CN100365020C - 预防和治疗脓毒症的蛇毒来源的蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于蛇毒的同活化C蛋白功能相似的蛋白质，用于脓毒症的预防和治疗。本发明还公开了该蛋白的制备方法，可采用阴离子交换和凝胶过滤相结合的层析技术从蛇毒中分离纯化。本发明公开的蛋白可应用于制备预防和治疗脓毒症的药物，同活化C蛋白相比，具有来源方便，生产简单易行，成本低等优点，有着非常重要的经济和社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及采用一种来源于蛇毒的用于预防和治疗脓毒症的蛋白质，具体地说是一种同活化C蛋白功能相似的用于预防和治疗脓毒症的蛋白。
背景技术
脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，是导致人类死亡的一常见病种，它有极高的发病率和死亡率。(Alerti C，Brun-Buission C，Burchardi H，etal.Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentercohort study[J].Intensive Care Med，2002，28(2)：108-121.)脓毒症是指由感染或者有高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合症，其病原菌包括细菌、真菌、寄生虫及病毒等，临床症状包括但不限于(1)体温＞38℃或＜36℃；(2)心率＞90次/分钟；呼吸＞20次/分钟或PaCO2＜32mm Hg；(4)外周血白细胞计数＞12×109/L，＜4×109/L或成熟粒细胞＞10％；(5)器官功能障碍，高灌注或高血压。(王正国.脓毒症研究概况[J].中华创伤杂志，2003，19(1)：5-7.)
自20世纪80年代以来，随着对脓毒症发病机制研究的深入，开发各种旨在抑制脓毒症形成的药物也随即兴起，并进行了80多项临床试验，其中几个有希望的药物进行了III期临床试验，但是遗憾的是仅有一个药物(活化C蛋白)被开发成功。(PoldermanKH and Girbes ARJ.Drug intervention trials in sepsis：divergent results[J].Lancet，2004，363：1721-1723.)。活化C蛋白(商品名为Xigris)的开发成功为新的治疗严重脓毒症药物的开发提供了借鉴，特别是在天然产物中寻找同其功能相似的物质，在此称为活化C蛋白样酶(activated protein C like enzyme)。由于在静脉血栓病人中约有64％的患者对活化C蛋白是抗性的，所以这部分病人患脓毒症后再用Xigris治疗肯定是无效的，而活化C蛋白样物质就可以弥补Xigris的不足。另外，Xigris的生产过程复杂，生产成本较高，每个病人一个疗程的费用约为6800美元，如此高的价格限制了它在临床上的广泛应用。以上这些原因使得活化C蛋白样酶的寻找和开发有着非常重要的经济和社会意义。(，冯军，赵文杰.活化C蛋白[J].国外医药——合成药、生化药、制剂药分册，2002，23(6)：348～351.)
我国有着丰富的蛇毒资源，在世界各地分布的500多种毒蛇，在我国就有150多种。蛇毒是一种混合物，它含有许多种类具有不同生物活性的蛋白质，其中很多蛋白质作用于人血液系统的成分。(Markland FS.Snake venoms and the hemostatic system[J].Toxicon，1998，36(12)：1749～1800.)但是，至今没有发现利用蛇毒单一组分进行预防和治疗脓毒症的报道。
基于活化C蛋白被成功开发为治疗严重脓毒症药物和蛇毒中存在多种作用于血液系统的组分，有必要提出从蛇毒中寻找活化C蛋白样酶，进行治疗脓毒症创新药物的开发。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种来源于蛇毒的用于预防和治疗脓毒症的蛋白质，以克服现有技术的不足。
本发明需要解决的另一个技术问题是提供这种用于预防和治疗脓毒症的蛋白的制备方法。
本发明需要解决的再一个技术问题是提供这种蛋白在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
本发明公开了一种来源于蛇毒的蛋白，是由124个氨基酸残基组成活化C蛋白样酶，，在体外它既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物，在体内它能显著降低脓毒症试验动物的死亡率。上述活化C蛋白样酶可以是从蛇毒中提取的也可以是用基因工程手段制备的重组活化C蛋白样酶。上述活化C蛋白样酶的分子量在15.3kD(±5000kD)。上述活化C蛋白样酶的一级结构如附图4所示的氨基酸序列组成。其氨基酸序列如SEQ ID NO：1：
Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys
5 10 15
Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp
20 25 30
Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe
35 40 45
Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys
50 55 60
Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys
65 70 75
Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg
80 85 90
Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp
95 100 105
Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu
110 115 120
Ser Glu Pro Cys
这种预防和治疗脓毒症的蛋白质来源于蝮蛇毒(Agkistrodon halys venom)。
本发明还公开了该蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)蛇毒溶于pH为5～10的起始缓冲液，如乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥-盐酸缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等，其中最优地使用pH为7.6的Tris-HCl缓冲液中，对起始缓冲液透析3-24小时，然后取出，2～25℃离心，离心条件为3000～10000g，时间为5～60min，取上清；
(2)采用阴离子交换层析分离蛇毒，所使用阴离子交换层析介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如Q Sepharose系列、DEAE Sepharose系列、DEAE Sephacel系列、QAE Sephadex系列、DEAE Sephadex系列、SOURCE Q系列等，其中最优的使用SOURCE 30Q作为层析介质进行分离0.1～10克蛇毒，阴离子层析的柱体积为6～600ml，流速为0.5～50ml/min；用起始缓冲液平衡3～8倍柱体积；上样量为2～200ml；先用1～5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B)，B从0～100％，洗脱20倍CV；取峰取既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物中的收集液。
(3)用截留分子量1000～10000Da的醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，所使用的凝胶过滤介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如Sepharose系列、Sephacel系列Sephadex系列和Superdex系列等，其中最优的使用Superdex 75 pre grade作为层析介质进行分离，凝胶过滤层析柱体积为25～2500ml；流速为0.1～10ml/min；PBS缓冲液平衡1～2倍柱体积；上样量为0.2～20ml；PBS缓冲液洗脱1～2倍柱体积；取取既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽底物中的收集液。
本发明活化C蛋白样酶的制备方法中最优选地原料使用蝮蛇毒(Agkistrodonhalys)，阴离子交换层析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生产的SOURCE30Q，凝胶过滤层析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生产的Superdex 75 pregrade。
阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定，结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力。分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定，结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力
阴离子交换分离层析分离到的峰5经凝胶过滤层析后，结果得到2个组分峰，分别对这2个组分峰进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间和水解显色肽试验测定，试验结果表明峰2中的各管收集液既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又具有较强的水解显色肽的能力，这表明峰2中的组分是活化C蛋白样酶。
进行SDS-PAGE，其中分离胶的浓度为12.5％，浓缩胶的浓度为4％，对得到的活化C蛋白样酶进行纯度检测和分子量测定。SDS-PAGE结果为单一条带，见附图3。以低分子量标准蛋白质的迁移率(Rf)为横坐标，低分子量标准蛋白质的对数值为纵坐标进行回归计算，得出APCL的分子量为15.3kD。
序列测定表明活化C蛋白样酶是由124个氨基酸组成，序列组成见序列表。
活化C蛋白样酶对正常小鼠的毒性测定，试验结果表明：在72h内，在任何一个剂量组均没有观察到小鼠的死亡，同时也没有观察到小鼠的外观体征和行为活动发生异常的变化，因此可以确定APCL对小鼠的LD50低于400mg/kgbwt。
活化C蛋白样酶对脓毒症实验小鼠的作用，小鼠注射脂多糖24h后，开始观察到有小鼠的死亡，继续观察至72h。活化C蛋白样酶能显著降低脓毒症小鼠的死亡率，低剂量组降低20％，中剂量组降低65％，高剂量组降低70％。
本发明中蛇毒来源的蛋白质，即活化C蛋白样酶的用途是用于制备预防和治疗脓毒症的药物。
本发明中蛇毒来源的蛋白质的制备方法同活化C蛋白相比，具有来源方便，生产简单易行，成本低等优点。
附图说明
图1为阴离子交换层析图谱。
图2为凝胶过滤层析图谱。
图3为活化C蛋白样酶的SDS-PAGE检测图谱。
具体实施方式
实施例1阴离子交换层析分离蝮蛇毒
称取0.5g蝮蛇毒，溶于10ml 0.05mol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液(起始缓冲液)中，对该缓冲液透析过夜(4℃)，然后取出，离心(4℃，10000g，30min)，弃沉淀，收集上清，进行阴离子交换层析，层析条件如下：
层析介质：SOURCE 30Q；柱体积：30ml；流速：5ml/min；柱平衡：用起始缓冲液平衡5倍柱体积；上样量：10ml；洗脱：先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+0.2mol/L NaCl缓冲液(B)，B从0～100％，洗脱20倍CV；收集：8.0ml/管。
采用SOURCE 30Q阴离子交换层析介质对蝮蛇毒进行分离，得到了6个组分，具体结果见附图1和表1。
表1阴离子交换层析各组分峰的积分结果
| 保留体积(ml) | 峰面积(mAU<sup>*</sup>ml) | 峰面积百分比(％) |
| 33.19(峰1)135.97(峰2)271.48(峰3)363.86(峰4)500.50(峰5)616.74(峰6) | 8261.612052.362139.337371.1410790.874171.17 | 23.755.906.1521.1931.0211.99 |
实施例2延长人血浆活化部分凝血活酶时间的测定
取凝血活酶(白陶土-脑磷脂)混悬液0.1ml，加正常人混合新鲜血浆0.1ml，对照组加生理盐水0.1ml，混匀，37℃水浴孵育5min，加入0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，立即开动秒表，记录凝血时间，试验组除用蝮蛇毒分离液代替生理盐水外，其它与对照组相同。[参见，王鸿利.血栓与止血检验技术，第一版[M]，上海：上海科学技术出版社，1992，66-67.]
分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行测定，结果表明峰5组分具有明显的延长活化部分凝血活酶时间，其中一管收集液可比对照的时间延长10倍，而其它5个组分峰仅有较弱的延长活化部分凝血活酶时间的能力。
实施例3水解活化C蛋白特异显色肽能力的测定
取4μmol/L PefachromePCa3297(活化C蛋白特异显色肽，购自瑞典Pentapharm公司)0.2ml，加pH8.4的0.05mol/L Tris-咪唑缓冲液1.65ml，再加入不同的蝮蛇毒分离液0.2ml，混匀，在405nm测吸收值的变化(测定3min)。参比溶液为用0.2ml水溶液替换蛇毒溶液的上述溶液组成。[参见，Martinoli JL，Stocker K.Fast functionalprotein C assay using Protac，a novel protein C activator[J].Thromb Res，1986，43(3)：253～264.]
分别对阴离子交换层析得到的6个蝮蛇毒组分峰进行测定，结果表明仅有峰5组分具有明显的水解L PefachromePCa3297的能力。
实施例4凝胶过滤层析纯化活化C蛋白样酶
合并经阴离子交换分离层析分离到的峰5中的各管收集液，用截留分子量为3000的醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析。层析条件如下：
层析介质：Superdex 75 pre grade；柱体积：150ml；流速：0.5ml/min；柱平衡：PBS缓冲液(0.15mol/L NaCl，0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0)平衡1倍柱体积；上样量：2ml；洗脱：PBS缓冲液洗脱1.5倍柱体积；收集：3ml/管。
层析结果：
阴离子交换分离层析分离到的峰5经凝胶过滤层析后，结果得到2个组分峰，具体结果见附图2和表2。
表2凝胶过滤层析各组分峰的积分结果
| 保留体积(ml) | 峰面积(mAU<sup>*</sup>ml) | 峰面积百分比(％) |
| 58.34(峰1)73.06(峰2) | 1374.86822.8 | 16.7583.14 |
分别对这2个组分峰进行延长人血浆活化部分凝血活酶时间和水解显色肽试验测定，试验结果表明峰2中的各管收集液既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又具有较强的水解显色肽的能力，这表明峰2中的组分是活化C蛋白样酶。
实施例5十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析活化C蛋白样酶
按照文献[参见，李建武，余瑞元，袁明秀等.生物化学实验原理和方法[M].北京：北京大学出版社，1997，174～176.]进行SDS-PAGE，其中分离胶的浓度为12.5％，浓缩胶的浓度为4％，对得到的活化C蛋白样酶进行纯度检测和分子量测定。
SDS-PAGE结果为单一条带，见附图3。以低分子量标准蛋白质的迁移率(Rf)为横坐标，低分子量标准蛋白质的对数值为纵坐标进行回归计算，得出APCL的分子量为15.3kD。图中，M为标准蛋白分子；1号为活化C蛋白样酶。
实施例6活化C蛋白样酶的氨基酸组成序列测定
序列测定表明活化C蛋白样酶是由124个氨基酸组成，序列组成见序列表。
实施例7活化C蛋白样酶对脓毒症实验动物的作用
(1)脂多糖对小鼠LD100的测定
取18～22g小鼠30只，每10只分为一组，雌雄各半，分别以2mg/kg bwt(体重)、10mg/kg bwt和50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射脂多糖(E.coli 055：B5，购自Sigma公司)溶液，注射速度为0.5ml/min，在72h内观察各组小鼠的死亡情况。
小鼠被注射脂多糖24h后，开始观察到有小鼠的死亡，继续观察至72h。具体各组小鼠的死亡情况见表3。从表中可看出小鼠对脂多糖的敏感性较低，只有当脂多糖的剂量达到50mg/kg bwt时，其致死率才达到100％，因此确定本试验所测定的脂多糖对小鼠LD100为50mg/kg bwt，该剂量约相当于每只小鼠注射1.0mg的脂多糖。
表3LPS对小鼠LD100的测定结果
| LPS剂量(mg/kgbwt) | 小鼠死亡数(只) | 死亡率(％) |
| 21050 | 0210 | 020100 |
(2)活化C蛋白样酶对正常小鼠的毒性测定
取18～22g小鼠24只，每6只分为一组，雌雄各半，分别以4mg/kg bwt、40mg/kgbwt、100mg/kg bwt和400mg/kg bwt的剂量尾静脉注射APCL溶液，注射速度为0.5ml/min，在72h内观察各组小鼠的死亡情况。
试验结果表明：在72h内，在任何一个剂量组均没有观察到小鼠的死亡，同时也没有观察到小鼠的外观体征和行为活动发生异常的变化，因此可以确定APCL对小鼠的LD50低于400mg/kg bwt。
(3)活化C蛋白样酶对脓毒症实验小鼠的作用
取18～22g小鼠80只，每20只分为一组，雌雄各半，分成四组。第一组以50mg/kgbwt的剂量尾静脉注射脂多糖溶液；第二组先以2mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的活化C蛋白样酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液；第三组先以4mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的活化C蛋白样酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液；第四组先以8mg/kg bwt的剂量尾静脉注射0.4mg/ml的活化C蛋白样酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的剂量尾静脉注射2mg/ml的脂多糖溶液注射速度均为0.5ml/min，在72h内观察各组小鼠的死亡情况，计算死亡率。
小鼠注射脂多糖24h后，开始观察到有小鼠的死亡，继续观察至72h。各组小鼠的死亡情况见表4。从表中可看出活化C蛋白样酶能显著降低脓毒症小鼠的死亡率，低剂量组降低20％，中剂量组降低65％，高剂量组降低70％。
表4活化蛋白C样酶降低脓毒症小鼠死亡率的试验结果
| 组别 | APCL剂量(mg/kgbwt) | 小鼠死亡数(只) | 死亡率(％) |
| 1 | 0 | 20 | 100 |
| 2 | 2 | 16 | 80 |
| 3 | 4 | 7 | 35 |
| 4 | 8 | 6 | 30 |
实施例8
在实施例7下“用活化C蛋白样酶对脓毒症实验小鼠的作用”中以先注射脂多糖，再注射活化C蛋白样酶做替换，也得到了相类似的试验结果。
序列表
<110>上海医药工业研究院
<120>预防和治疗脓毒症的蛇毒来源的蛋白质
<130>SPI058135
<160>1
<170>Patent In Version2.1
<210>1
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<400>1
Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys
5 10 15
Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp
20 25 30
Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe
35 40 45
Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys
50 55 60
Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys
65 70 75
Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg
80 85 90
Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp
95 100 105
Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu
110 115 120
Ser Glu Pro Cys
Claims (7)
1.一种来源于蛇毒的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述及的蛇毒为蝮蛇毒。
3.一种来源于蛇毒的蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)蛇毒溶于起始pH为5～10的起始缓冲液缓冲液，2～25℃透析过夜，然后取出，离心，取上清；
(2)用阴离子交换层析分离蛇毒，取含有既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽的收集液；
(3)用截留分子量为1000～10000的醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，取含有既能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间又能水解活化C蛋白特异显色肽的收集液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的离心条件为，2～25℃，3000～10000g，时间为5～60min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的阴离子层析介质使用SOURCE30Q，阴离子层析的柱体积为6～600ml，流速为0.5～50ml/min；用起始缓冲液平衡3～8倍柱体积；上样量为2～200ml；先用1～5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+0.2mol/LNaCl缓冲液(B)，(B)从0～100％，洗脱20倍CV；取峰5中的收集液。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的凝胶过滤层析介质为Superdex75，凝胶过滤层析柱体积为25～2500ml；流速为0.1～10ml/min；PBS缓冲液平衡1～2倍柱体积；上样量为02～20ml；PBS缓冲液洗脱1～2倍柱体积；取峰2中的收集液。
7.根据权利要求1所述的蛋白在制备预防和治疗脓毒症的药物中的应用。
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| Characterization of the structure and function of threephospholipases A2 from the venom of Agkistrodon halyspallas. Chen ,Y.C.等.Toxicon,Vol.25 No.4. 1987 * |
| 活化C蛋白. 冯军等.国外医药－合成药、生化药、制剂分册，第23卷第6期. 2002 * |
| 蛇毒蛋白C激活物的初步研究. 宋国明等.蛇志，第11卷第4期. 1999 * |
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