CN113388027B - 抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法和应用，涉及抗体技术领域。本发明公开的制备方法通过使用SARS‑CoV‑2的RBD蛋白免疫宿主动物马制备出抗SARS‑CoV‑2的抗体，该抗体对SARS‑CoV‑2具有较高的中和活性，可用于预防或治疗因SARS‑CoV‑2所致的肺炎，本发明可为SARS‑CoV‑2所致肺炎的应急治疗提供一种新的用药选择或策略。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗新型冠状病毒的抗体及其 制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2感染可导致肺炎。目前，全世界范围内均无特 效药用于临床救治因SARS-CoV-2所致的肺炎。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明所用的术语如非特别定义，则按本领域通常的含义进行理解，下文将 对本发明进行详述。
本发明的目的在于提供一种抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法和应用。本 发明提供的制备方法可以快速制得对新型冠状病毒SARS-CoV-2具有较高中和 活性的药用级别的抗体，可用于预防或治疗因SARS-CoV-2所致的肺炎，本发明 可为SARS-CoV-2所致肺炎的应急治疗提供一种新的用药选择或策略。
第一方面，本发明提供一种抗新型冠状病毒的抗体的制备方法，其包括：将 上述新型冠状病毒的抗原免疫马；
其中，上述新型冠状病毒是SARS-CoV-2；上述抗原选自上述新型冠状病毒 的RBD蛋白。
本发明以SARS-CoV-2的包膜蛋白RBD(receptor binding domain，受体结 合域)作为抗原，通过免疫马获得了对SARS-CoV-2具有较高中和活性的药用级 别的抗体，所得到的抗体纯度较高，可用于预防或治疗因SARS-CoV-2所致的肺 炎等疾病，为SARS-CoV-2所致肺炎的应急治疗提供一种新的选择或策略。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需要，在保持RBD蛋白所具 有的免疫原性的前提下，在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上进行一个或 多个氨基酸的添加、删除或替换，以此RBD蛋白变体作为抗原免疫马，其也是 属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述RBD蛋白通过如下方法获取：
在重组细胞的培养产物中分离纯化得到上述RBD蛋白；其中，上述重组细 胞是将含有RBD基因的表达载体转化宿主细胞得到，上述RBD基因编码上述 RBD蛋白。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
需要说明的是，本发明的RBD基因并不限于SEQ ID NO.5所示的核苷酸序 列，根据密码子的简并性，本领域技术人员容易想到使用其他的核苷酸序列编码 上述RBD蛋白，这对本领域技术人员来说是不需要付出创造性的劳动，基于此， 无论以何种核苷酸序列编码上述RBD蛋白，其均属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述表达载体为真核细胞表达载体。
本发明的表达载体可以是真核细胞表达载体，也可以是原核细胞表达载体， 本领域技术人员可以根据需要进行选择，在其他的实施方式中，使用原核细胞表 达载体重组表达上述RBD蛋白也是属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述真核细胞表达载体为pcAGGS。
本发明的真核细胞表达载体包括但不限于pcAGGS，本领域技术人员可以根 据需要选择合适的真核细胞表达载体对上述RBD蛋白进行重组表达，这对本领 域技术人员来说是不需要付出创造性的劳动，基于此，无论以何种真核细胞表达 载体实现上述RBD蛋白的重组表达，其均属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述宿主细胞为真核细胞。
本发明的宿主细胞也可以真核细胞，也可以是原核细胞，本领域技术人员可 以根据需要进行选择，在其他的实施方式中，使用原核细胞重组表达上述RBD 蛋白也是属于本发明的保护范围。
相较于原核细胞，使用真核细胞作为宿主细胞进行重组表达得到的重组 RBD蛋白其结构能够保持免疫原性，刺激机体产生免疫应答，进而产生有效的 针对SARS-CoV-2的抗体。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述真核细胞为哺乳动物细胞、昆虫 细胞或酵母细胞。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述哺乳动物细胞为CHO细胞、293F 细胞或293E细胞。
本发明的哺乳动物细胞包括但不限于CHO细胞、293F细胞和293E细胞， 本领域技术人员可以根据需要选择合适的哺乳动物细胞作为宿主细胞对上述 RBD蛋白进行重组表达，这对本领域技术人员来说是不需要付出创造性的劳动， 基于此，无论以何种哺乳动物细胞作为宿主细胞实现上述RBD蛋白的重组表达， 其均属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在上述表达载体上，RBD基因的上 游具有信号肽基因。
通过信号肽基因的插入，使得表达出得RBD蛋白N端融合有信号肽，通过 信号肽的作用实现RBD蛋白的分泌表达，利于RBD蛋白在后续步骤的纯化。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述所述信号肽基因编码的信号肽的 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述信号肽基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
本发明的信号肽包括但不限于SEQ ID NO.1所示的信号肽，本领域技术人 员可以根据需要，选择合适的信号肽以实现对RBD蛋白的分泌表达，这对本领 域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论以何种信号肽实现对RBD蛋白的 分泌表达，其均属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在上述表达载体上，RBD基因的下 游具有编码抗体的Fc段的Fc基因。
在RBD基因下游插入Fc基因，使得RBD蛋白的下游融合抗体Fc段蛋白， 可以提高RBD蛋白在哺乳动物细胞中的分泌表达。此外，可以利用Fc段具有 与protein A特异性结合的特性，通过protein A实现对RBD蛋白的纯化，提高 RBD蛋白的纯度。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述Fc基因的种属来源为哺乳动物。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述哺乳动物为人或鼠。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述Fc基因所编码的Fc段的氨基酸 序列如SEQ ID NO.3所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述Fc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的Fc基因及其Fc段的种属来源可以是任意的哺乳动物包括但不限于 人，本领域技术人员可以根据需要，选择合适的哺乳动物来源的Fc段与RBD 蛋白融合，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，以任何哺乳动物来 源的Fc段与RBD蛋白融合，其均属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在上述表达载体上，RBD基因与上 述Fc基因之间具有蛋白酶酶切位点编码序列。
通过蛋白酶酶切位点编码序列的插入，可以使得表达的RBD蛋白与Fc段 之间具有蛋白酶酶切位点，在后续的纯化过程中，通过相应的蛋白酶实现RBD 蛋白与Fc段的分割，为消除Fc段在体内诱导的非特异性抗体，提高抗 SARS-CoV-2的抗体特异性和纯度。
需要说明的是，上述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列与RBD蛋白或Fc段中 的氨基酸序列不存在重复，也就是说，RBD蛋白或Fc段中的氨基酸序列中并不 存在上述蛋白酶酶切位点，这样能够实现蛋白酶的准确切割。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述蛋白酶酶切位点为凝血酶酶切位 点。
本发明的蛋白酶酶切位点包括但不限于凝血酶酶切位点，本领域技术人员可 以根据需要，选择合适的蛋白酶酶切位点实现RBD蛋白与Fc段的分割，这对 本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论插入何种蛋白酶酶切位点只要 能够实现RBD蛋白与Fc段的分割，其均属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述凝血酶酶切位点的氨基酸序列如 SEQID NO.7所示。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述蛋白酶酶切位点编码序列如SEQ IDNO.8所示。
需要说明的是，本发明的蛋白酶酶切位点编码序列并不限于SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列，根据密码子的简并性，本领域技术人员容易想到使用其他的 核苷酸序列编码上述凝血酶酶切位点，这对本领域技术人员来说是不需要付出创 造性的劳动，基于此，无论以何种核苷酸序列编码凝血酶酶切位点，其均属于本 发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方式中，从培养产物中分离纯化得到RBD蛋 白包括：将上述培养产物的上清通过Protein A柱进行亲和层析纯化，得到 RBD-Fc融合蛋白，再使用凝血酶进行酶切上述RBD-Fc融合蛋白，得到RBD 蛋白。
可选地，在本发明的一些实施方式中，免疫的次数为2次以上，每隔6-12 天免疫一次。
可选地，在本发明的一些实施方式中，免疫时，上述抗原的使用量随着免疫 次数的增加而增加。
免疫次数可以根据实际情况确定，每次免疫可以收集血清，通过检查抗体的 中和滴度，达到要求后即可停止免疫，本发明的研究显示，至少需要免疫2次才 能得到符合要求的马抗SARS-CoV-2血清以及血浆。
可选地，在本发明的一些实施方式中，免疫的次数为2次。
免疫2次后，从宿主动物马的体内采集的马抗SARS-CoV-2血清其对 SARS-CoV-2的中和滴度较高，能够达到使用要求。
可选地，在本发明的一些实施方式中，第一次免疫时，上述抗原的使用量为 2-4mg。
可选地，在本发明的一些实施方式中，第二次免疫时，上述抗原的使用量为 5-7mg。
抗原的用量对免疫效果具有重要影响，剂量过高容易导致宿主动物产生免疫 耐受，也容易导致动物死亡，剂量过低又可能会无法实现免疫应答，需要反复多 次免疫。本发明通过二次免疫实现血浆采集要求，其中，将初免的抗原剂量控制 在2-4mg，在后续的1次加强免疫中，将抗原剂量控制在5-7mg，能够使马在短 期内产生免疫应答，减少免疫次数，同时又能产生具有较高中和滴度的抗 SARS-CoV-2的抗体。
可选地，在本发明的一些实施方式中，每次免疫时都使用佐剂与上述抗原混 合进行免疫。
通过佐剂的使用，可以增强抗原的免疫原性，减少抗原的使用量以及提高抗SARS-CoV-2抗体的中和滴度。
可选地，在本发明的一些实施方式中，第一次免疫采用完全佐剂，随后进行 的免疫采用不完全佐剂。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述完全佐剂是弗式完全佐剂。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述不完全佐剂是弗式不完全佐剂。
合适的佐剂使用方案可以进一步提高抗SARS-CoV-2抗体的中和滴度，本发 明中，在第一次免疫采用完全佐剂，随后进行的免疫采用不完全佐剂，可以大大 地提高抗SARS-CoV-2抗体的中和滴度。
可选地，在本发明的一些实施方式中，每次免疫的途径为皮内、皮下、肌肉、 静脉、腹腔或淋巴结注射。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述制备方法还包括：在免疫结束后， 采集血清，获得抗新型冠状病毒的血清。
本发明的血清中含有抗SARS-CoV-2的抗体，其具有较高的中和滴度，可以 直接使用或者与其他药学上可接受的辅料混合后使用，用于预防或治疗 SARS-CoV-2所致的肺炎。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述制备方法还包括：
在免疫结束后，采集血浆以制备抗上述新型冠状病毒的F(ab’)2抗体。
可选地，在本发明的一些实施方式中，制备抗上述新型冠状病毒的F(ab’)2 抗体的步骤包括：
步骤(a)：将胃蛋白酶与上述血浆混合进行消化，得到胃蛋白酶消化液。
步骤(b)：使用硫酸铵对上述胃蛋白酶消化液进行沉淀，取沉淀物。
步骤(c)：溶解上述沉淀物，并往得到的溶解液中加入第二吸附剂进行吸 附以去除杂质，进行固液分离后，收集液体组分。
步骤(d)：对上述液体组分进行超滤浓缩并脱盐，得到的浓缩液然后再进 行柱层析，收集流穿液，得到抗上述新型冠状病毒的F(ab’)2抗体。
通过上述步骤(a)-(d)可以制备出具有较高纯度和效价的抗SARS-CoV-2 的F(ab’)2抗体，该抗体分子量更小，应用范围更广，特异性更高，具有更高的 临床应用价值。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(a)中，在消化前，使用1-4 倍体积的水稀释上述血浆，并将得到的血浆稀释液的pH调至4.5以下，温度调 至24-32℃，再加入胃蛋白酶和有机溶剂以进行消化。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(a)中，控制胃蛋白酶在上 述血浆稀释液中的浓度为3-28U/ml，优选地为6-12U/ml。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(a)中，上述有机溶剂为甲 苯。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(a)中，进行消化的温度为 24-32℃，时间为30-90min。
胃蛋白酶消化的各项参数对最终的F(ab’)2抗体的纯度和产量都具有重要 影响，控制各项参数包括血浆pH、血浆温度、胃蛋白酶用量以及消化温度和时 间等在合适的范围内能够提高F(ab’)2抗体的纯度和产量。本发明中，将上述参 数控制在如上所述的范围内，有效地提高了F(ab’)2抗体的纯度和产量。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(b)中，使用硫酸铵对上述 胃蛋白酶消化液进行沉淀包括：
硫酸铵一次沉淀步骤：将上述胃蛋白酶消化液与硫酸铵混合，得到第一混 合溶液，将该第一混合溶液的温度调至50度以上并维持20-50min，再降温至 45℃以下，再加入第一吸附剂进行吸附，固液分离后，收集液体成分。
硫酸铵二次沉淀步骤：将上述液体成分的pH调节至6.5-7.5，再与硫酸铵 混合，得到第二混合溶液，往该第二混合溶液中加入第一吸附剂进行吸附，固液 分离后，得到上述沉淀物。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(b)中，所用的吸附剂为硅 藻土。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在硫酸铵一次沉淀步骤中，所述第 一混合溶液种，硫酸铵的浓度控制为6％-16％(质量体积百分比，w/v)。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在硫酸铵二次沉淀步骤中，所述第 二混合溶液中，硫酸铵的浓度控制为18％-34％(质量体积百分比，w/v)。
硫酸铵沉淀步骤的各项参数是影响F(ab’)2抗体纯度的重要控制参考，在本 发明的硫酸铵沉淀步骤中，通过2次沉淀，并合理地将硫酸铵沉淀过程中的pH、 温度、硫酸铵用量控制在如上所述的范围内，能去除部分大分子和小分子杂质蛋 白，再结合柱层析可去除IgG等大分子和部分小分子蛋白，有效提高了F(ab’)2 抗体的纯度。
在步骤(b)中，所用的第一吸附剂为硅藻土。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(c)中，使用水溶解上述沉 淀物。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(c)中，所用的第二吸附剂 为明矾。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(c)中，每kg上述沉淀物 对应加入70-90ml的10％(w/v)明矾水溶液。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(c)中，在加入第二吸附剂 后，将上述溶解液的pH调节至6.5-8.0，搅拌上述溶解液30-90min。
通过步骤(c)可以去除溶液中的采用硫酸铵沉淀步骤即步骤(b)和层析 步骤即步骤(d)不能去除的杂质，可进一步提高产品F(ab’)2抗体的纯度。
可选地，在本发明的一些实施方式中，在步骤(d)中，在进行柱层析前， 使用缓冲液稀释上述浓缩液。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述缓冲液选自磷酸盐缓冲液。
可选地，在本发明的一些实施方式中，上述磷酸盐缓冲液的浓度为 0.15-0.25mol/L。
第二方面，本发明提供一种抗新型冠状病毒的抗体，其由如上任一项所述 的制备方法制得。
第三方面，本发明提供如上任一项所述的抗体在制备抗新型冠状病毒药物中 的应用。
第四方面，本发明提供一种抗病毒药物，其含有如上任一项所述的抗体。
第五方面，本发明提供一种治疗由SARS-CoV-2引起的疾病的方法，其包括： 给予需要治疗的患者施用如上所述的抗病毒药物，该患者患有由SARS-CoV-2 引起的疾病。
可选地，在本发明的一些实施方式中，由SARS-CoV-2引起的疾病是肺炎。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使 用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因 此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性 劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为还原和非还原SDS-PAGE鉴定RBD-Fc和RBD为二聚体。
图2为采用流式鉴定RBD-Fc和RBD对过表达于HeLa细胞表面的ACE2 的结合。
图3为采用ELISA测定马抗SARS-CoV-2血清中RBD特异性抗体的滴度结 果。
图4为采用病毒中和试验测定马抗SARS-CoV-2血清中和滴度的结果，图中： Prime代表第一次免疫后的血清样品，Boost1代表第二次免疫后的血清样品， Boost2代表第三次免疫后的血清样品。
图5为采用SDS-PAGE分析制备F(ab’)2蛋白过程中各节点样品的结果，M： marker，250、150、100、75、50、37、25、20、15kD(由上至下)，泳道1-7 代表的样品是：血浆、胃酶消化液、二沉溶解液、明矾上清液、超滤液、层析流 穿浓缩液和马抗SARS-CoV-2的F(ab’)2抗体原液。
图6为采用病毒中和试验测定马抗SARS-CoV-2的F(ab’)2抗体原液RBD 特异性抗体的滴度结果。
图7为马抗SARS-CoV-2的F(ab’)2抗体原液的EC50曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下文将对本发明实施 例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规 条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市售购买获得的常规产品。
下文实施例仅为说明性目的，无意于以任何方式限制本发明的保护范围。虽 已尽力确保所使用数值(例如，量、时间、浓度、温度，等等)的准确度，但是某 些实验误差和偏差仍是允许的。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供制备抗SARS-CoV-2的抗体的方法，其包括如下步骤：
1.抗原制备
(1)质粒构建：通过全基因合成得到RBD基因片段(SEQ ID NO.5)，将 其构建至真核表达载体pcAGGS的HindIII和PstI酶切位点之间，并在其N端 加上信号肽基因(SEQ IDNO.4)以利于分泌表达，在其C端加人Fc基因(SEQ ID NO.6)以利于纯化，RBD基因下游与Fc基因上游之间加入凝血酶酶切位点 编码序列(SEQ ID NO.8)，得到重组真核表达载体pcDNA3.1-CD5-RBD-Fc。
(2)抗原表达：将上述重组真核表达载体转染至CHO细胞。7天后，对培 养产物离心，收集细胞培养上清以备纯化。
(3)抗原制备和检测：通过protein A柱亲和层析纯化，得到RBD-Fc融合 蛋白。为消除Fc标签在体内诱导的非特异性抗体，采用凝血酶切除Fc标签，得 到RBD蛋白。采用考马斯亮蓝染色对所得的蛋白进行分析，RBD-Fc和RBD的 纯度均大于90％。并对RBD-Fc和RBD进行鉴定，结果见图1和图2，图1的 结果显示，RBD-Fc和RBD为二聚体，图2的结果显示，RBD蛋白能够与ACE2 结合，上述结果表明所制备的抗原符合抗体制备要求。
2.马抗SARS-CoV-2血清制备
(1)马匹免疫：分别采用3mg，6mg和12mg RBD蛋白对马匹进行第一、 第二和第三次免疫，每隔12天免疫一次。第一次采用弗式完全佐剂(购自 Sigma-Aldrich)，第二次和第三次均采用弗式不完全佐剂(购自Sigma-Aldrich)。 具体操作方法为：将抗原与佐剂进行充分混合后，经皮内、皮下、肌肉等途径实 施多点注射。
(2)抗血清采集：在每次免疫后间隔7天，采集血清，获得马抗SARS-CoV-2 血清，检测其RBD特异性抗体滴度以及中和滴度，方法参考后文，结果见图3 和图4。
图3结果显示，第一次免疫后，抗SARS-CoV-2血清的RBD特异性抗体滴 度为102；经加免一次后，RBD特异性抗体滴度上升至105；经加免两次后，RBD 特异性抗体滴度上升至106。也就是说，抗SARS-CoV-2血清的RBD特异性抗 体滴度随着免疫次数的增加而得到显著提升。
图4结果显示，第一次免疫后，抗SARS-CoV-2血清的中和滴度不到20； 经加免一次后，中和滴度上升至5120；经加免两次后，中和滴度大于10240。也 就是说，抗SARS-CoV-2血清的中和滴度随着RBD抗原免疫次数的增加而得到 大幅提升。
上述结果说明在第二次免疫后，血清抗体滴度达到采浆要求(>640)，采集 血浆，用于马免疫球蛋白制备。
3.马抗SARS-CoV-2免疫球蛋白(F(ab’)2)制备
(1)胃蛋白酶消化：将胃蛋白酶与血浆混合进行消化，得到胃蛋白酶消化 液；具体操作如下：
用4倍体积注射用水稀释采集的血浆，温度调至30℃，用2M HCl调pH至 3.0，温度调至30℃，往血浆稀释液加入胃蛋白酶(终浓度为10U/ml)，按0.2％ (v/v)体积比加入甲苯，搅拌保温60min，得到胃蛋白酶消化液，取部分样品 进行SDS-PAGE电泳分析；
稀释后的血浆调节pH为3.0，缓慢加入溶解好的胃蛋白酶，搅拌下加入甲 苯至终浓度0.2％(v/v)，继续搅拌60分钟，可进一步灭活病毒。
(2)硫酸铵沉淀：使用硫酸铵对胃蛋白酶消化液进行沉淀；具体操作如下：
(a)硫酸铵一次沉淀：
往上述胃蛋白酶消化液中加入硫酸铵至终浓度为15％(w/v)，用2M NaOH 调pH至5.5，加温至56℃，维持30min，再降温至45℃以下，加硅藻土至终浓 度为8g/L，采用板框压滤的方式实现固液分离，通气将沉淀物吹干，取上清， 备用。
(b)硫酸铵二次沉淀：
步骤(a)得到的上清用2M NaOH调pH至7.0，加硫酸铵至终浓度为20％ (w/v)，搅拌溶解，静置60min，加硅藻土至终浓度为8g/L，搅拌后采用板框 压滤的方式实现固液分离，通气将沉淀物吹干，取沉淀，备用；
(3)吸附除杂：溶解沉淀，并往得到的溶解液中加入吸附剂进行吸附以去 除杂质，进行固液分离后，收集液体组分；具体操作如下：
使用4倍体积的注射用水溶解上述步骤(b)得到的沉淀，搅拌使沉淀溶解 (取部分样品进行SDS-PAGE电泳分析)，加入80mL/kg 10％明矾水溶液(1kg 步骤(b)得到的沉淀对应加80ml的10％明矾水溶液)，用2M NaOH调pH至 8.0，搅拌60min，采用板框压滤的方式实现固液分离，通气将沉淀物吹干，弃 沉淀，取上清(取部分样品进行SDS-PAGE电泳分析)，备用。
(4)将步骤(3)的上清液进行超滤脱盐，控制硫酸铵含量不高于0.5g/L， 随后进行超滤浓缩(取部分样品进行SDS-PAGE电泳分析)。
(5)浓缩液用10％体积的0.2mol/L磷酸缓冲液稀释后，进行DEAE柱层析， 收集流穿液(取部分样品进行SDS-PAGE电泳分析)。
(6)往步骤(5)得到的流穿液中加NaCl至终含量7.5-9.5g/L，加间甲酚 至终含量2.0-2.4g/L，加甘氨酸至终含量10g/L，用HCl调pH至7.0，用0.22 微米滤芯过滤除菌，得到抗SARS-CoV-2的F(ab’)2抗体原液(取部分样品进行 SDS-PAGE电泳分析)。
实验例1
对上述制备马抗SARS-CoV-2的F(ab’)2方法中的各节点样品进行 SDS-PAGE电泳分析，结果见图5，结果显示，随着工艺纯化过程的进行，F(ab’)2 蛋白(分子量约100kD)纯度逐渐提高，杂质被逐步去除。其中，完整IgG(分 子量约150kD)被胃蛋白酶消化较充分，SDS-PAGE电泳显示无完整IgG。马抗 SARS-CoV-2的F(ab’)2的制备方法过程中的杂质主要为胃蛋白酶酶切后的小分 子片段，胃蛋白酶消化后的Fc和白蛋白碎片(50kD以下)被大量去除，Fab’ (分子量约50kD)仅有极少量残余。
实验例2
检测抗SARS-CoV-2的F(ab’)2抗体原液的效价和纯度
结果见图6和7，可以看出，抗SARS-CoV-2的F(ab’)2抗体原液抑制50％ 病毒的效价不低于2560；抑制80％病毒效价不低于5120，EC50为8.78μg/ml。
通过高效液相色谱(HPLC)分析抗SARS-CoV-2的F(ab’)2抗体原液的纯 度，结果显示F(ab’)2纯度达到91.9％。
上述实施例中涉及的检测方法：
一、检测抗SARS-CoV-2血清和F(ab’)2抗体的中和滴度的操作方法：
1.中和滴度测定：
(1)将对数生长期的Vero-E6细胞铺48孔板，3*10^5个细胞/孔，过夜培 养。
(2)稀释血清：采用含2％FBS DMEM培养基稀释抗SARS-CoV-2血清或 抗SARS-CoV-2F(ab’)2抗体原液。在96孔板中，每孔加入100μl培养基。从 20倍开始，倍比稀释血清，共稀释8-12个梯度，以无血清孔作为对照。
(3)孵育：在每孔中加5μl用2％FBS DMEM培养基稀释的SARS-CoV-2 病毒液(MOI0.05)，充分混匀，并置37℃共孵育1h。
(4)感染：充分去除48孔板中培养上清，取90μl混合物加入细胞，并置 于37℃孵育1h。
(5)充分去除感染物，将细胞用200μl PBS洗一遍。重新再每孔中加入 200μl 10％FBS DMEM培养基，继续培养。
(6)24h后，收细胞培养上清待测，测定病毒拷贝数，根据抗SARS-CoV-2 血清或抗SARS-CoV-2F(ab’)2抗体原液对病毒感染的抑制率来评价活性。
2.采用qRT-PCR测定病毒拷贝数：
(1)病毒RNA提取具体操作方法：参照Takara MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit(Code No.9766)
(2)病毒RNA逆转录具体操作方法：参照Takara PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNAEraser(Code No.RR047A)
(3)采用qPCR检测病毒拷贝数：参照Takara TB 
Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(Code No.RR820A)(采用标准曲线法：用已知拷贝数的RBD 质粒做标准品，特异性引物靶向RBD)
3.结果判定：
中和滴度为抑制50％所需抗SARS-CoV-2血清或抗SARS-CoV-2F(ab’)2抗 体原液的稀释倍数的倒数。
二、流式鉴定RBD与ACE结合的方法：
1过表达人ACE2的HeLa细胞的制备：
(1)将对数生长期的HeLa细胞铺6孔板，6*10^5个细胞/孔，过夜培养。
(2)换液：将6孔板中HeLa细胞的培养液换成1.8mL新鲜的含2％FBS DMEM培养基，并将细胞板放至37℃温育。
(3)配制转染混合物：将3μg人ACE2真核表达质粒pcDNA3.1-hACE2和 9μLlipo2000分别稀释于100μL opti-MEM培养基中。随后将二者震荡混匀， 并置室温孵育5-10分钟。
(4)转染：将200μL转染混合物逐滴均匀加入HeLa细胞培养液中，并 轻轻晃匀。
(5)细胞继续培养24小时待检测。
2.制备生物素标记的RBD：
(1)将RBD蛋白浓度用PBS调至1mg/mL。在避光条件下，按照摩尔比 3:1的比例在RBD稀释液中加入生物素。随后充分混匀，并置于室温孵育30分 钟。
(2)将混合物加入3KD超滤管中，10000g离心10分钟。去除滤液，在滤 膜内加入新的PBS。
(3)重复(2)步骤5次以上，以充分去除未标记上的生物素。
3.采用流式细胞术检测RBD-Fc和RBD对ACE2的结合：
(1)细胞消化：从细胞培养箱取出转染ACE2的HeLa细胞，以及未转染 ACE2的HeLa细胞。充分去除培养基，用500μL PBS洗一遍细胞。在6孔板 中加入300μL胰酶，并置于37℃孵育3分钟。随后在孔中加入0.7mL含10％ FBS DMEM培养基终止消化。800rpm离心5分钟，收集细胞用于下一步。
(2)结合：将细胞密度调整至1×106个/mL，分别取200μL HeLa细胞置 于1号和2号流式管，并分别200μL HeLa-ACE2细胞置于3号和4号流式管。 按照5μg/mL分别在1号和3号管中加入RBD-Fc，以及在2号和4号管中加 入生物素标记的RBD。4℃避光孵育20分钟。
(3)洗涤：在流式管中加入500μL PBS，于800rpm离心5分钟，小心 倒掉洗液。
(4)充分(3)步骤一遍，以充分洗去未结合蛋白。
(5)二抗染色：将细胞用200μL PBS重悬，在1号和3号管中加入 PE-conjugatedanti-human Fc antibody，在2号和4号管中加入PE Cy7-conjugated streptavidin。4℃避光孵育20分钟。
(6)洗涤：在流式管中加入500μL PBS，于800rpm离心5分钟，小心 倒掉洗液。
(7)重复(6)步骤一遍，以充分洗去未结合二抗。
(8)将细胞重悬于200μL PBS，通过流式细胞仪检测结合信号。
4.结果判定
与HeLa细胞的峰图相比，RBD-Fc或RBD染色的HeLa-ACE2细胞出现明 显新增峰或峰明显右移可判断为有结合。
三、ELISA检测马抗血清中RBD特异性抗体滴度：
(1)抗原包被：将RBD以1μg/ml，100μL/well包被于ELISA板。
(2)封闭：弃去孔中液体，在滤纸上拍干，每孔加入100μL含2％脱脂 奶粉的封闭液，室温1小时。
(3)洗涤：弃去孔中液体，在滤纸上拍干。加入200μL洗涤液(PBS+0.05％Tween20)，室温静置5分钟，弃去液体，再滤纸上拍干。重复此步骤5次。
(4)一抗孵育：将马抗血清按照10倍梯度进行稀释，每孔中加入100μL。 室温孵育2小时。
(5)洗涤：弃去孔中液体，在滤纸上拍干。加入200μL洗涤液，室温静置 5分钟，弃去液体，再滤纸上拍干。重复此步骤5次。
(6)二抗孵育：将HRP goat anti-horse二抗稀释在2％脱脂奶粉中，每孔中 加入100μL。室温孵育1小时。
(7)洗涤：弃去孔中液体，在滤纸上拍干。加入200μL洗涤液，室温静置 5分钟，弃去液体，再滤纸上拍干。重复此步骤5次。
(8)显色：采用TMB显色试剂盒，以A液：B液＝1:100的比例进行配制， 每孔加入100μL。室温放置5-15分钟，可观察到孔中慢慢出现蓝色。
(9)中止反应：每孔加入100μL终止液(1M H2SO4)，孔中颜色由蓝转黄。
(10)读数：于酶标仪上测定OD450。
(11)结果判定：
样品孔OD450值为PBS对照孔OD450值的两倍即为阳性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域 的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser
<210> 2
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttcc 54
<210> 5
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cacggaacgt tctgaaaaga gctatgaatt gcagacacct tttgaaatta aattggcaaa 60
gaaatttgac accttcaatg gggaatgtcc aaattttgta tttcccttaa attccataat 120
caagactatt caaccaaggg ttgaaaagaa aaagcttgat ggctttatgg gtagaattcg 180
atctgtctat ccagttgcgt caccaaatga atgcaaccaa atgtgccttt caactctcat 240
gaagtgtgat cattgtggtg aaacttcatg gcagacgggc gattttgtta aagccacttg 300
cgaattttgt ggcactgaga atttgactaa agaaggtgcc actacttgtg gttacttacc 360
ccaaaatgct gttgttaaaa tttattgtcc agcatgtcac aattcagaag taggacctga 420
gcatagtctt gccgaatacc ataatgaatc tggcttgaaa accattcttc gtaagggtgg 480
tcgcactatt gcctttggag gctgtgtgtt ctcttatgtt ggttgccata acaagtgtgc 540
ctattgggtt ccacgtgcta gcgctaacat aggttgtaac catacaggtg ttgttggaga 600
aggttccgaa ggtcttaatg acaaccttct tgaaatactc caaaaagaga aagtcaacat 660
caatattgt 669
<210> 6
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
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tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ile Ser Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attagcggcc gcctggtgcc gcgcggcagc 30
Claims (24)
1.一种抗新型冠状病毒的抗体的制备方法，其特征在于，其包括：将所述新型冠状病毒的抗原免疫马；
其中，所述新型冠状病毒是SARS-CoV-2；所述抗原选自所述新型冠状病毒的RBD蛋白；所述RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述RBD蛋白通过如下方法获取：
在重组细胞的培养产物中分离纯化得到所述RBD蛋白；其中，所述重组细胞是将含有RBD基因的表达载体转化宿主细胞得到，所述RBD基因编码所述RBD蛋白；所述RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；在所述表达载体上，所述RBD基因的上游具有信号肽基因；所述表达载体为真核细胞表达载体；所述宿主细胞为真核细胞；
所述制备方法还包括：在免疫结束后，采集血清，获得抗新型冠状病毒的血清；
或在免疫结束后，采集血浆以制备抗所述新型冠状病毒的F(ab’)2抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真核细胞表达载体为pcAGGS。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真核细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO细胞、293F细胞或293E细胞。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述信号肽基因编码的信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述信号肽基因的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述表达载体上，RBD基因的下游具有编码抗体的Fc段的Fc基因；在所述表达载体上，RBD基因与所述Fc基因之间具有蛋白酶酶切位点编码序列；所述蛋白酶酶切位点编码序列所编码的蛋白酶酶切位点的氨基酸序列与RBD蛋白或Fc段中的氨基酸序列不存在重复，且所述蛋白酶酶切位点为凝血酶酶切位点。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述Fc基因的种属来源为哺乳动物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物为人或鼠。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述Fc基因所编码的Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述Fc基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述凝血酶酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述凝血酶酶切位点编码序列如SEQ ID NO.8所示。
14.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，从培养产物中分离纯化得到RBD蛋白包括：将所述培养产物的上清通过Protein A柱进行亲和层析纯化，得到RBD-Fc融合蛋白，再使用凝血酶酶切所述RBD-Fc融合蛋白，得到RBD蛋白。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，免疫的次数为2次以上，每隔6-12天免疫一次。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，免疫时，所述抗原的使用量随着免疫次数的增加而增加。
17.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，免疫的次数为2次；
第一次免疫时，所述抗原的使用量为2-4mg；
第二次免疫时，所述抗原的使用量为5-7mg。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，每次免疫时都使用佐剂与所述抗原混合进行免疫；
第一次免疫采用完全佐剂，随后进行的免疫采用不完全佐剂。
19.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备抗所述新型冠状病毒的F(ab’)2抗体的步骤包括：
步骤（a）：将胃蛋白酶与所述血浆混合进行消化，得到胃蛋白酶消化液；
步骤（b）：使用硫酸铵对所述胃蛋白酶消化液进行沉淀，取沉淀物；
步骤（c）：溶解所述沉淀物，并往得到的溶解液中加入第二吸附剂进行吸附以去除杂质，进行固液分离后，收集液体组分；
步骤（d）：对所述液体组分进行超滤脱盐和超滤浓缩，得到的浓缩液然后再进行柱层析，收集流穿液，得到抗所述新型冠状病毒的F(ab’)2抗体。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，在消化前，使用1-4倍体积的水稀释所述血浆，并将得到的血浆稀释液的pH调至4.5以下，温度调至24-32℃，再加入胃蛋白酶和有机溶剂以进行消化；
其中，控制胃蛋白酶在血浆稀释液中的浓度为3-28 U/ml，所述有机溶剂为甲苯；进行消化的温度为24-32℃，时间为30-90min；
在步骤（b）中，使用硫酸铵对所述胃蛋白酶消化液进行沉淀包括：
硫酸铵一次沉淀步骤：将所述胃蛋白酶消化液与硫酸铵混合，得到第一混合溶液，将该第一混合溶液的温度调至50℃以上并维持20-50 min，再降温至45℃以下，再加入第一吸附剂进行吸附，固液分离后，收集液体成分；
硫酸铵二次沉淀步骤：将所述液体成分的pH调节至6.5-7.5，再与硫酸铵混合，得到第二混合溶液，往该第二混合溶液中加入硅藻土进行吸附，固液分离后，得到所述沉淀物；
在硫酸铵一次沉淀步骤中，所述第一混合溶液中，硫酸铵的浓度控制为6%-16%；
在硫酸铵二次沉淀步骤中，所述第二混合溶液中，硫酸铵的浓度控制为18%-34%；
在步骤（c）中，所用的第二吸附剂为明矾；每kg所述沉淀物对应加入70-90ml的10%明矾水溶液；在加入第二吸附剂后，将所述溶解液的pH调节至6.5-8.0，搅拌所述溶解液30-90min；
在步骤（d）中，在进行柱层析前，使用缓冲液稀释所述浓缩液；
所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.15-0.25mol/L。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，控制胃蛋白酶在血浆稀释液中的浓度为6-12 U/ml。
22.一种抗新型冠状病毒的抗体，其特征在于，其由权利要求1-21任一项所述的制备方法制得。
23.权利要求22所述的抗体在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
24.一种抗病毒药物，其特征在于，其含有权利要求22所述的抗体。
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| GR01 | Patent grant | ||
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