CN1846713A - 预防和治疗脓毒症的蛇毒提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同活化C蛋白功能相似的蛇毒提取物,该提取物在体外既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物,在体内它能显著降低脓毒症试验动物的死亡率。本发明还公开了该提取物的制备方法,蛇毒的分离纯化,选自离子交换层析技术、凝胶过滤层析技术、亲和层析技术、疏水层析技术或离心、超滤、盐析、有机溶剂沉淀技术中的一种,将收集液进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定和水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定,取同时具有二者活性的组分。该蛇毒提取物可用于制备预防和治疗脓毒症的药物,同活化C蛋白相比,具有来源方便,生产简单易行,成本低等优点,有非常重要的经济和社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及采用一种用于预防和治疗脓毒症的蛇毒提取物,具体地说是一种同活化C蛋白功能相似的用于预防和治疗脓毒症的提取物。
背景技术
脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症,是导致人类死亡的一常见病种,它有极高的发病率和死亡率。(Alerti C,Brun-Buission C,Burchardi H,etal.Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentercohort study[J].Intensive Care Med,2002,28(2):108-121.)脓毒症是指由感染或者有高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合症,其病原菌包括细菌、真菌、寄生虫及病毒等,临床症状包括但不限于(1)体温>38℃或<36℃;(2)心率>90次/分钟;呼吸>20次/分钟或PaCO2<32mm Hg;(4)外周血白细胞计数>12×109/L,<4×109/L或成熟粒细胞>10%;(5)器官功能障碍,高灌注或高血压。(王正国.脓毒症研究概况[J].中华创伤杂志,2003,19(1):5-7.)
自20世纪80年代以来,随着对脓毒症发病机制研究的深入,开发各种旨在抑制脓毒症形成的药物也随即兴起,并进行了80多项临床试验,其中几个有希望的药物进行了III期临床试验,但是遗憾的是仅有一个药物(活化C蛋白)被开发成功。(Polderman KH and Girbes ARJ.Drug intervention trials in sepsis:divergent results[J].Lancet,2004,363:1721-1723.)。活化C蛋白(商品名为Xigris)的开发成功为新的治疗严重脓毒症药物的开发提供了借鉴,特别是在天然产物中寻找同其功能相似的物质,在此称为活化C蛋白样酶(activated protein C like enzyme)。由于在静脉血栓病人中约有64%的患者对活化C蛋白是抗性的,所以这部分病人患脓毒症后再用Xigris治疗肯定是无效的,而活化C蛋白样物质就可以弥补Xigris的不足。另外,Xigris的生产过程复杂,生产成本较高,每个病人一个疗程的费用约为6800美元,如此高的价格限制了它在临床上的广泛应用。以上这些原因使得活化C蛋白样酶的寻找和开发有着非常重要的经济和社会意义。(冯军,赵文杰.活化C蛋白[J].国外医药——合成药、生化药、制剂药分册,2002,23(6):348~351.)
我国有着丰富的蛇毒资源,在世界各地分布的500多种毒蛇,在我国就有150多种。蛇毒是一种混合物,它含有许多种类具有不同生物活性的蛋白质,其中很多蛋白质作用于人血液系统的成分。(Markland FS.Snake venoms and the hemostatic system[J].Toxicon,1998,36(12):1749~1800.)但是,至今没有发现利用蛇毒单一组分进行预防和治疗脓毒症的报道。
基于活化C蛋白被成功开发为治疗严重脓毒症药物和蛇毒中存在多种作用于血液系统的组分,有必要提出从蛇毒中寻找活化C蛋白样酶,进行治疗脓毒症创新药物的开发。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种用于预防和治疗脓毒症的蛇毒提取物,以克服现有技术的不足。
本发明需要解决的另一个技术问题是提供这种用于预防和治疗脓毒症的提取物的制备方法。
本发明需要解决的再一个技术问题是提供这种提取物在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
本发明公开了一种蛇毒提取物,其特征在于,该提取物在体外能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物,在体内它能显著降低脓毒症试验动物的死亡率。
该蛇毒提取物,由如下方法制备:
(1)蛇毒的分离纯化,选自离子交换层析技术、凝胶过滤层析技术、亲和层析技术、疏水层析技术或离心、超滤、盐析、有机溶剂沉淀技术中的一种;
(2)将收集液进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定和水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定,取同时具有二者活性的组分。
其中离子交换层析技术的具体步骤如下:
蛇毒溶于pH为5~10的起始缓冲液,如乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥-盐酸缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等,其中最优地使用pH为7.6的Tris-HCl缓冲液中,对起始缓冲液透析,然后取出,离心,离心条件为10000g,30min,取上清;采用阴离子交换层析分离蛇毒,所使用阴离子交换层析介质为本领域所公知的各种层析介质,根据其骨架的不同可分为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等,如Q Sepharose系列、DEAE Sepharose系列、DEAE Sephacel系列、QAE Sephadex系列、DEAE Sephadex系列、SOURCE Q系列等,其中最优的使用SOURCE 30Q作为层析介质进行分离,层析条件根据每种层析介质的使用说明和要分离的蛇毒量做相应的调整,方法为本领域所公知。
上述蛇毒提取物的来源包括但不限于蝮蛇毒(Agkistrodon halys venom)、烙铁头蛇毒(Trimeresurus mucroquamatus venom)、蝰蛇毒(Vipera russelli venom)、尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)、眼镜蛇毒(Naja naja atra venom)、眼镜王蛇毒(Ophiophagus hannah venom)、金环蛇毒(Bungarus multicinctus venom)、竹叶青蛇毒(Trimeresurus stejnegeri venom)、白眉蝮蛇毒(Baimei pallas pit viper)。
本发明还公开了该蛇毒提取物的制备方法,可以是从不同种属的蛇毒中提取,也可以是用基因工程手段制备的这些重组的蛇毒有效组分。
本发明制备预防和治疗脓毒症蛇毒有效组分的方法是:采用本领域公知的蛋白质分离纯化技术,如离子交换层析技术、凝胶过滤层析技术、亲和层析技术、疏水层析技术、离心、超滤、盐析、有机溶剂沉淀等技术对蛇毒进行分离纯化,然后对蛇毒分离组分进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间和水解活化C蛋白特异显色肽底物能力的测定,同时具有二者活性的组分即为预防和治疗脓毒症蛇毒有效组分。
这些蛇毒提取物的提取方法如下:
(1)蛇毒的分离纯化,选自离子交换层析技术、凝胶过滤层析技术、亲和层析技术、疏水层析技术或离心、超滤、盐析、有机溶剂沉淀技术中的一种。
(2)将收集液进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定和水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定,取同时具有二者活性的组分。
其中离子交换层析技术的具体步骤如下:
蛇毒溶于起始缓冲液即Tris-HCl缓冲液中,2-25℃透析3-24小时,然后取出,2~25℃离心,离心条件为3000~10000g,时间为5~60min,取上清;最优的使用SOURCE 30Q作为层析介质进行分离0.1~10克蛇毒,阴离子层析的柱体积为6~600ml,流速为0.5~50ml/min;用起始缓冲液平衡3~8倍柱体积;上样量为2~200ml;先用1~5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分,再使用梯度洗脱,梯度液组成为起始缓冲液(A),起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B),B从0~100%,洗脱20倍CV;取既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物中的收集液。
采用SOURCE 30Q阴离子交换层析介质对蝮蛇毒进行分离,得到了6个组分,分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定,结果表明峰5组分具有明显的延长活化部分凝血活酶时间,其中一管收集液可比对照的时间延长10倍,而其它5个组分峰仅有较弱的延长活化部分凝血活酶时间的能力。
分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定,结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力。
蝮蛇毒有效组分对脓毒症实验小鼠的作用,小鼠注射脂多糖24h后,开始观察到有小鼠的死亡,继续观察至72h。各组小鼠的死亡情况见表4。从表中可看出蝮蛇毒有效组分能显著降低脓毒症小鼠的死亡率,低剂量组降低15%,中剂量组降低55%,高剂量组降低65%。
用烙铁头蛇毒、白眉蝮蛇毒、眼镜王蛇毒、尖吻蝮蛇毒、眼镜蛇毒、眼镜王蛇毒、金环蛇毒、蝰蛇毒、竹叶青蛇毒替换蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的竹叶青蛇毒有效组分。
本发明公开的蛇毒提取物,同活化C蛋白功能有相似用途,可用于制备预防和治疗脓毒症的药物。
本发明中蛇毒提取物的制备方法同活化C蛋白相比,具有来源方便,生产简单易行,成本低等优点。
附图说明
图1为蝮蛇毒的阴离子交换层析图谱。
具体实施方式
实施例1阴离子交换层析分离蝮蛇毒
称取0.5g蝮蛇毒,溶于10ml 0.05mol/L,pH 7.6的Tris-HCl缓冲液(起始缓冲液)中,对该缓冲液透析过夜(4℃),然后取出,离心(4℃,10000g,30min),弃沉淀,收集上清,进行阴离子交换层析,层析条件如下:
层析介质:SOURCE 30Q;柱体积:30ml;流速:5ml/min;柱平衡:用起始缓冲液平衡5倍柱体积;上样量:10ml;洗脱:先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分,再使用梯度洗脱,梯度液组成为起始缓冲液(A),起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B),B从0~100%,洗脱20倍CV;收集:8.0ml/管。
采用SOURCE 30Q阴离子交换层析介质对蝮蛇毒进行分离,得到了6个组分,具体结果见附图1和表1。
表1阴离子交换层析各组分峰的积分结果
保留体积(ml) | 峰面(mAU*ml) | 积峰面积百分比(%) |
33.19(峰1)135.97(峰2)271.48(峰3)363.86(峰4)500.50(峰5)616.74(峰6) | 8261.612052.362139.337371.1410790.874171.17 | 23.755.906.1521.1931.0211.99 |
实施例2延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定
取凝血活酶(白陶土-脑磷脂)混悬液0.1ml,加正常人混合新鲜血浆0.1ml,对照组加生理盐水0.1ml,混匀,37℃水浴孵育5min,加入0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml,立即开动秒表,记录凝血时间,试验组除用蝮蛇毒分离液代替生理盐水外,其它与对照组相同。[参见,王鸿利.血栓与止血检验技术,第一版[M],上海:上海科学技术出版社,1992,66-67.]
分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行测定,结果表明峰5组分具有明显的延长活化部分凝血活酶时间,其中一管收集液可比对照的时间延长10倍,而其它5个组分峰仅有较弱的延长活化部分凝血活酶时间的能力。
实施例3水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定
取4μmol/L PefachromePCa3297(活化C蛋白特异显色肽,购自瑞典Pentapharm公司)0.2ml,加pH 8.4的0.05mol/L Tris-咪唑缓冲液1.65ml,再加入不同的蝮蛇毒分离液0.2ml,混匀,在405nm测吸收值的变化(测定3min)。参比溶液为用0.2ml水溶液替换蛇毒溶液的上述溶液组成。[参见,Martinoli JL,Stocker K.Fast functionalprotein C assay using Protac,a novel protein C activator[J].Thromb Res,1986,43(3):253~264.]
分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行测定,结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力。
实施例2、3的试验结果表明峰5组分(以下称为蝮蛇毒有效组分)具有同活化C蛋白功能相似的作用。
实施例4蝮蛇毒有效组分对脓毒症实验动物的作用
(1)脂多糖对小鼠LD100的测定
取18~22g小鼠30只,每10只分为一组,雌雄各半,分别以2mg/kg bwt(体重)、10mg/kg bwt和50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射脂多糖(E.coli 055:B5,购自Sigma公司)溶液,注射速度为0.5ml/min,在72h内观察各组小鼠的死亡情况。
小鼠被注射脂多糖24h后,开始观察到有小鼠的死亡,继续观察至72h。具体各组小鼠的死亡情况见表3。从表中可看出小鼠对脂多糖的敏感性较低,只有当脂多糖的剂量达到50mg/kg bwt时,其致死率才达到100%,因此确定本试验所测定的脂多糖对小鼠LD100为50mg/kg bwt,该剂量约相当于每只小鼠注射1.0mg的脂多糖。
表3LPS对小鼠LD100的测定结果
LPS剂量(mg/kgbwt) | 小鼠死亡数(只) | 死亡率(%) |
21050 | 0210 | 020100 |
(3)蝮蛇毒有效组分对脓毒症实验小鼠的作用
取18~22g小鼠80只,每20只分为一组,雌雄各半,分成四组。第一组以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射脂多糖溶液;第二组先以2mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的蝮蛇毒有效组分溶液,30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液;第三组先以4mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的蝮蛇毒有效组分溶液,30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液;第四组先以8mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的蝮蛇毒有效组分溶液,30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液注射速度均为0.5ml/min,在72h内观察各组小鼠的死亡情况,计算死亡率。
小鼠注射脂多糖24h后,开始观察到有小鼠的死亡,继续观察至72h。各组小鼠的死亡情况见表4。从表中可看出蝮蛇毒有效组分能显著降低脓毒症小鼠的死亡率,低剂量组降低15%,中剂量组降低55%,高剂量组降低65%。
表4蝮蛇毒有效组分降低脓毒症小鼠死亡率的试验结果
组别 | APCL剂量(mg/kg bwt) | 小鼠死亡数(只) | 死亡率(%) |
1 | 0 | 20 | 100 |
2 | 2 | 17 | 85 |
3 | 4 | 9 | 45 |
4 | 8 | 7 | 35 |
实施例5
在实施例4下“用蝮蛇毒有效组分对脓毒症实验小鼠的作用”中以先注射脂多糖,再注射蝮蛇毒有效组分做替换,也得到了相类似的试验结果。
实施例6
用烙铁头蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的烙铁头蛇毒有效组分。
实施例7
用白眉蝮蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的白眉蝮蛇毒有效组分。
实施例8
用眼镜王蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的眼镜王蛇毒有效组分。
实施例9
用尖吻蝮蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的尖吻蝮蛇毒有效组分。
实施例10
用眼镜蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的眼镜蛇毒有效组分。
实施例11
用眼镜王蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的眼镜王蛇毒有效组分。
实施例12
用金环蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的金环蛇毒有效组分。
实施例13
用蝰蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的蝰蛇毒有效组分。
实施例14
用竹叶青蛇毒替换实施例1-5中的蝮蛇毒,也得到了类似的具有预防和治疗脓毒症作用的竹叶青蛇毒有效组分。
Claims (7)
1、一种蛇毒提取物,其特征在于,该提取物在体外能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物,在体内它能显著降低脓毒症试验动物的死亡率。
2、根据权利要求1所述的蛇毒提取物,其特征在于,所述及的提取物由如下方法制备:
(1)蛇毒的分离纯化,选自离子交换层析技术、凝胶过滤层析技术、亲和层析技术、疏水层析技术或离心、超滤、盐析、有机溶剂沉淀技术中的一种;
(2)将收集液进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定和水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定,取同时具有二者活性的组分。
3、根据权利要求2所述的蛇毒提取物,其特征在于,所述及的离子交换层析技术的具体步骤如下:
蛇毒溶于溶于起始pH为5~10的起始缓冲液缓冲液,2~25℃透析过夜,然后取出,离心,离心条件为,2~25℃,3000~10000g,时间为5~60min,取上清;阴离子层析介质最优的使用SOURCE 30Q,阴离子层析的柱体积为6~600ml,流速为0.5~50ml/min;用起始缓冲液平衡3~8倍柱体积;上样量为2~200ml;先用1~5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分,再使用梯度洗脱,梯度液组成为起始缓冲液(A),起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B),B从0~100%,洗脱20倍CV;取既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物中的收集液。
4、根据权利要求1至3任一所述的蛇毒提取物,其特征在于,所述及的蛇毒选自蝮蛇毒、烙铁头蛇毒、蝰蛇毒、尖吻蝮蛇毒、眼镜蛇毒、眼镜王蛇毒、金环蛇毒、竹叶青蛇毒或白眉蝮蛇毒。
5、一种蛇毒提取物的制备方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)蛇毒的分离纯化,选自离子交换层析技术、凝胶过滤层析技术、亲和层析技术、疏水层析技术或离心、超滤、盐析、有机溶剂沉淀技术中的一种。
(2)将收集液进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定和水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定,取同时具有二者活性的组分。
6、根据权利要求5所述的蛇毒提取物,其特征在于,所述及的离子交换层析技术的具体步骤如下:
蛇毒溶于溶于起始pH为5~10的起始缓冲液缓冲液,2~25℃透析过夜,然后取出,离心,离心条件为,2~25℃,3000~10000g,时间为5~60min,取上清;阴离子层析介质最优的使用SOURCE 30Q,阴离子层析的柱体积为6~600ml,流速为0.5~50ml/min;用起始缓冲液平衡3~8倍柱体积;上样量为2~200ml;先用1~5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分,再使用梯度洗脱,梯度液组成为起始缓冲液(A),起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B),B从0~100%,洗脱20倍CV;取既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物中的收集液。
7、根据权利要求1至4任一所述的蛇毒提取物在制备预防和治疗脓毒症的药物中的应用。
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CN102533694A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-04 | 重庆师范大学 | 一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶a2的方法 |
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