CN1300172C - 一种抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体,特征在于该抗体为马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体,同时本发明公开该抗体的制备方法。本发明抗体能特异消灭SARS-CoV,对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体,属于生物制药领域。
背景技术
世界卫生组织在今年3月12日发出关于非典型肺炎(atypicalpneumonia)的全球性警告之后,随后命名为严重急性呼吸综合征(SevereAcute Respiratory Syndrome,SARS)。在WHO的高度重视、协调和组织下,引起SARS的病原体很快被确认为一种新的或变异的冠状病毒,并相应命名为SARS-CoV。自SARS爆发后很快在全球传播,现已蔓延到世界30多个国家和地区,严重地影响人们的健康和生命,成为21世纪初最危害人类的头号大敌。马抗血清(又叫马抗免疫球蛋白)自古以来是用于重要病原体感染的一种有效的应急治疗措施,至今至少有7种抗血清在临床广泛应用,发挥重要的治疗和预防传染病的作用。马抗血清发展经历了传统的整个抗体分子,发展到今天有效去掉能引起毒副作用的Fc段抗体分子和其它血浆杂蛋白分子,获得具有与病原体抗原特异结合的高纯度F(ab′)2治疗抗体,达到消灭病原体的效果。基于香港、新加坡和我国大陆报道针对SARS恢复期病人的血清具有治疗SARS的作用,但SARS恢复期病人血清的广泛应用存在一定的问题,并且人们对SARS-CoV的认识还很浮浅,特别是在安全性等方面存在一定的问题,制约其应用和发展。
因此,研制有治疗与预防SARS的马抗SARS-CoV免疫球蛋白,是非常有价值的治疗性和预防性抗体药物。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种新型的用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体;本发明的另一个目的在于公开制备马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的方法。
一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体,是马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体。
本发明马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的制备包括以下步骤:
1)灭活纯化的SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹,免疫四次、间隔10天免疫一次,试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800,测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800,并且不同的SARS-CoV标准毒株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性;
2)采集马抗SARS-CoV血浆,用无热源2倍蒸馏水稀释加入21%饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G(IgG),用无热源蒸馏水恢复原体积再用30%饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG,先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9%氯化钠盐水用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白,超滤液为纯化的马抗SARS-CoV IgG;
3)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58℃、30min,用帆布过滤去Fc段,滤液为初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体;
4)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基疏水层析(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow),用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱,20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液,再用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩,得纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体。
本发明制备的纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体可制备成马抗SARS-CoV免疫球蛋白注射剂型和黏膜喷雾剂型成品。
本发明所用纯化的灭活SARS-CoV可以通过如下步骤制得:
1)绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏、培养,取细胞种子库冻存Vero细胞株,用DMEM培养基并加入10%小牛血清培养,提供培养SARS-CoV的Vero细胞;
2)SARS冠状病毒(SARS-CoV)滴定,对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV,扩增培养SARS-CoV,采用组织培养测定SARS-CoV病毒的毒力,其半数感染量(TCID50)为106-108,对滴定的SARS-CoV分装冻存;
3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV,用无血清DMEM培养SARS-CoV,生产SARS-CoV;
4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液,反复冻融三次(冰冻-37℃)或不冻融,收集SARS-CoV细胞培养液;
5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯,4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV,取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代,检测SARS-CoV灭活效果;
6)灭活的SARS-CoV培养液,4℃、离心12000rpm 30min,弃沉淀杂蛋白,上清为SARS-CoV液;
7)用截留分子量30万的超滤柱超滤SARS-CoV液,浓缩和去杂蛋白,滤液为粗制灭活的SARS-CoV;
8)对粗制灭活的SARS-CoV上Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱,开始缓冲液是0.1MPBS PH7.0缓冲液,用100mM PBS PH7.0洗脱,收集SARS-CoV,合并浓缩收集初步纯化的SARS-CoV;
9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析,用100mM PB,PH7.2液平衡并将病毒吸附在柱上、用100mM PB,PH7.2,0.35M NaCl洗脱,收集SARS-CoV峰,合并浓缩收集纯化的SARS-CoV;
10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析,用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55%、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92%;
11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析,用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85%、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5%、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml;
12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析,用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U,降低到0.8ng/U,HPLC显示病毒纯度为97%;采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5%;用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml;SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带,并与恢复期SARS病人的血清发生反应,纯化灭活的SARS-CoV分装放-70℃保存。
本发明利用分离的SARS-CoV经培养、灭活、纯化后免疫健康马匹,产生高效价中和SARS-CoV的抗血清,去除能引起副作用的Fc片段,制备马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体,能特异消灭SARS-CoV,对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果;纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体对SARS-CoV具有很好的特异性及灵敏性。
以下实验例进步说明本发明。
实验例1 精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的鉴定
1)精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体和纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体,采用对流电泳抗体效价达到1∶128以上、间接酶联免疫抗体效价高达1∶12800以上;
2)精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的中和效价的滴定,是首先在Vero细胞上对SARS-CoV滴定确定滴度为106-8,选择200TCID50按抗体稀释方法检测马抗SARS-CoV血浆、精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的中和效价。或用蚀斑减数中和实验方法检测马抗SARS-CoV血浆、精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的中和效价在1∶10000以上;
实验例2 精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白治疗和预防效果的评价
1)建立SARS-CoV感染Vero-6细胞模型,在16孔细胞培养板加入4×105/孔Vero-6,培养24h加入100CTID50BJ01 SARS-CoV200ul,24h后加入0.1mg/100mL马抗SARS-CoV免疫球蛋白治疗SARS-CoV感染的细胞,观察48h经细胞病变法、MTT法和空斑减数法检测马抗SARS-CoV免疫球蛋白具有很好治疗SARS-CoV的效果;
2)马抗SARS-CoV免疫球蛋白0.1mg/100mL加入4×105/孔Vero-6细胞/16孔细胞培养板,12h用100CTID50BJ01 SARS-CoV200ul感染Vero-6细胞,观察72h经细胞病变法、MTT法和空斑减数法检测精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白具有很好预防SARS-CoV的效果;
3)通过对每只恒河猴1×108滴鼻感染BJ01株SARS-CoV建立了感染模型,感染后6h、12h、24h、48h分别肌肉注射2mg/2mL(100IU),观察15天解剖,从症状表现治疗组减轻到无、白细胞及免疫细胞逐渐恢复正常。从病原学观察到治疗组肺、肝、肾、脑、胸腺、脾脏、淋巴结、拭胭子、血液、粪便等部位分离病原体,及PCR检测S、N、M、E和X4主要病原体蛋白基因,经病毒培养和PCR扩增病原体均为阴性。从病理改变观察到治疗组肺、肝组织病理改变有不同程度的好转,并产生有效的抗SARS-CoV抗体。说明马抗SARS-CoV免疫球蛋白在SARS-CoV感染的动物有明显治疗SARS的效果;
4)马抗SARS-CoV免疫球蛋白黏膜喷雾剂3mg/3mL(150IU)给药,每12h一次,共用4次给恒河猴预防,再用1×108滴鼻感染BJ01株SARS-CoV感染攻击恒河猴,观察30天预防组恒河猴没有出现症状、不发烧、血细胞正常,发病。从病原学观察到预防组肺、肝、肾、脑、胸腺、脾脏、淋巴结、拭胭子、血液、粪便等部位分离病原体,及PCR检测S、N、M、E和X4主要病原体蛋白基因,经病毒培养和PCR扩增病原体均为阴性。从病理改变观察到治疗组肺、肝组织病理改变有不同程度的好转,并产生具有中和活性的抗SARS-CoV抗体。说明马抗SARS-CoV免疫球蛋白在SARS-CoV感染的动物有明显预防SARS的效果。
下述实施例均能达到上述实验例的效果。
实施例1 马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体制备
1、SARS-CoV的培养、灭活及纯化:
1)绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏、培养,取细胞种子库冻存Vero细胞株,用DMEM培养基并加入10%小牛血清培养,提供培养SARS-CoV的Vero细胞;
2)SARS冠状病毒(SARS-CoV)滴定,对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV,扩增培养SARS-CoV,采用组织培养测定SARS-CoV病毒的毒力,其半数感染量(TCID50)为106-108,对滴定的SARS-CoV分装冻存;
3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV,用无血清DMEM培养SARS-CoV,生产SARS-CoV;
4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液,反复冻融三次(冰冻-37℃)或不冻融,收集SARS-CoV细胞培养液;
5)向SARS-CoV培养液加入1/4000的β-丙内酯(1/2000-1/8000均可),4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV,取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代,检测SARS-CoV灭活效果;
6)灭活的SARS-CoV培养液,4℃、离心12000rpm 30min,弃沉淀杂蛋白,上清为SARS-CoV液;
7)用截留分子量30万的超滤柱超滤SARS-CoV液,浓缩和去杂蛋白,滤液为粗制灭活的SARS-CoV;
8)对粗制灭活的SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子筛纯化,对粗制灭活的SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱层析,0.01Mtris-HCl PH7.4缓冲液洗脱,收集SARS-CoV,合并浓缩收集初步纯化的SARS-CoV;
9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析纯化,用0.03M Nacl、50mMTris PH8.0缓冲液洗脱,收集SARS-CoV峰,合并浓缩收集纯化的SARS-CoV;
10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析,用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55%、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92%;
11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析,用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85%、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5%、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml;
12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析,用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U,降低到0.8ng/U,HPLC显示病毒纯度为97%;采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5%;用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml;SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带,并与恢复期SARS病人的血清发生反应,纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。
2、马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体制备
1)选用的SARS-CoV是我们所分离并经国家生物制品检定所鉴定的标准毒株,所用Vero细胞是来自细胞生产工厂,进行SARS-CoV培养、灭活和纯化,制备灭活纯化的SARS-CoV抗原;
2)灭活纯化的SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹,免疫四次、间隔10天免疫一次,试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800,测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800,并且不同的SARS-CoV标准毒株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性;
3)采集马抗SARS-CoV血浆,用无热源2倍蒸馏水稀释加入21%饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G(IgG),用无热源蒸馏水恢复原体积再用30%饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG,先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9%氯化钠盐水用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白,超滤液为纯化的马抗SARS-CoV IgG;
4)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58℃、30min,用帆布过滤去Fc段,滤液为初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体;
5)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基疏水层析(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow),用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱,20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液,再用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩,得纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体;
6)纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体加入适量硫柳汞防腐剂,用生理盐水稀释所需含量0.22um除菌分装,分别制备马抗SARS-CoV免疫球蛋白注射剂型和黏膜喷雾剂型成品;
7)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品用2%蛋白浓度做琼脂糖电泳检测,没有白蛋白成分、通过10%SDS-PAGE检测F(ab′)2纯度在90%以上,抗体中和效价细胞病变法、空斑减数法1∶2000/mg蛋白,按现有国家对人抗SARS-CoV免疫球蛋白注射液1∶40/mg为1个治疗单位(1IU),则马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品50IU/mg;
8)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品的理化性质检测,蛋白含量3.0g/L、PH值6.8、氯化钠含量8.5g/L、硫酸铵含量0.5g/L、硫柳汞0.06g/L、冻干制剂水分含量2.0%,均符合生物制品的规定;
9)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品在兔和小鼠体内进行热源、异常毒性观察,实验证实马抗SARS-CoV免疫球蛋白无热源、异常毒性;
10)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品放4℃、37℃观察稳定性,实验证实马抗SARS-CoV免疫球蛋白放置6个月以上中和效价不减,有很好的稳定性;
11)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品,通过免疫组化证实与正常人心、肝、肺、肾、脑、脾、淋巴结、肠组织器官没有交叉反应,证实马抗SARS-CoV免疫球蛋白没有抗人的组织成分,用于人的防治是安全的。
Claims (1)
1、一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体,其特征在于该抗体是由如下制备方法制成的:
1)灭活纯化的SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹,免疫四次、间隔10天免疫一次,试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800,测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800,并且不同的SARS-CoV标准毒株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性;
2)采集马抗SARS-CoV血浆,用无热源2倍蒸馏水稀释加入21%饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G,用无热源蒸馏水恢复原体积再用30%饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG,先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9%氯化钠盐水用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白,超滤液为纯化的马抗SARS-CoV IgG;
3)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58℃、30min,用帆布过滤去Fc段,滤液为初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体;
4)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基疏水层析柱Phenyl Sepharose 6 Fast Flow,用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱,20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液,再用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩,得纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体;
其中灭活纯化的SARS-CoV由如下方法制得:
1)绿猴肾细胞的复苏、培养,取细胞种子库冻存Vero细胞株,用DMEM培养基并加入10%小牛血清培养,提供培养SARS-CoV的Vero细胞;
2)SARS冠状病毒滴定,对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV,扩增培养SARS-CoV,采用组织培养测定SARS-CoV病毒的毒力,其半数感染量为106-108,对滴定的SARS-CoV分装冻存;
3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV,用无血清DMEM培养SARS-CoV,生产SARS-CoV;
4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液,反复冻融三次,-37℃冰冻或不冻融,收集SARS-CoV细胞培养液;
5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯,4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV,取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代,检测SARS-CoV灭活效果;
6)灭活的SARS-CoV培养液,4℃、离心12000rpm 30min,弃沉淀杂蛋白,上清为SARS-CoV液;
7)用截留分子量为30万的超滤柱超滤SARS-CoV液,浓缩和去杂蛋白,滤液为粗制灭活的SARS-CoV;
8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱,开始缓冲液是0.1MPBS PH7.0缓冲液,用100mM PBS PH7.0洗脱,收集SARS-CoV,合并浓缩收集初步纯化的SARS-CoV;
9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析,用100mM PB,PH7.2液平衡并将病毒吸附在柱上、用100mM PB,PH7.2,0.35M NaCl洗脱,收集SARS-CoV峰,合并浓缩收集纯化的SARS-CoV;
10)纯化灭活的SARS-CoV分装放-70℃保存。
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