 균주이다), 및 A/덕/포츠담/15/80 단리물(H7N7 서브유형을 갖는 바이러스 균주이다)을 들 수 있다. 가금류를 조류 독감 서브유형 H9에 대해 보호하기 위해 사용되는 H9N2 바이러스 균주의 예로서, A/치킨/이란/AV12221/98 및 A/치킨/UAE/415/99 단리물을 들 수 있다. 암탉을 조류 독감 서브유형 H6에 대해 보호하기 위해 사용되는 H6N2 바이러스 균주의 예로서, A/터키/이탤리/90 단리물을 들 수 있다. 상기 백신의 제조에 사용되는 백신 균주들은 또한 특히 역 유전학에 의해 수득된 야생형 균주의 유전자재편성물일 수 있다. 특히 "마스터" 균주 A/PR/8/34(계란에서 매우 잘 번식한다)와 H5N1 야생형 균주 A/구스/광동/1/96과의 역 재조합에 의해 수득된 유전자재편성 균주인 Re-1 백신 균주를 들 수 있다(Tian et al., 2005, Virology, 341:153-162). 역유전학에 의해 수득되는 유전자재편성 균주의 또 다른 예는 A/치킨/베트남/C58/04 H5N1 균주의 H5 헤마글루티닌, A/덕/저머니/1215/73 H2N3 균주의 뉴라미니다제 및 A/PR/8/34 "마스터" 균주의 내부 유전자를 함유하고 유전자재편성에 의해 수득되는 H5N3 균주이다(Webster et al., 2006, Virology, 351:301-311).

조류 독감에 대한 백신은 대개 단일의 불활성화된 독감 바이러스 균주의 바이러스를 함유하나(1가 백신), 몇몇 경우에, 여러 불활성화된 독감 바이러스 균주를 함유하는 다가 백신을 사용하는 것이 유리할 수도 있다. 이는 특히 불활성화된 백신 균주 A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9) 및 A/치킨/이탤리/1067/1999(H7N1)를 함유하는 유중 수적형 유화액인 H7N1 및 H5N9 균주를 기본으로 하는 백신이다. 상기 불활성화된 백신은 또한 상이한 결합가, 예를 들어 H9N2 조류 독감 및 뉴캐슬병에 대한 2가 백신을 함유할 수도 있다. 상기 불활성화된 백신을 일반적으로는 비 경구적으로(근육 내 또는 피하) 투여한다. 상기 백신을 또한 인베스티가시온 아플리카다(Investigacion Aplicada)에 의해 판매되는 에어로백(Aerovac) AI 백신(불활성화된 백신 균주 A/치킨/멕시코/232/94/CPA(H5N2)를 함유한다)의 경우에서와 같이 스프레이의 형태로 투여할 수 있다. 상기 면역화 안은 대개 2 내지 4 주 떨어져 1 회 또는 2 회 투여함을 포함한다. 상기 투여되는 백신 용량은 동물의 연령에 따라 다양하나, 대개는 불활성화 전에 10⁸ 내지 10¹⁰ EID₅₀/㎖의 역가를 갖는 요막 액 10 내지 200 ㎕의 당량을 함유한다. 상기 백신 용량을 대개는 0.05 내지 1 ㎖ 범위의 부피로 투여한다. 불활성화된 조류 독감 백신의 제조는 문헌[H. Stone, 1987, Avian Dis. 31:483-490]에 개시되어 있다. 상기 백신 균주 HA 서브유형이 병원성 조류 독감의 원인이 될 수 있는 균주의 HA의 서브유형과 동일한 한에서, 전체 배열 프로그램에 의해 측정 시, 80% 내지 90% 정도의 상기 두 HA의 단백질 서열 간의 일치도를 근거로, 조류 독감의 임상적 증상들에 대해 획득되는 보호율(이환율 및 폐사율)은 일반적으로 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과이다. 이는 문헌[M. Bublot et al., 2007, Avian Dis. 51:332-337]의 연구에 의해 확인되었으며, 상기 문헌은 상기 백신 균주 HA의 단백질 서열과 상기 병원성 감염 균주 HA의 단백질 서열 간의 80% 내지 90% 정도의 일치도가 상기 보호율의 획득에 충분함을 보인다. 더욱 또한, 상기 보호율을 획득하기 위해서 상기 백신 균주의 NA 서브유형이 상기 병원성 감염 균주의 NA의 서브유형과 동일할 필요는 없다. 더욱이, 상기 조류 독감 백신은 감염성 바이러스에 의해 시험감염시킨 면역화된 동물에서 상기 바이러스의 배설을 크게 감소시키며, 이는 구강 및 배설강 샘플에서 관찰되는 바이러스 부하의 매우 분명한 감소에 의해 입증되었다(M. Bublot et al., 2007, Avian Dis. 51:332-337). 조류 독감 백신의 또 다른 유리한 효과는 양계장에서 상기 바이러스의 확산을 감소시키는 효과이다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시태양에 따라, 상기 암탉을 면역화시키는데 사용되는 백신은 약독화된 독감 바이러스 균주를 포함하는 조성물의 형태이다. 상기 백신 균주는 일반적으로 관심 HA 및 2차적으로 관심 NA를 발현하는 야생형 균주와, 저온-적응되었고/되었거나 온도-감수성인 "마스터" 균주 간의 유전자 재편성에 이어서 선택된 유전자재편성물의 형태이다. 상기 유전자재편성물은 그의 표면에서 관심 HA 및 2차적으로 관심 NA를 발현하고 동시에 오직 좁은 온도 한계 내에서만(조류의 내부 온도 한계 이하) 복제하는 능력과 관련된 상기 "마스터" 균주의 표현형 특성을 유지하는 바이러스 균주이다. 그 결과, 상기 백신 균주는 암탉에게 투여된 후에, 제한된 방식으로 및 국소적으로 복제한다. 이러한 유전자재편성 균주를 수득하는 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며 특히 WO 03/091401 및 WO 2006/063053 및 문헌[Wareing M.D. et al., 2002, Vaccine 20: 2082-2090]에 개시되어 있다. 상기 백신의 투여를 일반적으로는 분무에 의해 수행한다. 약독화된 균주의 또 다른 생산 방법은 NS1 단백질을 암호화하는 유전자를 절두하는 것이다(Richt J.A. et al., NS1-절두된 변경된 생-바이러스 백신의 사용에 의한 돼지 독감 바이러스에 대한 돼지의 백신화, 2006, J. Virol., 80:11009-18; Quinlivan M. et al., NS1 단백질의 절두를 통한 말 독감 바이러스의 약독화, 2005, J. Virol., 79: 8431-9).

상기 백신 균주를 임의의 수단에 의해, 베로 세포, MDCK 세포, PER.C6 세포 또는 부화 계란 세포(CEK, PCJ)와 같은 세포 상에서의 배양 기법 및/또는 발육계란 상에서의 통상적인 생산 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 바이러스의 수확, 정제, 및 적합한 경우, 불활성화 방법은 또한 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시태양에 따라, 상기 백신은 시험관 내 발현 시스템에서 생성된 단백질의 형태이다. 예를 들어, 상기 HA를 곤충 세포 중의 재조합된 바큘로바이러스를 사용하는 발현 시스템에서 생성시킬 수 있다(Crawford J. et al., 바큘로바이러스-유도된 헤마글루티닌 백신은 조류 H5 및 H7 서브유형에 의한 치명적인 독감 감염에 대해 보호한다, 1999, Vaccine, 17:2265-74). 상기 헤마글루티닌을 또한 "바이러스-유사 입자"(VLP)(Prel A. et al., 머스코비 오리에서 동종 H5N3 저-병원성 조류 독감 바이러스 시험접종에 대한, H5, N3, M1 단백질을 동시발현하는 3중 바큘로바이러스 재조합체에 의해 제공된 보호의 평가, 2007, Avian Dis., 51:484-9; Pushko P. et al., H9N2 독감 바이러스의 HA, NA 및 M1 단백질로 구성된 독감 바이러스-유사 입자는 BALB/c 마우스에서 보호성 면역화 반응을 유도한다, 2005, Vaccine, 23:5751-9) 또는 레트로바이러스-계 위형(Szecsi J. et al., 2006, Virol. J., 3:70)의 형태로 시험관 내에서 발현시킬 수 있다. 시험관 내에서 생성된 단백질 또는 생성된 바이러스 입자를 다소 정제하고 이어서 다양한 항원보강제, 예를 들어 불활성화된 백신에 사용되는 것들로 항원보강시킨다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시태양에 따라, 상기 독감 백신은 상기 독감 바이러스 HA를 암호화하는 핵산 단편을 포함하는 벡터를 포함한다.

"벡터"란 용어는 유기체, 세포 또는 세포 성분 중에서 증식되고/되거나 상기 내로 전달될 수 있는 핵산 구조물을 지칭한다. 여기에는 특히 자율적으로 복제할 수 있거나 또는 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로바이러스, 파지미드 및 인공 염색체가 포함된다.

"독감 바이러스 HA를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터"란 표현은 관심 HA 및/또는 NA를 암호화하는 핵산을 포함하고, 조류 세포에 도입 후 상기 세포에서 상기 HA 및/또는 NA를 발현하는 벡터를 의미하는데 사용된다. 상기는 관심 HA를 발현하는 플라스미드일 수 있지만, 일반적으로는 그의 게놈 중에 관심 HA를 암호화하는 핵산을 함유하고 감염된 세포에서 관심 HA를 발현하는 바이러스 벡터이다. 상기 HA를 암호화하는 핵산을 상기 바이러스 벡터의 게놈에 통합시키는 것은 일반적으로 분자 생물학 기법, 특히 유전자 재조합, 클로닝, 역 유전학 등에 의해 수행된다. 상기 HA는 상기 바이러스 벡터의 표면에서 발현되거나 발현되지 않을 수도 있다. 바람직하게는, 상기 바이러스 벡터는 시험관 내에서 수회 계대배양에 의해, 또는 조류 세포에서 상기 벡터 바이러스의 복제가 충분히 제한되고 상기 암탉의 일반적인 상태에 영향을 미치지 않으며 따라서 비병원성인 것으로 간주되도록 일정 유전자의 결실에 의해 통상적으로 약독화되었다. 바이러스 벡터의 예로서, 조류 파라믹소바이러스(Ge J., et al., 뉴캐슬 병 바이러스-기재 약독화된 생백신은 동종 및 이종 H5N1 조류 독감 바이러스의 치명적인 시험접종으로부터 닭 및 마우스를 완벽하게 보호한다, 2007, J Virol., 81:150-8); 칠면조 헤르페스바이러스(HVT) 또는 마렉 병 헤르페스바이러스(Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, 11, 349-358); 감염성 후두기관염 바이러스(ILTV)(Veits J., et al., 감염성 후두기관염(ILT) 바이러스의 불필수 UL0 유전자의 결실은 닭에서 약독화를 유도하며, 독감 바이러스 헤마글루티닌(H7)을 발현하는 UL0 돌연변이체는 ILT 및 가금 페스트에 대해 보호한다, 2003, J Gen. Virol., 84:3343-52; Luschow D. et al., 헤마글루티닌(H5) 유전자를 발현하는 감염성 후두기관염 바이러스 재조합체에 의한 생 바이러스 백신화에 의한 치명적인 조류 A형 독감 바이러스 감염으로부터 닭의 보호, 2001, Vaccine, 19:4249-59); 아데노바이러스(Francois A. et al., 감염성 점액낭 병 바이러스의 VP2를 발현하는 조류 아데노바이러스 CELO 재조합체는 닭에서 점액낭 병에 대한 보호를 유도한다, 2004, Vaccine, 22:2351-60; Gao W. et al., 아데노바이러스-기재 면역화를 통한 치명적인 H5N1 조류 독감 바이러스로부터 마우스 및 가금류의 보호, 2006, J Virol., 80:1959-64; Toro H. et al., 비 복제성 인간 아데노바이러스 벡터에 의한 알 백신화에 있어서 보호성 조류 독감, 2007, Vaccine, 25:2886-91); 코로나바이러스(Cavanagh, 2007, Vet Res. 38:281-97; Eriksson, 2006, Clin. Dev. Immunol. 13:353-60)를 들 수 있으며, 바람직하게는 암탉의 면역화를 위해, 폭스바이러스, 특히 우두 바이러스, NYVAC(결실된 우두 바이러스), 우두 바이러스 MVA 균주, 특히 조류폭스, 특히 카나리아 폭스, ALVAC(약독화된 카나리아 폭스), 비둘기 폭스, 메추라기 폭스, 칠면조 폭스, 참새 폭스 및 가장 특히 계두, TROVAC(약독화된 가금폭스)를 사용할 수 있고, 이들은 특히 AU 701599B 및 AU 701781B 및 US 5,756,103에 개시되어 있다. 적합한 경우, 상기 약독화된 바이러스 벡터는 오직 관심 HA만을 발현한다, 즉 관련된 백신은 특히 H5N8 독감 바이러스 균주(A/터키/아일랜드/1378/83)의 HA를 발현하는 TROVAC 가금폭스 벡터를 함유하는 백신이다. 다른 경우에, 상기 약독화된 바이러스 벡터는 관심 NA와 함께 관심 HA를 모두 발현한다, 예를 들어 2003년에 문헌[Avian Pathology, 32:25-32]에 개시된 재조합 폭스바이러스는 H5N1 독감 바이러스 균주로부터 기원하는 HA와 NA를 모두 발현한다. 관심 NA는 대개 상기 암탉을 면역화하고 보호하고자 하는 대상 바이러스 균주의 NA와 동일한 서브유형을 갖는 NA이다. 더욱 다른 경우에, 상기 약독화된 벡터는 문헌[MingXiao M. et al., 2006, Vaccine, 24:4304-4311]에 개시된 재조합 폭스바이러스(H5 및 H7 서브유형을 모두 발현한다)의 경우에서와 같이, 상이한 서브유형에 속하는 여러 개의 관심 HA를 발현한다. 이들 벡터의 면역원성 능력은 상기 벡터 중에 면역자극 능력을 발휘하는 사이토킨 및/또는 케모카인, 예를 들어 IL-1, IFN, CSF, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-18 또는 TNF5를 암호화하는 유전자의 도입에 의해 추가로 강화될 수 있다(Vaccine, (2006), 24: 4304-4311). 상기 독감 바이러스 HA를 암호화하는 벡터를 기본으로 하는 백신을 또한 그의 면역원성의 증가를 위해 항원보강시킬 수 있다.

바이러스 벡터를 함유하는 백신 조성물을 다양한 경로(이는 특히 벡터에 따라 변한다)에 의해서, 예를 들어 익상 막(폭스바이러스 벡터)의 트랜스픽션(transfixion)에 의해서, 바늘을 사용하거나 바늘 없이 근육 내, 피하 또는 경피 경로를 통해(임의의 벡터), 알 경로를 통해(17- 내지 19-일 발육계란 중에서; 예를 들어 HVT/마렉 및 아데노바이러스 벡터), 눈 또는 구비 경로를 통해, 분무에 의해, 또는 음료수 중에서(파라믹소바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스 벡터), 15일 이상 떨어져서 1 회 또는 2 회 주입으로 투여할 수 있다. 상기 투여되는 백신 용량(들)은 1 내지 7 log₁₀ 50% 감염 단위의 정도이며, 계두 벡터의 경우 2 내지 4 log₁₀의 용량이 바람직하다. 불활성화되거나 약독화된 전체 독감 바이러스를 사용하는 통상적인 면역화에 비해 바이러스 벡터를 기본으로 하는 면역화의 이점은 상기 면역화된 동물을 감염된 동물과 구분할 수 있다는 사실에 있다. 더욱 또한, 바이러스 벡터에 의한 면역화는 동물의 보호를 강화할 수 있는 세포 면역성의 발생을 촉진한다. 문헌[Avian Dis., (2007), 51:325-331] 및 [Avian Dis., (2007), 51:498-500]에 예시되는 바와 같이, 상기 암탉에서 획득되는 보호 정도 및 양계장에서 상기 바이러스 확산의 감소가, 불활성화된 독감 바이러스를 함유하는 통상적인 백신에 의해 관찰되는 정도와 동일한 정도를 갖는다.

상기 암탉의 면역화가 수 회의 주사를 포함하는 경우, 첫 번째 투여에 사용되는 백신은 2차 주사 또는 후속 주사들에 사용되는 것과 상이할 수 있다. 2 개의 상이한 약독화된 바이러스 벡터를 사용할 수 있다, 예를 들어 ALVAC 벡터에 대한 항체 반응이 재조합 TROVAC 또는 NYVAC 벡터에 의한 상기 암탉 세포의 감염을 방해하지 않고, 결과적으로 상기 감염된 세포에서 상기 HA의 발현을 방해하지 않도록, 첫 번째 면역화에서 관심 HA를 발현하는 재조합 ALVAC 벡터 및 후속 면역화에서 동일한 관심 HA를 발현하는 재조합 TROVAC 또는 NYVAC 벡터를 사용할 수 있다. 또한 "프라임 부스트(prime boost)" 방법을 사용할 수 있으며, 상기 방법은 첫 번째 주사에서 HA를 발현하는 약독화된 바이러스 벡터를 사용하고 추가 주사(들)에서 예를 들어 상기 첫 번째 면역화에 사용된 HA와 동일한 서브유형에 속하는 하나 이상의 불활성화된 백신 균주를 함유하는 백신을 사용하는 것이거나, 또는 한편으로 상기 과정을 역순으로 수행하는 것이다. 최종적으로, 상기 첫 번째 주사에서 상기 관심 HA를 발현하는 플라스미드를 사용하여 DNA 면역화를 수행한 다음, 상기 첫 번째 면역화에 사용된 HA와 동일한 서브유형에 속하는 HA 또는 상기 첫 번째 면역화에 사용된 HA와 동일한 HA를 발현하는 불활성화된 백신 균주 및/또는 약독화된 바이러스 벡터를 함유하는 백신을 사용하여 추가 주사함을 수행하는 것도 가능하다.

투여되는 백신의 유형 또는 채택된 면역화 안이 무엇이든, 조류 독감에 대한 상기 암탉의 보호는 매우 빠르게, 일반적으로는 상기 백신 용량의 투여 후 7 내지 18일의 기간 이내에 제공된다. 그러나, 상기 암탉을 그의 산란 활동(대략적으로 1년간 지속된다) 전체를 통해 조류 독감에 대해 확실히 보호하기 위해서, 상기 첫 번째 백신 투여 후 3 내지 16 주의 기간 이내에 수행되는 1 회 또는 2 회 추가 면역화가 권장된다. 불활성화된 백신을 사용하는 여러 면역화 안들을 산란 암탉에 사용할 수 있다, 즉 예를 들어 산란 시작 직전 3 내지 6 주째에 1 회, 및 산란 시작 직전 16 내지 19 주째에 2 회의 2 회 주사, 또는 산란 시작 직전 2 내지 4 주 근처에 1 회, 3 내지 4 주 후에 2 회, 및 16 내지 19 주째에 3 회의 3 회 주사를 사용할 수 있다. 추가 항원을 또한 산란 도중에 투여할 수도 있다. 2 개의 상이한 백신을 사용하는 "프라임 부스트" 안에서, 상기 닭을 계두 벡터 기재 백신으로 1일째에 면역화할 수 있으며; 후속적으로 상기 닭에게 불활성화된 독감 바이러스를 함유하는 백신에 의한 1 회(산란 시작 직전 16 내지 19 주째) 또는 2 회(산란 시작 직전 3 내지 6 주째 및 16 내지 19 주째)의 면역화를 제공한다.

본 발명에 따른 방법의 실행에서, 상기 계란을 바람직하게는, 일단 상기 암탉의 조류 독감에 대한 보호가 보장되면(대개 상기 백신 투여 후 7 내지 18일의 기간 내에 발생한다), 상기 암탉으로부터 취한다(Bublot M. et al.(2006, Annals of the New York Academy of Sciences 1081:193-201); Van der Goot et al.(2005, Proc. Natl. Acad. Sc., 102:18141-6); Ellis et al. (Avian Pathol. 2004, 33, 405-412)).

면역화된 암탉으로부터의 계란 중에 독감 항체, 특히 HA에 대한 항체, 및 특히 독감 바이러스의 감수성 세포 내로의 침투를 막는 헤마글루틴화(IHA)를 억제하는 항체의 존재에도 불구하고, 상기 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터 기원하는 발육계란으로부터 독감 바이러스를 제조하기 위해 사용되는 방법은 통상적이다. 바람직하게는 조절된 환경 하에서 사육된 면역화된 암탉으로부터 기원하는, 9 내지 14일 된 발육 계란을 사용한다. 상기 배 발생 과정을 하기의 방식으로 조절한다: 10 내지 20 ℃, 바람직하게는 16 내지 18 ℃의 온도에서, 일반적으로 산란 후 1 주일을 초과하지 않은 기간 동안 보존된 계란을 사용한다. 상기 배 발생 과정은 상기 계란을 9 내지 14일의 기간 동안 70 ± 10%의 상대 습도를 갖는 습한 챔버에서 37.5 ℃ ± 1 ℃의 온도에서 배양함으로써 촉발된다. 상기 발육 계란을 검란법(candling)에 의해 선택하고, 그의 요막 강을 작은 부피(대략 0.1 내지 0.2 ㎖)의 일반적으로 2 내지 7 log₁₀ TCID₅₀의 바이러스 용량으로 감염시킨다. 상기 바이러스는 바이러스 균주의 독성에 따라 일반적으로 1 내지 4일 범위의 기간 동안, 상기 바이러스 균주의 표현형 및 그의 저온- 또는 고온-적응 정도에 따라 또한 변할 수 있는 온도에서 번식한다. 상기 독감 바이러스의 번식 온도는 일반적으로 28 내지 39 ℃의 범위 및 통상적으로 33 내지 39 ℃의 온도 범위이다. 이어서 상기 감염성 요막 액을 수확하고 그의 의도하는 용도에 따라 가공한다.

상기 방법을 사용하여 HA 서브유형이 상기 암탉의 면역화에 사용된 백신 중에 함유된 HA의 서브유형과 다른 독감 바이러스를 제조할 수 있다. 이는 예를 들어 상기 암탉을, H5 조류 독감에 대해 상기 암탉을 보호하기 위해 불활성화된 H5N9 바이러스로 면역화시킨 반면에, 상기 암탉으로부터의 계란은 전염성 형태의 현재 인간 독감에 대한 백신을 제조하기 위해 H1N1 또는 H3N2 독감 바이러스, 또는 심지어 B형 독감 바이러스로 감염시킨 경우이다.

본 발명에 따른 방법의 변형에 따라, 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란을 사용하여 생산된 독감 바이러스의 HA 서브유형은 상기 암탉을 면역화시키는데 사용된 HA와 상이하지만, 다른 한편으로 상기 생산된 독감 바이러스의 NA는 상기 백신 중에 사용된 바이러스의 NA와 동일한 서브유형을 갖는다. 이는, 예를 들어 상기 암탉을, 조류 독감에 대해 상기 암탉을 보호하기 위해 H5 및 N1을 발현하는 재조합 폭스바이러스 또는 불활성화된 H5N1 바이러스 균주로 면역화시킨 반면에, 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란은 H1N1 바이러스 균주로 감염시킨 경우이다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 방식에 따라, 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란 상에서 생산된 독감 바이러스의 HA는 상기 암탉을 면역화시키는데 사용된 백신 중에 함유된 HA와 동일한 서브유형을 갖는다. 이는, 예를 들어 상기 암탉을 H5를 발현하는 재조합 폭스바이러스 또는 불활성화된 H5N1 바이러스로 면역화시킨 반면에, 상기 면역화된 암탉으로부터의 계란은 H5N1 또는 H5N9 독감 바이러스로 감염시킨 경우이다. 상기 계란 중에 "서브유형"-특이적인 교차반응성 항-HA 항체의 존재에도 불구하고(이는 상기 백신 조성물 중에 함유된 HA가 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란을 감염시키는 독감 바이러스 균주의 HA와 동일한 서브유형을 갖는 경우이다), 이는 상기 바이러스의 복제에 부정적인 영향을 미치지 않는다.

더욱 또한, 훨씬 더 놀랍게도, 상기 복제는 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란을 감염시키는데 사용된 독감 바이러스와 상기 암탉을 면역화시키는데 사용된 독감 바이러스 간에 완벽한 일치가 존재하는 경우에, 어느 것에도 영향을 미치지 않는다. 이 경우에, 상기는 상기 계란에서, 서브유형-특이적 교차반응성 항-HA 항체, 및 상기 균주에 매우 특이적인 항-HA 항체(또한 균주-특이적 항체라 칭한다) 모두가 발견되므로(실시예 3 참조) 훨씬 더 광범위한 항-HA 항체들의 패널의 존재에 의해 반영된다. 널리 확립된 의견과 상반되게, 상기 계란 중의 독감 항체의 존재, 및 특히 항-HA 항체의 존재는 따라서 상기 독감 바이러스의 복제에 영향을 미치지 않는다. 상기 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터의 계란으로부터 기원하는 감염된 요막 액 중에서 수확된 바이러스 및/또는 헤마글루틴화 항원의 양은 면역화되지 않은 암탉으로부터의 계란으로부터 기원하는 감염된 요막 액 중에서 수확된 경우와 동일한 정도이다(실시예 1 및 2 참조).

본 발명에 따른 방법은 또한 유전자재편성 바이러스 균주의 제조에 유리할 수 있다. 이 경우에, 첫 번째 단계에서, 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란을 야생형 바이러스 균주, 및 발육 계란에서 잘 복제하는 마스터 바이러스 균주, 예를 들어 A/PR/8/34 균주로 동시 감염시킨다. 두 번째 단계에서, 유전자재편성물과 상기 마스터 균주의 혼합물을 필수적으로 함유하지만 복제할 수 없는 야생형 균주가 일반적으로 매우 소량으로 있는 상기 감염된 요막 액을 수거한다. 이어서 상기 A/PR/8/34 균주의 표현형 특징(즉 발육계란에서 그의 양호한 복제 능력) 및 상기 야생형 균주의 HA 및 또한 NA를 동시에 발현하는 유전자재편성 균주를, 각각의 클로닝 단계에서, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법에 따라 상기 수확된 감염성 요막 액과 A/PR/8/34에 특이적인 항-HA 및 항-NA 항체를 혼합함으로써 연속적인 클로닝 단계에 의해 선택한다. 또한 약독화된 생 바이러스 백신을 기대하여 저온-적응되고 열-감수성인 유전자재편성 균주를 제작하는 것도 가능하다. 이 경우에, 첫 번째 단계에서, 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란을 야생형 바이러스 균주, 및 저온-적응되고 열-감수성인 표현형 특징을 갖는 마스터 균주로 동시 감염시킨다. 이 경우에, 상기 감염된 계란의 배양 온도는 통상적인 것보다 낮은 온도이다(상기 온도는 통상적으로 35 ℃ 이하, 또는 심지어 30 ℃ 이하이다). 두 번째 단계에서, 유전자재편성물 및 상기 마스터 균주의 혼합물을 필수적으로 함유하는 상기 감염된 요막 액을, 상기 저온-감수성 야생형 균주가 복제되지 않았으므로, 수거한다. 이어서 상기 마스터 균주의 표현형 특징(특히 상기 저온-적응성 및/또는 그의 열감수성) 및 상기 야생형 균주의 HA 및 또한 NA를 동시에 발현하는 유전자재편성물을, 각각의 클로닝 단계에서, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법에 따라 상기 수확된 감염성 요막 액과 상기 마스터 균주에 특이적인 항-HA 및 항-NA 항체를 혼합함으로써 연속적인 클로닝 단계에 의해 선택한다.

본 발명에 따른 방법을 조류 독감에 대해 암탉의 육종 콜로니 및 보다 일반적으로 가금류(오리, 칠면조, 거위 등)의 육종 콜로니를 보호하고자 하는 백신의 제조를 위한 제 1 선으로서 수행하였다. 조류 독감의 무증상 또는 순한 형태에 관련된 바이러스 균주는 임의의 서브유형, 및 특히 H9N2, H6N2, H7N2, H7N3 또는 H7N1 서브유형을 가질 수 있다. 상기 균주는 상기 육종 콜로니에 어떠한 실질적인 폐사율도 일으키지 않지만, 일시적인 산란 감소를 야기할 수도 있다. 육종 콜로니에 상당한 폐사율을 유발하는 조류 독감의 심각한 형태에 관련된 높은 경로 바이러스 균주는 일반적으로 H5 및 H7 서브유형, 및 특히 H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H7N1, H7N3, H7N4, 또는 H7N7에 속한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서 조류 독감에 대해 상기 암탉을 면역화시키는데 사용되는 백신 조성물 중에 함유된 독감 바이러스 헤마글루티닌 및 상기 방법의 단계 c)에서 발육 계란을 감염시키는데 사용되는 바이러스의 헤마글루티닌은 동일한 서브유형을 가지며, 특히 H5, H6, H7 및 H9 서브유형 중에서 선택되는데, 이들은 조류 독감의 원인이 될 수 있는 바이러스의 균주에서 주로 발견되는 것들이기 때문이다.

특정 태양에서, 본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서 조류 독감에 대해 상기 암탉을 면역화시키는데 사용되는 백신 조성물 중에 함유된 독감 바이러스 헤마글루티닌 및 상기 방법의 단계 c)에서 발육 계란을 감염시키는데 사용되는 바이러스의 헤마글루티닌은 동일한 서브유형을 가지며, H5 및 H7 서브유형 중에서 선택되는데 이들은 조류 독감 및 인간 독감의 심각한 형태의 원인이 될 수 있는 바이러스의 균주에서 주로 발견되는 것들이기 때문이다. 상기 특성화된 조류 독감 및/또는 인간 독감의 심각한 형태의 원인이 될 수 있는 바이러스의 균주는 일반적으로 H5N1, H5N2, H7N1, H7N3 또는 H7N7 서브유형에 속한다.

따라서, 매우 구체적으로, 본 발명의 주제는

a. 암탉을 불활성화된 전체 독감 바이러스로 면역화시키고, 이에 따라 상기 바이러스의 헤마글루티닌은 H5 또는 H7 서브유형을 가지며,

b. 상기 면역화된 암탉으로부터 계란을 취하고,

c. 배 발생 과정을 촉발하고,

d. 상기 발육 계란의 요막 강에 상기 면역화에 사용된 것과 동일한 독감 바이러스를 도입시킴으로써 상기 발육 계란을 감염시키고,

f. 상기 바이러스를 함유하는 요막 액을 수확함

에 따른 상기 독감 바이러스의 제조 방법이다.

상기 암탉 면역화 안이 2 회의 주사를 계획하는 경우, 상기 첫 번째 주사는 불활성화된 전체 독감 바이러스 대신에, 상기 독감 바이러스 헤마글루티닌 H5 또는 H7 서브유형을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터, 일반적으로 폭스바이러스를 함유하는 백신 조성물을 사용하여 수행할 수 있다.

상기 감염된 요막 액을 독감 백신의 생산에 사용하고자 하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 일반적으로 상기 바이러스 균주의 정제 단계를 추가로 포함하고 임의로 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법, 예를 들어 FR 2201079 또는 FR 1538322에 개시된 방법을 사용하는 바이러스 불활성화 단계를 후속 수행하거나 선행한다.

상기 정제는 간단할 수 있으며 상기 감염된 요막 액을 일반적으로 등명화한 후에 원심분리에 의해 상기 바이러스를 농축시키는 단계로 한정될 수 있다. 상기 정제를, 예를 들어 슈크로스 밀도 구배에 의해 수행된 대역 원심분리 단계로 보충할 수도 있다(EP 0 7760362). 크로마토그래피 방법을 또한 상기 바이러스의 정제를 위해 수행할 수 있다. 따라서 상기 불활성화된 전체 백신 또는 약독화된 백신의 조성물을 구성하는데 소용이 되는 정제된 전체 바이러스의 현탁액이 수득된다.

상기 바이러스 현탁액의 불활성화는 통상적인 수단에 의해, β-프로피오락톤(E. Budowsky et al. 1991, Vaccine, 9:319-325; 1991, Vaccine, 9:398-402; 1993, Vaccine, 11: 343-348), 에틸렌이민 또는 유도체(D. King 1991, Avian Dis. 35:505-514) 또는 포몰(EP 0 776 0362)을 사용함으로써 수행된다.

불활성화된 전체 바이러스를 기본으로 하는 백신 조성물을 하나 이상의 항원보강제와 함께 제형화할 수 있다. 통상적으로 상기 백신을 알루미늄 염과 함께 또는 유중 수적형 또는 수중 유적형 유화액(조류 독감 백신의 경우) 중에서 제형화할 수 있지만, 액체 파라핀, 친수성 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 83 또는 폴리솔베이트 85 및 친지성 계면활성제, 예를 들어 솔비탄 올리에이트, 솔비탄 세스퀴올리에이트 또는 솔비탄 트라이올리에이트로 구성된 유중 수적형 유화액이 통상적으로 사용된다. 상기 독감에 대한 체액 및/또는 세포 반응을 증가시킬 수 있는 임의의 항원보강제를 사용할 수도 있다. 비 제한적인 항원보강제 제형의 예로서, MF59(등록상표) 유화액, 리포솜 기재 제형, 및 MPL, 코리네박테리움 파르븀, 사포닌, 리소레시틴, 플루로닉 유도체, 또는 이들의 조합을 기본으로 하는 제형을 언급할 수 있다.

상기 정제된 바이러스 현탁액을 또한 후속 처리할 수 있다. 독감 바이러스-유도된 산물을 상기와 같이 수득한다. 상기 바이러스 현탁액을, 예를 들어 단편화되거나 분할된 바이러스를 기본으로 하는 백신, 상기 독감 바이러스 헤마글루티닌을 함유하는 바이로솜 또는 서브유닛 백신을 제조하기 위해, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법에 따라 세제 또는 액체 용매를 사용하여 단편화할 수 있다. 상기 단편화되거나 분할된 바이러스, 상기 독감 바이러스 헤마글루티닌을 함유하는 바이로솜, 및 상기 정제된 바이러스로부터 수득된 독감 바이러스 헤마글루티닌을 함유하는 서브유닛 백신은 독감 바이러스 유도된 산물인 것으로 간주된다. 이들 유도된 산물들을 함유하는 백신을 유사하게는 하나 이상의 항원보강제와 제형화할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 백신은 인간 및 동물을 상기 독감에 대해 보호하는데 사용하기 위한 것이다.

수의학 분야에서, 상기 백신은 주로 조류 독감 예방 분야에 사용되지만, 이를 또한 말과의 일원, 특히 말, 개과의 일원, 특히 개, 고양이과의 일원, 특히 고양이, 돼지과의 일원, 특히 돼지, 족제비, 특히 밍크 및 흰족제비, 및 조류 종, 특히 암탉, 오리, 칠면조, 메추라기, 뿔닭, 거위 및 타조에서 독감 증상 및/또는 바이러스 배출을 예방 또는 감소시키기 위해 사용할 수도 있다. 상기 백신 조성물이 불활성화된 전체 바이러스 균주 또는 유도된 산물을 함유하는 경우, 상기를 일반적으로는 피하 또는 근육 내로, 또는 임의로 가금류 육종 콜로니 중의 분무된 물질의 형태로 투여한다. 상기 백신이 약독화된 생 바이러스의 형태인 경우, 상기를 일반적으로는 구비강으로, 분무에 의해, 음료수 중에, 또는 점안약으로서 투여한다. 상기 면역화 안은 일반적으로 주사 또는 주사에 이은 추가 접종을 제공한다. 상기 투여되는 백신 용량은 동물의 크기 및 연령에 따른다. 상기는 대개 불활성화 전에 10⁸ 내지 10¹⁰ EID₅₀/㎖의 역가를 갖는 요막 액 20 내지 200 ㎕를 함유하며, 0.05 내지 1 ㎖의 부피로 주입된다.

인간에서, 상기 백신은 전염성 독감 및 대유행성 독감 예방 분야에 사용된다. 전염성 독감은 접촉(감염)에 의해 또는 상기 전염에 원인이 될 수 있는 바이러스 균주의 HA와 항원 관계가 존재하고, 비록 단지 부분적으로만 유효하다 할지라도 일정한 면역성이 존재하는 독감 바이러스의 하나(또는 그 이상)의 균주(들)에 의한 면역화에 의해 이미 감작된 인간 집단이 걸리는 반면, 대유행성 독감은 상기 새로운 균주의 HA가 종래에 돌았던 바이러스 균주와 항원 관계가 전혀 없거나 또는 너무 작기 때문에 상기 새로운 바이러스 균주에 감작되지 않은 인간 집단이 걸린다.

상기 전염성 독감 백신은 이미 돌았던 종래의 바이러스 균주와 항원 관계를 갖는 계절성 독감 바이러스 균주가 순환함으로써 유발된 계절성 독감 형태에 대해 상기 인간 집단을 보호하고자 한다. 현재, 전염성 독감 바이러스 균주인, 전염성 독감의 원인이 될 수 있는 독감 바이러스 균주는 A형이고 H1N1 또는 H3N2 서브유형에 속하거나 또는 B형이다.

상기 대유행성 독감 백신은 종래에 돌았던 바이러스 균주와 HA에 관하여 항원 관계가 없는 새로운 독감 바이러스 균주인 대유행성 독감 바이러스 균주에 의한 감염에 대해 상기 인간 집단을 보호하고자 한다.

상기 전염성 또는 대유행성 독감 백신은 약독화된 생백신 또는 불활성화된 백신의 형태일 수 있지만, 불활성화된 백신이 대유행성 독감의 예방에 바람직하다. 상기 백신은 1가 백신(단일 독감 바이러스 균주로부터 제조된 백신) 또는 다가 백신(여러 가지 독감 바이러스 균주로부터 제조된 백신)의 형태일 수 있다. 상기 전염성 독감 백신의 조성물은 현재 H3N2 및 H1N1 균주, 및 B형 바이러스 균주로부터 제조된 3가 백신의 형태이다. 상기 불활성화된 백신은 일반적으로 전체 바이러스, 단편화된 바이러스(분할된 바이러스) 또는 바이로솜, 또는 HA를 함유하는 서브유닛의 형태이며, 임의로 상기 언급한 것들과 같은 하나 이상의 항원보강제를 함유한다. 상기 약독화된 생백신을 점막 면역성의 발생을 촉진하기 위해 경구 또는 코로 일반적으로 투여하는 반면, 상기 불활성화된 백신은 비 경구(근육 내 또는 피하), 피 내 또는 심지어 점막 내(비 내), 또는 심지어 WO 01/22992에 개시된 바와 같이 2 가지 상이한 경로들의 조합에 의해 투여할 수 있다. 상기 면역화 안은 일반적으로 주사 또는 주사에 이은 추가 접종을 제공한다. 상기 투여되는 백신 용량은 상기 개인의 연령 및 항원보강제의 존재 또는 부재에 따라 변한다. 통상적으로, 상기 백신 용량은 상기 백신 중에 함유된 각각의 백신 균주의 HA 15 ㎍의 당량을 함유한다. 상기 용량은 상기 백신이 항원보강될 때 대략 1 내지 2 ㎍으로 감소되거나, 또는 면역 결핍증을 앓고 있는 노인 또는 개인에서 30 ㎍ 또는 훨씬 더 많은 HA로 증가될 수 있다.

최종적으로, 본 발명의 주제는

독감 바이러스의 생산 또는 독감 백신의 제조를 위한, 상기 독감에 대해 면역화된 암탉으로부터의 계란의 용도이다. 널리 확립된 의견과 달리, 면역화된 암탉으로부터의 계란 중의 독감 바이러스 헤마글루티닌에 대한 항체의 존재는 상기 요막 강의 감염 후 생산되는 독감 바이러스의 양에 영향을 미치지 않는다.

하기의 실시예들은 본 발명의 다양한 실시태양들을 비 제한적인 방식으로 예시한다.

상기 서열의 다양한 기원들은 하기와 같다:

·1 내지 53: M13F 프라이머의 서열(밑줄 그은 것)을 포함하는 클로닝 플라스미드의 부분 서열.

·54 내지 1483: TROVAC 계두 벡터의 게놈 중의 F8 삽입 유전자 좌에 인접한 "왼쪽 팔"의 서열.

·1484 내지 1568: 상기 왼쪽 팔과 H6 프로모터 사이의 링커 서열.

·1569 내지 1692: 우두 바이러스 H6 프로모터의 서열.

·1693 내지 3387: 상기 A/치킨/인도네시아/7/03 균주의 변경된 합성 HA 유전자의 서열; 상기 아미노산 서열은 아미노산 당 1-문자 코드를 사용하여 뉴클레오타이드 서열 위에 나타낸다.

·3388 내지 3414: 상기 HA 유전자와 계두 초기 유전자의 TTTTTAT 전사 정지 서열을 포함하는 오른쪽 팔 사이의 링커 서열.

·3415 내지 4790: 상기 TROVAC 계두 벡터의 게놈 중의 F8 삽입 유전자 좌에 인접한 "오른쪽 팔"의 서열.

·4791 내지 4885: 상기 M13R 프라이머의 서열(밑줄 그은 것)을 포함하는 클로닝 플라스미드의 부분 서열.

실시예 1:

조류 독감 바이러스 균주 A/치킨/ 이탤리 /22A/ 98(H5N9)를 함유하는 불활성화된 백신의 2회 주사, 또는 H5N1 균주의 HA 를 암호화하는 재조합 조류두창 바이러스의 주사에 이은 조류 독감 바이러스 균주 A/치킨/ 이탤리 /22A/ 98(H5N9)를 함유하는 불활성화된 백신의 2차 주사에 의해 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란을 사용하여, 인간 전염성 독감에 대한 백신의 제조에 사용되는 2 개의 백신 균주 A/뉴칼레도니아/20/99( H1N1 ) 및 A/뉴욕/55/04( H3N2 )를 제조하는 방법

1.1) 실시 프로토콜

1.1.1) 재조합 벡터 vFP2211의 제작

vFP2211은 재조합 계두 바이러스로서, 그의 게놈 내에 A/치킨/인도네시아/7/03 H5N1 균주의 헤마글루티닌(HA)을 암호화하는 합성 유전자가 삽입되었다. 진뱅크(GenBank) 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 조회번호 EF473080(또는 진펩트(GenPept) 단백질 서열 데이터베이스에 조회번호 ABO30346)으로 개시된 A/치킨/인도네시아/7/03 균주의 고유 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 개방 판독 프레임을 획득하기 위해서 상기 HA 유전자를 합성하였으며, 이때 절단 부위는 제외하였다. 339번과 347 번 사이에 위치한 RERRRKKRG 아미노산 서열(높은 경로 균주의 절단 부위에 상응함)을 RE----TRG 서열로 대체하였다. 상기와 같이 변경된 상기 절단 부위는 서브유형 H5의 낮은 경로 균주의 절단 부위에 상응한다.

첫 번째 단계에서, H6 우두 프로모터의 조절 하에서 상기 변경된 합성 HA 유전자를 포함하고(Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6:504-508; Guo P. et al., J. Virol., 1989, 63:4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63:3829-3836) F8 삽입 유전자 좌의 측면 팔들과 접하여 상기 계두 벡터 게놈의 F8 삽입 유전자 좌 내로 상기 HA 유전자의 삽입을 허용하는 공여 플라스미드 pJY1394.1을 제작하였다. 상기 F8 삽입 유전자 좌는 문헌[Srinivasan and Tripathy, 2005, Veterinary Microbiology 108:215-223]에 개시된 포토리아제를 암호화하는 계두 유전자에 상응하며; 상기 유전자는 또한 상기 계두 게놈의 완전한 서열 중에 FPV158이라는 이름으로 개시되어 있다(GenBank, 조회번호 AF198100). 상기 F8 유전자 좌 내로의 상기 HA 유전자 및 H6 프로모터의 삽입 결과 상기 재조합 계두 바이러스 게놈으로부터 FPV158 유전자가 결실된다. 상기 플라스미드 pJY1394.1의 완전한 뉴클레오타이드 서열 및 또한 상기 HA 유전자와 접하고 있는 뉴클레오타이드 서열의 시리즈(또한 상기 플라스미드의 완전한 서열 중에 보인다)를 각각 도 1 및 2에 개시한다.

이어서 재조합 바이러스 vFP2211을 상기 플라스미드 pJY1394.1의 측면 팔들과 계두 게놈 사이의 이중 재조합에 의해 수득하였다. 이를 위해서, 1차 계배 세포를 NotI으로 선형화한 플라스미드 pJY1394.1로 형질감염시키고 모 계두 균주(TROVAC 벡터)로 감염시켰다(10의 감염 배수). 상기 TROVAC 벡터는 닭에서 계두에 대해 메리알(Merial)에 의해 생산된 디프토세크(Diftosec) 백신의 백신 균주로부터 유도된다. 상기 재조합 바이러스는 상기 삽입된 HA 유전자를 검출하기 위한 탐침과 용해 플라크 상에서의 특이적인 하이브리드화에 의해 선택되었다. 이어서 상기와 같이 단리된 vFP2211이 회전하는 병 중에서 계배 세포 상에서 생산되었다.

1.1.2) 불활성화된 H5N9 백신의 제조

발육 계란 상에서 생성되고 베타-프로피오락톤(BPL)으로 불활성화된 낮은 경로 A/치킨/이탤리/22A/98 H5N9 균주(일라리아 카푸아(Ilaria Capua)의 실험실(Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Virologia, Padua, Italy)에 의해 제공됨), 및 액체 파라핀, 솔비탄 올리에이트 및 폴리솔베이트 80으로 구성된 유중 수적형 유화액으로 이루어진 불활성화된 H5N9 백신을 문헌[H. Stone, 1987, Avian Dis. 31:483-490]에 개시된 바와 같은 방법에 따라 제조하였다. 상기 유화액의 계면활성제들의 혼합물의 HLB(친지성 친수성 균형)는 5.3의 값을 갖는다. 백신 용량은 불활성화 전에 10^8.9 EID₅₀/㎖의 역가를 갖는 요막 액 60 ㎕와 같다.

1.1.3) 산란 암탉의 면역화

"특정 병원체 부재"(SPF) 상태인 1-일(D0) 레그혼 병아리 2 개 그룹(G1 및 G2)을 형성시켰다. 하기의 면역화 안을 그룹 G1에 적용시켰다: 상기 1-일(D0) 병아리에게 인슐린 주사기를 사용하여, 목의 기부에, 피하로, 3.0 log₁₀ CCID₅₀/0.2 ㎖의 역가를 갖는 vFP2211의 바이러스 현탁액 0.2 ㎖을 제공하였다. 8 주의 주령(W8)에서 상기 병아리들의 암수를 감별하였다. 대략적으로 25 마리의 어린 암탉과 16 마리의 수탉을 함께 보호하고 결혼시켰다. 17 주의 주령에서(W17) 이들에게 1가의 불활성화된 H5N9 백신 0.5 ㎖ 부피의 백신 용량을 추가 주사하였다.

하기의 면역화 안을 그룹 G2에게 적용하였다: 3-주된 SPF 병아리에게 인슐린 주사기를 사용하여, 창사골에, IM 주사에 의해, 1 가의 불활성화된 H5N9 백신 0.3 ㎖ 부피의 백신 용량을 제공하였다. 8 주의 주령(W8)에서 상기 병아리들의 암수를 감별하였다. 대략적으로 25 마리의 어린 암탉과 16 마리의 수탉을 함께 보호하고 결혼시켰다. 17 주의 주령에서(W17) 이들에게 1가의 불활성화된 H5N9 백신 0.5 ㎖ 부피의 백신 용량을 추가 주사하였다.

1.1.4) A/뉴칼레도니아/20/99 IVR-116(H1N1) 또는 A/뉴욕/55/04 X-157(H3N2) 바이러스 균주로, 그룹 G1 및 G2의 암탉 및 면역화되지 않은 암탉으로부터 기원하는 계란을 감염시키기 위한 프로토콜

A/뉴칼레도니아/20/99 IVR-116(H1N1)이라 칭하는 유전자재편성 백신 균주 A/뉴칼레도니아/20/99(xPR8) 및 A/뉴욕/55/04 X-157(H3N2)이라 칭하는 A/뉴욕/55/04(xPR8)의 복제 능력을 주령 40 내지 41 주째(시험 2) 및 49 내지 50 주째(시험 3)에 산란한 그룹 G1의 암탉으로부터의 계란 및 26 내지 27 주째(시험 1), 40 내지 41 주째(시험 2) 및 49 내지 50 주째(시험 3)에 산란한 그룹 G2의 암탉으로부터의 계란에서 평가하였다. 병행하여, 바이러스 균주 A/뉴칼레도니아/20/99(xPR8)(H1N1) 및 A/뉴욕/55/04(xPR8)(H3N2)의 복제 능력을 면역화되지 않은 SPF 암탉(대조군)으로부터 유도된 대조용 계란에서 동일한 방식으로 평가하였다.

상기 주일 동안 산란한 모든 계란들을 온도-조절된 챔버(12 내지 15 ℃)에서 보존하였다. 동일한 그룹의 동물들로부터 기원한 동일한 시험의 계란을 함께 분류하고 이어서 배 발생 과정을, 상기 계란들을 상대 습도가 대략 70 내지 80%인 챔버에서 37 내지 38 ℃에서 10 일간 배양함으로써 촉발시켰다. 10일간 배양 후에 상기 배의 생명력을 검란 장치에 의해 각각의 계란에서 확인하고, 요막 강의 위치를 십자로 정확히 표시하였다. 동일한 그룹의 동물들로부터 기원한 동일한 시험의 발육 계란을 계란 8 개의 풀로 함께 분류하였다. 동일한 풀의 발육 계란을, 상기 계란의 껍질을 소독하고 이어서 천공한 후에 상기 십자의 높이에서 200 ㎕의 부피로 주입한 동일한 감염 용량의 독감 바이러스로 감염시켰다. A/뉴칼레도니아/20/99(xPR8)(H1N1) 및 A/뉴욕/55/04(xPR8)(H3N2) 바이러스의 10², 10³ 및 10⁴ EID₅₀(계란 감염 용량 50%)의 감염 용량을 시험하였다. 계란당 10³ 및 10⁴ EID₅₀의 감염 용량을 시험 1 및 2의 계란에서 시험하였다. 계란당 10² 및 10³ EID₅₀의 감염 용량을 시험 3의 계란에서 시험하였다. 이어서 상기 감염된 발육 계란들을 상대 습도가 80%인 챔버에서 48 시간 동안 34 ℃에서 배양하고 이어서 밤새 +4 ℃에 두었다. 이어서 상기 감염된 요막 액을 각각의 계란으로부터 취하였다. 감염 역가를 HAU(헤마글루틴화 단위) 역가를 측정함으로써 상기 채취된 각각의 요막 액상에서 평가하였다. 칠면조 적혈구를 사용하여 A/뉴욕/55/04(xPR8)(H3N2) 균주로 감염된 요막 액의 HAU 역가를 측정하였다. 암탉 적혈구를 사용하여 A/뉴칼레도니아/20/99(xPR8)(H1N1)로 감염된 요막 액의 HAU 역가를 측정하였다. 상기 HAU 역가를 상기 감염된 요막 액(포스페이트 완충제 중의 0.5%의 암탉 또는 칠면조 적혈구의 현탁액의 존재 하에서 뚜렷한 헤마글루틴화를 나타내었다)의 최종 희석비의 역으로 나타내었다.

1.2) 결과

계란에 주입된 바이러스의 감염 용량의 함수 및 상기 계란이 샘플링된 시간의 함수로서 면역화된 암탉 및 면역되지 않은 암탉의 다양한 그룹들로부터 기원하는 계란에서 획득된 HAU 역가의 평균을 표 1 및 2에 제공한다.

사용된 A/뉴칼레도니아/20/99(xPR8)(H1N1)의 감염 용량, 계란의 기원(G1, G2, 면역화되지 않은 대조군) 및 상기 계란이 산란된 시기(시험 1, 시험 2, 시험 3)의 함수로서 요막 액에서 획득된 헤마글루틴화 역가
감염 용량 (EID₅₀/계란)	100	1000			10 000

그룹	시험 3	시험 1	시험 2	시험 3	시험 1	시험 2
면역화되지 않은 대조군	640*	1050	1660	1280	861	1522
G1 (vFP2211/불활성화된 백신 H5N9)	1140	NA	1974	830	NA	1974
G2 (불활성화된 백신 H5N9/불활성화된 백신 H5N9)	806	905	1660	1159	905	1974
*: 각각의 조건에 포함된 8 개 계란의 요막 액상에서 획득된 8 HAU 역가/50 ㎕의 기하 평균의 형태로 나타낸 헤마글루틴화 역가(HAU) NA: 적용 안 됨

사용된 A/뉴욕/55/04(xPR8)(H3N2)의 감염 용량, 계란의 기원(G1, G2, 면역화되지 않은 대조군) 및 상기 계란이 산란된 시기(시험 1, 시험 2, 시험 3)의 함수로서 요막 액에서 획득된 헤마글루틴화 역가
감염 용량 (EID₅₀/계란)	100	1000		10 000

그룹	시험 3	시험 1	시험 3	시험 1
면역화되지 않은 대조군	211*	861	349	830
G1 (vFP2211/불활성화된 백신 H5N9)	88	NA	254	NA
G2 (불활성화된 백신 H5N9/불활성화된 백신 H5N9)	254	987	557	844
*: 각각의 조건에 포함된 8 개 계란의 요막 액상에서 획득된 8 HAU 역가/50 ㎕의 기하 평균의 형태로 나타낸 헤마글루틴화 역가(HAU) NA: 적용 안 됨

표 1 및 2에서 획득된 결과는 면역화된 암탉(G1 및 G2)으로부터 기원하는 계란의 요막 액의 HAU 역가의 평균이 면역화되지 않은 암탉으로부터 기원하는 계란의 요막 액의 HAU 역가의 평균과 동일함을 보인다.

상기 면역화 및 용량 인자를 연구하기 위해서 통계학적 분석을 수행하였다. 상기 HAU의 개별적인 값들을 log₂로 전환하고 이어서 분산 모델을 사용하여 분석하였다. 상기 분산 이질성을, 상기 모델(SAS v8.2 소프트웨어)의 나머지를 사용하여 수행한, 감소된 크기에 대한 시험을 사용하여 시험하였다.

상기 HAU 역가의 개별적인 값들에 대해 수행된 통계학적 분석은 면역화 효과가 없음을 나타내었다. 또한 상기 계란을 감염시키기 위해 사용된 바이러스의 용량과 관련된 어떠한 효과도 없었다. 상기 HAU 역가는 상기 연구된 산란 기간(26 주(시험 1) 내지 50 주(시험 3)의 범위) 동안 거의 변동하지 않았다.

실시예 2:

조류 독감 바이러스 균주 A/치킨/ 이탤리 /22A/ 98(H5N9)를 함유하는 불활성화된 백신의 2회 주사, 또는 H5N1 균주의 HA 를 암호화하는 재조합 조류두창 바이러스의 주사에 이은 조류 독감 바이러스 균주를 함유하는 불활성화된 H5N9 백신의 2차 주사에 의해 면역화된 암탉으로부터의 발육 계란을 사용하여, 2 개의 대유행성 백신 균주 A/치킨/ 이탤리 /22A/98( H5N9 ) 및 A/베트남/1194/04 NIBRG14 ( H5N1 )를 제조하는 방법

2.1.1) 암탉의 면역화

상기 암탉을 면역화하기 위한 프로토콜은 실시예 1에 사용된 것과 동일하였다.

2.1.2) A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9) 및 A/베트남/1194/04 NIBRG14(H5N1) 바이러스 균주에 의한, 그룹 G1 및 G2의 암탉 및 면역화되지 않은 암탉으로부터 기원하는 계란의 감염 프로토콜

상기 감염 프로토콜은 하기의 변경을 제외하고, 실시예 1에 사용된 바와 동일하였다:

실험실(Laboratoire Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Virologia, Padua, Italy)로부터 기원하는 낮은 경로 A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9) 조류 균주 및 약독화된 대유행성 유전자재편성 백신 균주 A/베트남/1194/04 NIBRG14(H5N1)를 사용하여 상기 계란을 감염시켰다. 상기 후자의 균주는 영국국립생물의약품표준화연구소(NIBSC) 실험실(South Mimms, Potters Bar, Herts EN6 3QG, UK)에 의해 제공되었으며 문헌[C. Nicolson et al., 역 유전학에 의한 베로 세포상에서의 독감 백신 바이러스의 발생: 품질관리 시스템 하에서 생산된 H5N1 후보 백신 균주, 2005, Vaccine, 23:2943-2952]에 개시된 바와 같이, 역 유전학에 의해 획득되었다.

10², 10³, 10⁴ 및 10⁵ EID₅₀ (계란 감염 용량 50%)의 감염 용량을 상기 두 균주에 대해 시험하였다. 계란당 10³, 10⁴ 및 10⁵ EID₅₀ 의 감염 용량을 시험 1의 계란에서 시험하였다. 계란당 10⁴ 및 10⁵ EID₅₀ 의 감염 용량을 시험 2의 계란에서 시험하였다. 계란당 10² 및 10³ EID₅₀ 의 감염 용량을 시험 3의 계란에서 시험하였다.

암탉 적혈구를 사용하여 A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9) 또는 A/베트남/1194/04 NIBRG14(H5N1)에 의해 감염된 요막 액의 HAU 역가를 측정하였다.

2.2) 결과

계란에 주입된 바이러스의 감염 용량의 함수 및 상기 계란이 채취된 시간의 함수로서 면역화된 암탉 및 면역화되지 않은 암탉의 다양한 그룹들로부터 기원하는 계란에서 획득된 HAU 역가를 표 3 및 4에 제공한다.

사용된 A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9)의 감염 용량, 계란의 기원(G1, G2, 면역화되지 않은 대조군) 및 상기 계란이 산란된 시기(시험 1, 시험 2, 시험 3)의 함수로서 요막 액에서 획득된 헤마글루틴화 역가
감염 용량 (EID₅₀/계란)	100	1000		10 000		100 000

그룹	시험 3	시험 1	시험 3	시험 1	시험 2	시험 1	시험 2
면역화되지 않은 대조군	35*	53	32	53	64	54	53
G1 (vFP2211/불활성화된 백신 H5N9)	64	NA	54	NA	59	NA	86
G2 (불활성화된 백신 H5N9/불활성화된 백신 H5N9)	102	64	57	59	70	102	59
*: 각각의 조건에 포함된 8 개 계란의 요막 액상에서 획득된 8 HAU 역가/50 ㎕의 기하 평균의 형태로 나타낸 헤마글루틴화 역가(HAU) NA: 적용 안 됨

사용된 A/베트남/1194/04(H5N1) RG14의 감염 용량, 계란의 기원(G1, G2, 면역화되지 않은 대조군) 및 상기 계란이 산란된 시기(시험 1, 시험 2, 시험 3)의 함수로서 요막 액에서 획득된 헤마글루틴화 역가
감염 용량 (EID₅₀/계란)	1000	10 000		100 000

그룹	시험 1	시험 1	시험 2	시험 1	시험 2
면역화되지 않은 대조군	194*	232	197	172	181
G1 (vFP2211/불활성화된 백신 H5N9)	NA	NA	197	NA	166
G2 (불활성화된 백신 H5N9/불활성화된 백신 H5N9)	152	279	215	181	235
*: 각각의 조건에 포함된 8 개 계란의 요막 액상에서 획득된 8 HAU 역가/50 ㎕의 기하 평균의 형태로 나타낸 헤마글루틴화 역가(HAU) NA: 적용 안 됨

표 3 및 4에 제공된 결과 및 또한 통계학적 분석은 상기 면역화된 암탉(G1 및 G2)으로부터의 계란으로부터 기원하는 요막 액의 HAU 역가가, 심지어 상기 암탉이 이들 암탉(A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9) 균주로 면역화된 그룹 G1 및 G2의 경우)으로부터 기원하는 발육 계란을 감염시키는데 사용된 것과 동일한 균주에 의해 면역화된 상황에서조차, 상기 면역화되지 않은 암탉으로부터의 계란의 요막 액의 HAU 역가와 유사함을 보인다. 상기 계란을 감염시키는데 사용되는 바이러스의 용량과 관련된 효과는 어느 경우에든 없다. 상기 HAU 역가는 상기 연구된 산란 기간(26 주(시험 1) 내지 50 주(시험 3)의 범위) 동안 거의 변동하지 않았다.

상기 통계학적 분석을 실시예 1에서와 같이 수행하였다.

실시예 3:

A/치킨/ 이탤리 /22A/98( H5N9 ) 백신 균주에 의해 면역화된 암탉으로부터의 계란에서 항- H5 모계 항체 반응의 분석

3.1) 실시 프로토콜

A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9) 균주에 의해 면역화된 그룹 G1 및 G2의 암탉으로부터의 계란 중의 항-H5 항체의 존재를 단락 1.1.1)에 개시된 프로토콜에 따라 측정하였다. 병행하여, 상기 항-H5 반응을 또한 면역화되지 않은 암탉의 계란의 난황 중에서 분석하였다(대조군).

상기 항-H5 반응을 시험 1(W26-27), 2(W40-41) 및 3(W49-50)의 시기에 취한 계란의 난황(또는 난황액)에서 분석하였다. 상기 시험 1의 계란의 난황에서의 상기 항-H5 반응의 분석을 배 발생 전(D0) 및 배 발생 후(D10)(즉 37 ℃에서 10 일간 배양한 단계 후)에 수행하였다. 상기 시험 2 및 3의 계란의 난황에서의 상기 항-H5 반응의 분석은 배 발생 후(D10)에만 수행하였다. 동일한 분석을 또한 면역화되지 않은 암탉으로부터 기원하는 계란을 사용하여 수행하였다(단락 3.2.2) 참조). 상기 항-H5 반응을 또한 배 발생 후(D10)에 시험 2의 계란의 요막 액에서 연구하였다. 상기 난황을 일회용 팁이 있는 피펫을 사용하여 흡입에 의해 제거하였다. 난황을 사전 희석 없이 동결시켜 보존한 시험 1을 제외하고, 시험 2 및 3의 난황 및 요막 액을 동결 전에 포스페이트 완충제로 1/5배 사전 희석하였다. 상기 희석된 난황 및 요막액을, A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9) 균주의 존재 하에서 발생하는 암탉 적혈구의 헤마글루틴화의 억제(IHA)에 의해 분석하는 방법을 사용하여 수행하는 상기 항-H5 항체 분석시까지 동결 보존하였다. 상기 분석은 상기 바이러스의 "헤마글루틴화" 활성을 억제하는 상기 바이러스의 HA에 대해 특이적인 중화 항체의 능력을 근거로 하였다. 이 시험에서, NISBC에 의해 제공된 항-A/베트남/1194/04 양 혈청을 양성 대조군으로서 사용하고 고유의 마우스 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다. 상기 샘플들(희석된 난황 또는 요막 액)의 연속적인 2 배 희석을 웰당 각각의 희석물 50 ㎕를 수득하기 위해서 원추바닥 미세플레이트에서 수행하였다. 4 헤마글루틴화 단위(4HAU)의 역가를 갖고 일라리아 카푸아의 실험실(Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Virologia, Padua, Italy)에 의해 제공된 A/치킨/이탤리/22A/98(H5N9) 균주로 감염시킨 등명화된 요막 액으로부터 기원하는 바이러스 현탁액 50 ㎕를 각 웰에 가하였다. 이를, 포스페이트 완충제 중에 0.5%의 암탉 적혈구 용액 50 ㎕를 가하기 전에 실험실 온도에서 1 시간 동안 배양되도록 두었다. +4 ℃에서 1 시간 동안 정치시킨 후에, 상기 시험을 판독하였다. 헤마글루틴화의 억제의 존재는 상기 미세 웰 바닥의 적색 점의 존재에 의해 반영되는 반면, 헤마글루틴화의 존재는 상기 미세 웰 중의 분홍색을 띤 무리의 존재에 의해 반영된다. 상기 IHA 항체 역가를 상기 미세 웰에서 헤마글루틴화가 관찰되지 않은 최종 희석비의 역으로 나타내었다.

3.2) 결과

3.2.1) 시험 1의 난황에서의 항-H5 반응의 분석

D0에서, 면역화되지 않은 그룹의 분석된 8 개 난황 중 8 개는 상기 IHA 시험에서 음성인 반면, 그룹 2로부터 기원하는 8 개 난황 중 6 개가 상기 IHA 시험에서 양성이었으며, 이는 항-H5 항체의 존재를 가리킨다.

D10에서, 면역화되지 않은 그룹의 분석된 4 개 난황 중 4 개는 상기 IHA 시험에서 음성인 반면, 그룹 2로부터 기원하는 4 개 난황 중 4 개가 상기 IHA 시험에서 양성이었다.

3.2.2) 시험 2의 난황 및 요막 액에서의 항-H5 반응의 분석

D10에서, 면역화되지 않은 그룹의 분석된 5 개 난황 중 5 개는 상기 IHA 시험에서 음성인 반면, 그룹 1로부터 기원하는 5 개 난황 중 4 개, 및 그룹 2로부터 기원하는 5 개 난황 중 4개가 상기 IHA 시험에서 양성이었으며, 이는 이들 그룹에서 항-H5 항체의 존재를 가리킨다. 상기 획득된 IHA 역가의 개별적인 값들을 표 5에 제공한다.

배 발생 후(D10)에 취한 계란의 난황에 대한 IHA 역가
난황	D10*
그룹 1 (vFR2211/불활성화된 백신 H5N9)	160
	80
	320
	80
	<5
그룹 2 (불활성화된 백신 H5N9/불활성화된 백신 H5N9)	80
	160
	40
	40
	<5
면역화되지 않은 그룹	<5
	<5
	<5
	<5
	<5
*: 상이한 난황들로부터 기원하는 D10에서의 역가들

다른 한편으로, 그룹 1 및 2로부터 기원하는 모든 요막 액들은 IHA 시험에서 음성이었으며, 이는 상기 요막 액 중에서 검출할 수 있는 H5N9 독감 바이러스의 헤마글루틴화를 억제하는 항체가 존재하지 않음을 의미한다.

3.2.3) 시험 3의 난황에서의 항-H5 반응의 분석

D10에서, 면역화되지 않은 그룹의 분석된 5 개 난황 중 5 개는 상기 IHA 시험에서 음성인 반면, 그룹 1로부터 기원하는 5 개 난황 중 5 개가 상기 IHA 시험에서 양성이었다.

상기 IHA 역가의 개별적인 값들을 표 6에 제공한다.

계란 기원의 함수로서 배 발생 후(D10)에 취한 계란의 난황에 대한 IHA 역가
난황	D10
그룹 1 (vFR2211/불활성화된 백신 H5N9)	80
	80
	160
	5
	320
면역화되지 않은 그룹	<5
	<5
	<5
	<5
	<5

결론적으로, 실시예 2 및 3의 결과를 근거로, 상기 3 개 시험의 난황에서 밝혀진 모계 항-H5N9 항체의 존재는 H5N1 또는 H5N9 균주에 의해 감염된 요막 액의 바이러스 생산성에 영향을 미치지 않았다.

실시예 4:

A/치킨/ 이탤리 /22A/98( H5N9 ) 백신 균주에 의해 면역화된 암탉의 혈청 반응 및 상기 면역화된 암탉으로부터의 계란 중에 존재하는 모계 항- H5 항체의 분석

혈액 샘플을 28 및 36 주령에서 그룹 1 및 2의 면역화된 암탉으로부터 취하였다. 상기 암탉들이 산란한 계란을 상기 난황 내로의 모계 항체의 전달의 중요성을 평가하기 위해 27 및 37 주째에 수거하였다. 상기 항-H5 항체 반응을, 항원으로서 상기 불활성화된 백신 균주와 상동인 A/치킨/이탤리/22A/98 H5N9 균주를 사용하는 헤마글루틴화 억제 시험에 의해 평가하였다. 결과를 표 7에서 log₁₀ 으로서 나타낸다.

면역화된 산란 암탉의 혈청 및 상기 암탉이 산란한 계란의 난황에서의 헤마글루틴화-억제 항체 역가(A/치킨/이탤리/22A/98 H5N9 항원)
	혈청	난황	혈청	난황
주령	28	27	36	37
G1	2.10 ±0.61 (15)*	1.96 ±0.94 (21)**	1.92 ±0.91 (15)	1.63 ±0.89 (10)
G2	2.20 ±0.62 (15)	1.81 ±0.88 (13)	2.26 ±0.65 (15)	1.43 ±0.89 (14)
* log₁₀ ± 표준 편차로서 나타낸, 헤마글루틴화-억제 항체 역가의 기하 평균(그룹 당 시험된 샘플의 수) ** 난황 상에서 시험된 최저 희석비는 1/10(1 log₁₀)이다; 평균 및 표준 편차의 계산을 위해서, 상기 1/10 희석비에서 음성인 계란의 값을 0.7 log₁₀에 놓았다.

그룹 1 및 2의 면역화된 암탉이 산란한 계란의 난황에서의 헤마글루틴화-억제 항체 역가(A/터키/위스콘신/68 H5N9 항원)
	난황
주령	27
G1	1.67 ± 0.79 (21)*
G2	1.39 ± 0.80 (13)
* log₁₀ ± 표준 편차로서 나타낸, 헤마글루틴화-억제 항체 역가의 기하 평균(그룹 당 시험된 샘플의 수); 시험된 최저 희석비는 1/10(1 log₁₀)이고; 평균 및 표준 편차의 계산을 위해서, 상기 1/10 희석비에서 음성인 계란의 값을 0.7 log₁₀에 놓았다.

상기 결과는 그룹 1 및 2의 면역화된 암탉이 산란한 계란의 난황 내로 상기 모계 항체가 전달되었음을 입증한다.

상기 난황에서의 동종 항-H5N9 항체 역가들(표 VII)은 이종 항-H5N9 역가(표 VIII)보다 크지만, 이러한 차이는 통계학적으로 의미가 없다.

실시예 5:

그룹 2의 불활성화된 H5N9 백신(A/치킨/ 이탤리 /22A/98 균주)으로 면역화된 암탉이 산란한 계란 상에서의 A/터키/위스콘신/68 H5N9 균주의 생산

5.1. 실시 프로토콜

불활성화된 H5N9 백신(A/치킨/이탤리/22A/98 균주)으로 3 및 17 주령에서 2 회 면역화된 그룹 2의 암탉으로부터의 계란(대략 220 내지 230)을 28 및 29 주째 동안 취하였다. 이들 계란을 조절된 온도(12 내지 15 ℃)에서 보관 후에 37 ℃에서 11일간 배양하였다. 상기 배들이 양호한 생육력을 갖는지를 확인하기 위해서 검란 후에, 상기 계란의 요막 강에 9.68 log₁₀ EID₅₀/㎖의 역가를 갖는 A/터키/위스콘신/68 H5N9 균주의 바이러스 모액의 희석물 0.2 ㎖(접종물)을 접종하였다. 대략 30 개 계란의 7 개 그룹이 형성되었다. 4 개의 그룹(G1 내지 G4)에 하기 희석비의 상기 접종물을 접종하였다: 10^-5, 10^-4, 10^-3 및 10^-2. 3 개의 다른 그룹(G5 내지 G7)을 상기 접종물의 10^-3 희석물로 접종하였다. 접종 후에, 상기 계란을 70% ± 10% 습도 하에 37 ℃ ± 1.5 ℃에서 배양하였다. 20 시간 동안 배양 후에, 상기 계란들을 상기 접종으로부터 유도된 죽은 계란을 제거하기 위해서 검란하고 이어서 상기 계란들을 동일한 조건 하에서 재배양하였다. 상기 접종 후 42 시간째에, 상기 계란들을 요막액의 수확 전에 저온에 두었다. 그룹 1 내지 4의 계란의 요막 액을 모았다(그룹당 하나의 요막 액 풀). 상기 계란의 4 개 그룹의 요막 액을 헤마글루틴화 단위 및 계란 감염 용량 50%(EID₅₀)의 항으로 적정하기 전에 -70 ℃에서 보관하였다.

5.2. 결과

결과를 표 9에 제공한다.

A/치킨/이탤리/22A/98 H5N9 균주를 함유하는 불활성화된 백신으로 면역화된 암탉으로부터 기원하는 계란 상에서 A/터키/위스콘신/68 H5N9 균주의 생산 후에 획득된 헤마글루틴화 및 감염 역가
그룹	접종물 희석	헤마글루틴화 단위의 역가(log₁₀)	감염 역가 EID₅₀ (log₁₀/ml)
1	10^-5	2.25	9.50
2	10^-4	2.40	9.33
3	10^-3	2.25	9.67
4	10^-2	2.40	9.88

상기 결과는 그룹들 간에 매우 유사한 역가를 보이며 따라서 상기 접종물의 희석 효과는 없다. 더욱 또한, 상기 획득된 역가는 매우 높으며 모계 항-H5N9 항체를 갖지 않는 계란 상에서 획득된 것에 필적할만하다(역사적 실험 데이터). 따라서 상기 결과는 시험된 조건 하에서, 상기 계란 중의 모계 항체의 존재가 동일한 서브유형의 독감 바이러스의 생산을 방해하지 않음을 입증한다.

SEQUENCE LISTING <110> Sanofi Pasteur MERIAL Limited <120> Method for producing flu virus <130> PM 0706 <140> 0757884 <141> 2007-09-26 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 564 <212> PRT <213> Avian influenza virus <220> <221> Sequence of the HA protein of avian influenza virus A/chicken/Indonesia/7/03 <222> (1)..(564) <223> Amino acid sequence encoded by the synthetic HA gene modified at the cleavage site <400> 1 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Leu Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Ile Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 340 345 350 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 355 360 365 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 370 375 380 Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 385 390 395 400 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu 405 410 415 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 420 425 430 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 435 440 445 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 450 455 460 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe 465 470 475 480 Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn 485 490 495 Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg 500 505 510 Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile 515 520 525 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 530 535 540 Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 545 550 555 560 Arg Ile Cys Ile <210> 2 <211> 7618 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> donor plasmid pJY1394.1 <400> 2 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtgacccttt 660 acaagaataa aagaagaaac aactgtgaaa tagtttataa atgtaattcg tatgcagaaa 720 acgataatat attttggtat gagaaatcta aaggagacat agtttgtata gacatgcgct 780 cttccgatga gatattcgat gcttttctaa tgtatcatat agctacaaga tatgcctatc 840 atgatgatga tatatatcta caaatagtgt tatattattc taataatcaa aatgttatat 900 cttatattac gaaaaataaa tacgttaagt atataagaaa taaaactaga gacgatattc 960 ataaagtaaa aatattagct ctagaagact ttacaacgga agaaatatat tgttggatta 1020 gtaatatata acagcgtagc tgcacggttt tgatcatttt ccaacaatat aaaccaatga 1080 aggaggacga ctcatcaaac ataaataaca ttcacggaaa atattcagta tcagatttat 1140 cacaagatga ttatgttatt gaatgtatag acggatcttt tgattcgatc aagtatagag 1200 atataaaggt tataataatg aagaataacg gttacgttaa ttgtagtaaa ttatgtaaaa 1260 tgcggaataa atacttttct agatggttgc gtctttctac ttctaaagca ttattagaca 1320 tttacaataa taagtcagta gataatgcta ttgttaaagt ctatggtaaa ggtaagaaac 1380 ttattataac aggattttat ctcaaacaaa atatgatacg ttatgttatt gagtggatag 1440 gggatgattt tacaaacgat atatacaaaa tgattaattt ctataatgcg ttattcggta 1500 acgatgaatt aaaaatagta tcctgtgaaa acactctatg cccgtttata gaacttggta 1560 gatgctatta tggtaaaaaa tgtaagtata tacacggaga tcaatgtgat atctgtggtc 1620 tatatatact acaccctacc gatattaacc aacgagtttc tcacaagaaa acttgtttag 1680 tagatagaga ttctttgatt gtgtttaaaa gaagtaccag taaaaagtgt ggcatatgca 1740 tagaagaaat aaacaaaaaa catatttccg aacagtattt tggaattctc ccaagttgta 1800 aacatatttt ttgcctatca tgtataagac gttgggcaga tactaccaga aatacagata 1860 ctgaaaatac gtgtcctgaa tgtagaatag tttttccttt cataataccc agtaggtatt 1920 ggatagataa taaatatgat aaaaaaatat tatataatag atataagaaa atgattttta 1980 caaaaatacc tataagaaca ataaaaatat aattacattt acggaaaata gctggtttta 2040 gtttaccaac ttagagtaat tatcatattg aatctatatt gctaattagc taataaaaac 2100 ccgggttaat taattagtca tcaggcaggg cgagaacgag actatctgct cgttaattaa 2160 ttagagcttc tttattctat acttaaaaag tgaaaataaa tacaaaggtt cttgagggtt 2220 gtgttaaatt gaaagcgaga aataatcata aattatttca ttatcgcgat atccgttaag 2280 tttgtatcgt aatggagaaa atcgtgctgc tgctggccat cgtgagcctg gtgaaaagcg 2340 atcagatctg catcggctac cacgccaaca acagcacaga gcaagtggac acaatcatgg 2400 aaaagaacgt gaccgtgaca cacgcccagg acatcctgga aaagacacac aacgggaagc 2460 tgtgcgatct ggatggagtg aagcctctga tcctgagaga ttgcagcgtg gccggatggc 2520 tgctggggaa cccaatgtgc gacgaattca tcaacgtgcc cgaatggagc tacatcgtgg 2580 agaaggccaa cccagccaac gacctgtgct acccagggaa cctgaacgac tacgaagaac 2640 tgaaacacct gctgagcaga atcaaccact ttgagaaaat ccagatcatc cccaaaagca 2700 gctggtccga tcacgaagcc agcagcggag tgagcagcgc ctgcccatac cagggaaagt 2760 ccagcttttt tagaaacgtg gtgtggctga tcaaaaagaa cagcgcctac ccaacaatca 2820 agagaagcta caacaacacc aaccaggaag atctgctggt gctgtggggg atccaccacc 2880 ctaacgatgc cgccgagcag acaaggctgt accagaaccc aaccacctac atctccgtgg 2940 ggacaagcac actgaaccag agactggtgc caaaaatcgc catcagatcc aaagtgaacg 3000 ggcagagcgg aagaatggag ttcttctgga caatcctgaa acccaacgat gccatcaact 3060 tcgagagcaa cggaaacttc atcgccccag aatacgccta caaaatcgtg aagaaagggg 3120 acagcgccat catgaaaagc gaactggaat acggcaactg caacaccaag tgccagaccc 3180 caatgggggc catcaacagc agcatgccat tccacaacat ccaccctctg accatcgggg 3240 aatgccccaa atacgtgaaa agcaacagac tggtgctggc caccgggctg agaaacagcc 3300 ctcagagaga gaccagagga ctgtttggag ccatcgccgg ctttatcgag ggaggatggc 3360 agggaatggt ggatggctgg tacggatacc accacagcaa cgagcagggg agcggatacg 3420 ccgccgacaa agaatccacc cagaaggcca tcgacggcgt gaccaacaaa gtgaacagca 3480 tcatcgacaa aatgaacacc cagtttgagg ccgtgggaag ggagtttaac aacctggaaa 3540 ggagaatcga gaacctgaac aagaagatgg aggacggatt cctggatgtg tggacctaca 3600 acgccgaact gctggtgctg atggaaaacg agagaaccct ggactttcac gacagcaacg 3660 tgaagaacct gtacgacaaa gtgaggctgc agctgaggga taacgccaag gagctgggca 3720 acggctgctt cgagttctac cacaaatgcg ataacgaatg catggaaagc atcagaaacg 3780 gaacctacaa ctacccccag tacagcgaag aagccagact gaaaagagaa gaaatctccg 3840 gagtgaaact ggaatccatc ggaacctacc agatcctgag catctacagc acagtggcct 3900 cctccctggc cctggccatc atgatggccg gactgagcct gtggatgtgc tccaacggaa 3960 gcctgcagtg cagaatctgc atctgactcg agtttttatt gactagttaa tcataagata 4020 aataatatac agcattgtaa ccatcgtcat ccgttatacg gggaataata ttaccataca 4080 gtattattaa attttcttac gaagaatata gatcggtatt tatcgttagt ttattttaca 4140 tttattaatt aaacatgtct actattacct gttatggaaa tgacaaattt agttatataa 4200 tttatgataa aattaagata ataataatga aatcaaataa ttatgtaaat gctactagat 4260 tatgtgaatt acgaggaaga aagtttacga actggaaaaa attaagtgaa tctaaaatat 4320 tagtcgataa tgtaaaaaaa ataaatgata aaactaacca gttaaaaacg gatatgatta 4380 tatacgttaa ggatattgat cataaaggaa gagatacttg cggttactat gtacaccaag 4440 atctggtatc ttctatatca aattggatat ctccgttatt cgccgttaag gtaaataaaa 4500 ttattaacta ttatatatgt aatgaatatg atatacgact tagcgaaatg gaatctgata 4560 tgacagaagt aatagatgta gttgataaat tagtaggagg atacaatgat gaaatagcag 4620 aaataatata tttgtttaat aaatttatag aaaaatatat tgctaacata tcgttatcaa 4680 ctgaattatc tagtatatta aataatttta taaattttaa taaaaaatac aataacgaca 4740 taaaagatat taaatcttta attcttgatc tgaaaaacac atctataaaa ctagataaaa 4800 agttattcga taaagataat aatgaatcga acgatgaaaa attggaaaca gaagttgata 4860 agctaatttt tttcatctaa atagtattat tttattgaag tacgaagttt tacgttagat 4920 aaataataaa ggtcgatttt tattttgtta aatatcaaat atgtcattat ctgataaaga 4980 tacaaaaaca cacggtgatt atcaaccatc taacgaacag atattacaaa aaatacgtcg 5040 gactatggaa aacgaagctg atagcctcaa tagaagaagc attaaagaaa ttgttgtaga 5100 tgttatgaag aattgggatc atcctctcaa cgaagaaata gataaagttc taaactggaa 5160 aaatgataca ttaaacgatt tagatcatct aaatacagat gataatatta aggaaatcat 5220 acaatgtctg attagagaat ttgcgtttaa aaagatcaat tctattatgt atagttatgc 5280 tatggtaaaa ctcaattcag ataacgaaac attgaaagat aaaattaagg attattttat 5340 agaaactatt cttaaagaca aacgtggtta taaacaaaag ccattaccct agagcggccg 5400 ccaccgcggt ggagctccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaatttc gagcttggcg 5460 taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 5520 atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 5580 ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 5640 taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 5700 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 5760 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 5820 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 5880 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 5940 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 6000 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 6060 tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 6120 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 6180 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 6240 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 6300 tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 6360 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 6420 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6480 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 6540 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 6600 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 6660 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 6720 acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 6780 tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 6840 ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 6900 agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 6960 tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 7020 acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 7080 agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 7140 actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 7200 tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 7260 gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 7320 ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 7380 tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 7440 aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 7500 tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 7560 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccac 7618 <210> 3 <211> 4885 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence of the insert of the plasmid pJY1394.1 <220> <221> partial sequence of the cloning plasmid comprising the sequence of the M13R primer <222> (1)..(53) <220> <221> sequence of the "left arm" flanking the F8 insertion locus in the genome of the TROVAC fowlpox vector <222> (54)..(1483) <220> <221> linker sequence between the left arm and the H6 promoter <222> (1484)..(1568) <220> <221> <222> (1569)..(1692) <220> <221> sequence of the modified synthetic HA gene of the A/chicken/Indonesia/7/03 strain <222> (1693)..(3387) <220> <221> linker sequence between the HA gene and the right arm <222> (3388)..(3414) <223> sequence comprising a fowlpox early gene TTTTTAT transcription stop sequence <220> <221> sequence of the "right arm" flanking the F8 insertion locus in thegenome of the TROVAC fowlpox vector <222> (3415)..(4790) <220> <221> partial sequence of the cloning plasmid comprising the sequence of the M13R primer <222> (4791)..(4885) <400> 3 gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggtgaccctt 60 tacaagaata aaagaagaaa caactgtgaa atagtttata aatgtaattc gtatgcagaa 120 aacgataata tattttggta tgagaaatct aaaggagaca tagtttgtat agacatgcgc 180 tcttccgatg agatattcga tgcttttcta atgtatcata tagctacaag atatgcctat 240 catgatgatg atatatatct acaaatagtg ttatattatt ctaataatca aaatgttata 300 tcttatatta cgaaaaataa atacgttaag tatataagaa ataaaactag agacgatatt 360 cataaagtaa aaatattagc tctagaagac tttacaacgg aagaaatata ttgttggatt 420 agtaatatat aacagcgtag ctgcacggtt ttgatcattt tccaacaata taaaccaatg 480 aaggaggacg actcatcaaa cataaataac attcacggaa aatattcagt atcagattta 540 tcacaagatg attatgttat tgaatgtata gacggatctt ttgattcgat caagtataga 600 gatataaagg ttataataat gaagaataac ggttacgtta attgtagtaa attatgtaaa 660 atgcggaata aatacttttc tagatggttg cgtctttcta cttctaaagc attattagac 720 atttacaata ataagtcagt agataatgct attgttaaag tctatggtaa aggtaagaaa 780 cttattataa caggatttta tctcaaacaa aatatgatac gttatgttat tgagtggata 840 ggggatgatt ttacaaacga tatatacaaa atgattaatt tctataatgc gttattcggt 900 aacgatgaat taaaaatagt atcctgtgaa aacactctat gcccgtttat agaacttggt 960 agatgctatt atggtaaaaa atgtaagtat atacacggag atcaatgtga tatctgtggt 1020 ctatatatac tacaccctac cgatattaac caacgagttt ctcacaagaa aacttgttta 1080 gtagatagag attctttgat tgtgtttaaa agaagtacca gtaaaaagtg tggcatatgc 1140 atagaagaaa taaacaaaaa acatatttcc gaacagtatt ttggaattct cccaagttgt 1200 aaacatattt tttgcctatc atgtataaga cgttgggcag atactaccag aaatacagat 1260 actgaaaata cgtgtcctga atgtagaata gtttttcctt tcataatacc cagtaggtat 1320 tggatagata ataaatatga taaaaaaata ttatataata gatataagaa aatgattttt 1380 acaaaaatac ctataagaac aataaaaata taattacatt tacggaaaat agctggtttt 1440 agtttaccaa cttagagtaa ttatcatatt gaatctatat tgctaattag ctaataaaaa 1500 cccgggttaa ttaattagtc atcaggcagg gcgagaacga gactatctgc tcgttaatta 1560 attagagctt ctttattcta tacttaaaaa gtgaaaataa atacaaaggt tcttgagggt 1620 tgtgttaaat tgaaagcgag aaataatcat aaattatttc attatcgcga tatccgttaa 1680 gtttgtatcg taatggagaa aatcgtgctg ctgctggcca tcgtgagcct ggtgaaaagc 1740 gatcagatct gcatcggcta ccacgccaac aacagcacag agcaagtgga cacaatcatg 1800 gaaaagaacg tgaccgtgac acacgcccag gacatcctgg aaaagacaca caacgggaag 1860 ctgtgcgatc tggatggagt gaagcctctg atcctgagag attgcagcgt ggccggatgg 1920 ctgctgggga acccaatgtg cgacgaattc atcaacgtgc ccgaatggag ctacatcgtg 1980 gagaaggcca acccagccaa cgacctgtgc tacccaggga acctgaacga ctacgaagaa 2040 ctgaaacacc tgctgagcag aatcaaccac tttgagaaaa tccagatcat ccccaaaagc 2100 agctggtccg atcacgaagc cagcagcgga gtgagcagcg cctgcccata ccagggaaag 2160 tccagctttt ttagaaacgt ggtgtggctg atcaaaaaga acagcgccta cccaacaatc 2220 aagagaagct acaacaacac caaccaggaa gatctgctgg tgctgtgggg gatccaccac 2280 cctaacgatg ccgccgagca gacaaggctg taccagaacc caaccaccta catctccgtg 2340 gggacaagca cactgaacca gagactggtg ccaaaaatcg ccatcagatc caaagtgaac 2400 gggcagagcg gaagaatgga gttcttctgg acaatcctga aacccaacga tgccatcaac 2460 ttcgagagca acggaaactt catcgcccca gaatacgcct acaaaatcgt gaagaaaggg 2520 gacagcgcca tcatgaaaag cgaactggaa tacggcaact gcaacaccaa gtgccagacc 2580 ccaatggggg ccatcaacag cagcatgcca ttccacaaca tccaccctct gaccatcggg 2640 gaatgcccca aatacgtgaa aagcaacaga ctggtgctgg ccaccgggct gagaaacagc 2700 cctcagagag agaccagagg actgtttgga gccatcgccg gctttatcga gggaggatgg 2760 cagggaatgg tggatggctg gtacggatac caccacagca acgagcaggg gagcggatac 2820 gccgccgaca aagaatccac ccagaaggcc atcgacggcg tgaccaacaa agtgaacagc 2880 atcatcgaca aaatgaacac ccagtttgag gccgtgggaa gggagtttaa caacctggaa 2940 aggagaatcg agaacctgaa caagaagatg gaggacggat tcctggatgt gtggacctac 3000 aacgccgaac tgctggtgct gatggaaaac gagagaaccc tggactttca cgacagcaac 3060 gtgaagaacc tgtacgacaa agtgaggctg cagctgaggg ataacgccaa ggagctgggc 3120 aacggctgct tcgagttcta ccacaaatgc gataacgaat gcatggaaag catcagaaac 3180 ggaacctaca actaccccca gtacagcgaa gaagccagac tgaaaagaga agaaatctcc 3240 ggagtgaaac tggaatccat cggaacctac cagatcctga gcatctacag cacagtggcc 3300 tcctccctgg ccctggccat catgatggcc ggactgagcc tgtggatgtg ctccaacgga 3360 agcctgcagt gcagaatctg catctgactc gagtttttat tgactagtta atcataagat 3420 aaataatata cagcattgta accatcgtca tccgttatac ggggaataat attaccatac 3480 agtattatta aattttctta cgaagaatat agatcggtat ttatcgttag tttattttac 3540 atttattaat taaacatgtc tactattacc tgttatggaa atgacaaatt tagttatata 3600 atttatgata aaattaagat aataataatg aaatcaaata attatgtaaa tgctactaga 3660 ttatgtgaat tacgaggaag aaagtttacg aactggaaaa aattaagtga atctaaaata 3720 ttagtcgata atgtaaaaaa aataaatgat aaaactaacc agttaaaaac ggatatgatt 3780 atatacgtta aggatattga tcataaagga agagatactt gcggttacta tgtacaccaa 3840 gatctggtat cttctatatc aaattggata tctccgttat tcgccgttaa ggtaaataaa 3900 attattaact attatatatg taatgaatat gatatacgac ttagcgaaat ggaatctgat 3960 atgacagaag taatagatgt agttgataaa ttagtaggag gatacaatga tgaaatagca 4020 gaaataatat atttgtttaa taaatttata gaaaaatata ttgctaacat atcgttatca 4080 actgaattat ctagtatatt aaataatttt ataaatttta ataaaaaata caataacgac 4140 ataaaagata ttaaatcttt aattcttgat ctgaaaaaca catctataaa actagataaa 4200 aagttattcg ataaagataa taatgaatcg aacgatgaaa aattggaaac agaagttgat 4260 aagctaattt ttttcatcta aatagtatta ttttattgaa gtacgaagtt ttacgttaga 4320 taaataataa aggtcgattt ttattttgtt aaatatcaaa tatgtcatta tctgataaag 4380 atacaaaaac acacggtgat tatcaaccat ctaacgaaca gatattacaa aaaatacgtc 4440 ggactatgga aaacgaagct gatagcctca atagaagaag cattaaagaa attgttgtag 4500 atgttatgaa gaattgggat catcctctca acgaagaaat agataaagtt ctaaactgga 4560 aaaatgatac attaaacgat ttagatcatc taaatacaga tgataatatt aaggaaatca 4620 tacaatgtct gattagagaa tttgcgttta aaaagatcaa ttctattatg tatagttatg 4680 ctatggtaaa actcaattca gataacgaaa cattgaaaga taaaattaag gattatttta 4740 tagaaactat tcttaaagac aaacgtggtt ataaacaaaa gccattaccc tagagcggcc 4800 gccaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattt cgagcttggc 4860 gtaatcatgg tcatagctgt ttcct 4885

Claims

독감 바이러스의 제조 방법으로서,
a) 독감 백신을 암탉에게 투여하여 암탉을 면역화시키고,
b) 상기 면역화된 암탉의 하나 이상의 계란에서 배 발생(embryogenesis)을 촉발하여 하나 이상의 발육계란(embryonated egg)을 얻고,
c) 독감 바이러스를 상기 발육계란의 요막 강에 접종함으로써 상기 하나 이상의 발육계란을 감염시키고,
d) 상기 독감 바이러스의 복제를 허용하는 온도 및 습도 조건 하에서 상기 감염된 발육계란을 배양하고,
e) 상기 요막 강으로부터 상기 독감 바이러스를 함유하는 요막 액을 수확함
에 따른 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 요막 액으로부터 상기 독감 바이러스의 정제 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
d) 단계 이후 상기 독감 바이러스의 불활성화 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 요막 액으로부터 상기 독감 바이러스의 정제 단계, 및 상기 요막 액으로부터 수확된 독감 바이러스를 불활성화 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 얻어진 독감 바이러스를 포함하는 독감 백신.
제 5 항에 있어서,
상기 독감 백신은 암탉을 조류 독감에 대해 보호하는 독감 백신.
제 5 항에 있어서,
상기 독감 백신이 단백질의 형태 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 형태로 독감 바이러스의 헤마글루티닌을 포함하는 독감 백신.
제 5 항에 있어서,
상기 독감 백신이 불활성화된 전체 독감 바이러스를 함유하는 독감 백신.
삭제
제 5 항에 있어서,
상기 독감 백신이 항원보강제를 또한 함유하는 독감 백신.
제 5 항에 있어서,
상기 독감 백신이 약독화된 독감 바이러스를 함유하는 독감 백신.
제 5 항에 있어서,
상기 독감 백신이 독감 바이러스의 헤마글루티닌을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 독감 백신.
제 5 항에 있어서,
상기 독감 백신은 폭스바이러스 벡터를 포함하는 독감 백신.
제 12 항에 있어서,
상기 벡터가 독감 바이러스의 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자를 또한 포함하는 독감 백신.
제 13 항에 있어서,
상기 벡터가 독감 바이러스의 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자를 또한 포함하는 독감 백신.
제 12 항에 있어서,
상기 독감 백신은 항원보강제를 또한 함유하는 독감 백신.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 a) 단계에서 암탉에게 투여되는 독감 백신에 포함되는 독감 바이러스가 가진 헤마글루티닌의 서브유형과,
상기 c) 단계에서 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스가 가진 헤마글루티닌의 서브유형이 서로 다른 것인 독감 바이러스의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 a) 단계에서 상기 암탉에게 투여되는 독감 백신에 포함되는 독감 바이러스의 서브유형과, 상기 c) 단계에서 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스의 서브유형은 서로 동일한 것인 독감 바이러스의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 a) 단계에서 상기 암탉에게 투여되는 독감 백신에 포함되는 독감 바이러스와,
상기 c) 단계에서 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스는 서로 동일한 것인 독감 바이러스의 제조 방법.
삭제
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 a) 단계에서 상기 암탉에게 투여되는 독감 백신에 포함되는 독감 바이러스, 및 상기 c) 단계에서 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스는 H5, H6, H7, 또는 H9 서브유형을 가지는 독감 바이러스의 제조 방법.
제 21 항에 있어서,
상기 a) 단계에서 상기 암탉에게 투여되는 독감 백신에 포함되는 독감 바이러스, 및 상기 c) 단계에서 상기 면역화된 암탉으로부터의 발육계란의 요막 강을 감염시키는데 사용되는 상기 독감 바이러스 서브유형은 H5 또는 H7인 독감 바이러스의 제조 방법.
삭제
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말과, 돼지과, 개과, 고양이과, 족제비, 및 조류 종의 일원들의 그룹 중에서 선택된 동물에게서 독감을 예방하기 위해 사용되는 제5항의 독감 백신.