KR102091372B1 - 엔테로바이러스 71형 불활화 백신 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 엔테로바이러스 71형 균주 및 이를 이용한 수족구병 예방용 불활화 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 EV71형 불활화 백신 후보주는 중화항체능, 방어능 및 수동면역반응효과 등의 백신 효과가 우수한 것으로 확인되었으므로, 본 발명의 백신 조성물은 효과적인 수족구병 예방용 백신으로 사용될 수 있다.

Description

엔테로바이러스 71형 불활화 백신 및 이의 용도{Inactivated Enterovirus 71 Vaccine and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 엔테로바이러스 71형 균주 및 이를 이용한 수족구병 예방용 불활화 백신 조성물에 관한 것이다.

수족구병은 최근 10년간 국내에서 지속적으로 발생하고 있으며, 2009년 5월 신경계 합병증을 동반한 국내 첫 사망사례가 보고됨에 따라 2009년 6월부터 법정전염병으로 지정되어 관리하고 있다. 주된 발병 대상은 영유아이며, 원인병원체는 Family Picornaviridae에 속하는 Genus Enterovirus로 혈청형에 따라 엔테로바이러스(Enterovirus), 콕사키바이러스(Coxsackievirus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 에코바이러스(Echovirus) 등으로 나누어진다. 이 중 엔테로바이러스 71은 신경계 합병증을 동반한 중증 수족구병의 발생과 연관되어 있다.

엔테로바이러스의 구조적 특징은 외피가 없으며(nonenveloped), 양성 단일 가닥 (single-stranded positive sense)의 RNA 유전자를 포함한 바이러스이다. 바이러스 유전자가 하나의 단백질을 발현시키며, 그 후 여러개의 단백질로 분절화 된다. 구조단백질인 VP1, VP2, VP3, VP4로 구성되며, 바이러스의 복제는 RNA-dependent-RNA-polymerase에 의해 수행된다. RNA 바이러스의 특성상 재조합 등 많은 변이체를 생성하며, 유전형에 따라 약 100여 종의 아형 그룹이 존재한다. EV71은 A, B, C의 3가지 유전자 그룹으로 분류되고, A그룹은 BrCr-CA-70형이 유일하나 B와 C그룹은 각각 5가지의 유전자형으로 분류된다. 국내 표본감시 수행으로 확보된 유행주는 EV71C4a로 중국 유행주와 약 98%의 유전자 상동성을 보인다.

수족구병은 3~7일 정도의 잠복기를 거쳐 주로 분변-구강 경로를 통한 직접적인 접촉에 의해 전파되고, 침이나 타액, 진액 등에 의해 전파되기도 하는데, 성인에게는 극히 예외적인 질병이기는 하나 면역력이 결핍된 사람들에게는 걸릴 확률이 높은 질병이다. 감염 후 수족구병/포진성 구협염 등의 일차적 증상이 나타나고, 신경세포를 거슬러 중추신경계로 전이되어 심장과 폐의 심각한 질환으로 이어지기도 하며, 신경계 질환을 거친 유아에게서 신경발달의 부진의 만성부작용으로, 팔, 다리, 심장, 폐 기능뿐 아니라 지능발달의 부진이 보고되기도 하였다.

수족구병은 주로 아시아 태평양 지역에서 발병하는데, 1970년대에 호주와 일본에서 발생한 후, 소규모의 유행성 전염병(epidemic)이 홍콩(1985)과 호주(1986) 등지에서 간헐적으로 발생하다가, 1997년 말레이지아의 사라?(Sarawak) 지역에서 2,618명의 감염자 중 34명의 사망으로 이어지는 대규모의 감염병으로 발전하였다. 이듬해 대만에서도 150만 명이 감염되어 400여명이 신경계 합병증으로 입원하였고, 이 중 78명의 사망으로 이어졌다. 2008년 중국에서는 백만 명이 넘는 감염자가 발생하여 350여명의 사망자를 낳기도 하였다. 2000년대 중반부터 현재까지도 감염률이 점차 증가하는 추세이며, 주 전염병 발생지역이 아시아 태평양 지역에 집중되어 있다. 전체적으로 매년 2백만 건의 감염이 발생하고 그 중 500여 명의 사망자가 보고되고 있다.

국내의 연간 수족구병 발생환자수는 건강보험심사평가원 자료에 의하면 약 13만 명 정도로 추정되나 실제 보고되지 않은 경우를 포함하면 이보다 훨씬 많을 것으로 추정된다. 2009년부터 집계된 사망자 수는 매년 1~2명에 그치는 상황이나, 신경계통의 중증 합병증의 심각성과 그 발전율이 0.1~0.5%임을 고려할 때 (200~1000명 정도 발생 예측), 이를 예방할 수 있는 체계적인 대책이 필요한 상황이다. 질병관리본부에서는 2008년 5월부터 수족구병을 자발적 소아감염병 표본감시체계 대상질환에 포함시켜 운영하다가, 2009년 6월부터 법정전염병 중 지정감염병으로 지정하여 표본감시체계를 운영 중이다. 2010년부터는 표본감시기관을 확대하여 합병증을 동반한 수족구병 표본감시체계를 운영 중이다.

그러나 아직까지 EV71에 대한 상용화된 치료제나 예방 백신 등 개발되어 있지 않은 상황이며, 이에 본 발명자들은 2009년부터 법정전염병으로 지정되어 관리되고 있는 수족구병의 주요 원인병원체인 엔테로바이러스71형의 국내 유행주를 분리하여, 예방 백신 후보주로 개발하고 실용화를 위한 기반을 구축하고자 노력한 끝에 본 발명을 완성하게 되었다.

미국 등록특허 제08168192호 미국 등록특허 제08313750호 대한민국 공개특허 제10-2014-0096343호

본 발명의 목적은 국내에서 유행하는 수족구병의 예방 백신으로 사용될 수 있는 신규한 엔테로바이러스 71형 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 엔테로바이러스 71형 균주를 이용한 수족구병 예방용 불활화 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC18548P로 기탁된, 국내 수족구병 환자의 검체(Stool)에서 분리한 신규한 엔테로바이러스 71형 균주(KCDC-HFMDV1_EV71)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 항원으로 함유하는 수족구병 예방용 불활화 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 애쥬번트는 Alum (10ug/ul)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 사이토카인 발현을 증가시키는 활성을 나타낸다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 포르말린으로 균주를 불활화시켜 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 EV71형 불활화 백신 후보주는 중화항체능, 방어능 및 수동면역반응효과 등의 백신 효과가 우수한 것으로 확인되었으므로, 본 발명의 백신 조성물은 효과적인 수족구병 예방용 백신으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 EV71 후보주에 의한 Vero 세포의 세포변성효과를 나타낸 것이다. A: 바이러스가 접종되지 않은 정상 세포주, B: 바이러스가 감염된 후 4일 후의 Vero 세포주.
도 2는 본 발명의 EV71 후보주에 대한 농도별 면역반응 분석을 위한 마우스 실험 스케줄을 나타낸 것이다.
도 3은 마우스 모델에서 본 발명의 엔테로바이러스 71형 불활화 백신이 유도하는 항체가(A) 및 중화항체능(B)을 측정한 결과이다.
도 4는 마우스 모델에서 본 발명의 엔테로바이러스 71형 불활화 백신의 방어능을 평가한 결과이다.
도 5는 마우스 모델에서 본 발명의 엔테로바이러스 71형 불활화 백신의 수동면역반응 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 마우스에서의 백신후보물질의 면역증강제별 면역반응 분석을 위한 마우스 실험군 설정 및 실험 일정을 나타낸 것이다.
도 7은 마우스 모델에서 본 발명의 백신후보물질의 면역증강제별 면역능을 평가한 결과이다.
도 8은 영장류 모델에서 본 발명의 백신후보물질의 면역능을 평가하기 위한 실험 스케줄을 나타낸 것이다.
도 9는 영장류 모델에서 본 발명의 엔테로바이러스 71형 불활화 백신이 유도하는 중화항체능 평가 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 2009년부터 법정전염병으로 지정되어 관리되고 있는 수족구병의 주요 원인병원체인 엔테로바이러스 71형의 국내 유행주를 분리하여, 예방 백신 후보주로 개발하고 실용화를 위한 기반을 구축하고자 진행되었다. 환자의 검체로부터 세포배양을 통해 국내 유행 엔테로바이러스 71형 분리주를 확보하였으며, 마우스 및 영장류 등의 동물 모델에서 효능 및 방어능 평가를 실시하여 예방 백신 개발을 위한 강력한 후보주를 발굴하였다. 또한 전임상 및 임상 시험 수행을 위한 바이러스 뱅크 제작 및 불활화 공법을 확립하여 실용화를 위한 기반을 확보하였다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 인체에서 분리한 엔테로바이러스 71형 균주로, 기탁번호 KCTC18548P로 기탁된 균주를 제공한다.

본 발명의 백신 후보주는 국내 환자의 검체(Stool)에서 분리한 엔테로바이러스 71 야생 분리주를 대상으로 하여 세포변성효과(Cytopathic effect : CPE) 확인시험을 거쳐 국내 대표 분리주를 선별할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 RD-A 세포주와 Vero 세포주에서 세포변성효과 (Cytopathic effect : CPE)를 확인하고, 두 세포주 모두에서 80% 이상의 세포변성효과(Cytopathic effect : CPE)를 나타낸 엔테로바이러스 71 균주를 백신 제작을 위한 최종 균주로 선택하였다.

국내 수족구병 환자로부터 분리한 세포변성효과가 높은 엔테로바이러스 71 균주를 KCDC-HFMDV1_EV71로 명명하고, 이를 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2017년 2월 09일자로 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, 한국생명공학연구원)에 수탁번호 제 KCTC18548P로 기탁하였다.

또한 본 발명은 상기 균주를 항원으로 함유하는 수족구병 예방용 백신을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신은 불활화 백신일 수 있다. 상기 불활화 백신은 병원체를 정제한 후 가열하거나, 자외선 조사 또는 포름알데하이드, 알킬화 시약 등의 약품을 이용하여 병원성 미생물을 죽여서 제작할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불활화 백신은 0.02% 포름알데하이드로 처리하여 37℃에서 약 5일간 불활화시킴이 바람직하다.

본 발명의 백신은 단독으로 투여 가능하지만, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 애쥬번트와 함께 투여할 수 있다. 상기 애쥬번트는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다(Warren et al., 1986, Annu.Rev. Immunol,. 4:369). 불활화 백신의 제작시 애쥬번트의 선발은 백신 효능의 중요한 원인이 되는데, 본 발명의 백신과 함께 투여되어 면역반응을 증강시킬 수 있는 애쥬번트는 임의의 다양한 애쥬번트를 포함하며, 전형적인 애쥬번트로는 프로인트 애쥬번트 (Freund adjuvant), 알루미늄 화합물(aluminumcompound), 무라밀 디펩타이드 (muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴리피드 A 또는 쿠일 A 등이 알려져 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신 조성물에 함께 사용할 수 있는 애쥬번트는 Alum(10ug/ul)이다.

본 발명에서 제조된 백신은 마우스에서 우수한 방어효과를 나타낸다. 본 발명의 일실시예에 의하면 상기의 백신을 마우스에 투여하고 mating 후 태어난 neonatal 마우스를 대상으로(모체이행항체) 균주를 공격 접종하였을 때 대조군에 비해 생존율이 40% 높게 나타났다.

본 발명의 백신은 주사제로 제형화하여 근육주사, 피하주사, 피내주사 등의 방법으로 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(올레인산에칠 등), 알코올류 (에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질 알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 면역학적 유효량으로 투여한다. 용어 "면역학적 유효량" 이란 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 1회 내지 수회 투여가능하다. 또한, 본 발명의 백신은 공지된 백신과 배합하여 함께 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

< 실시예 1>

세포배양을 통한 불활화백신 후보주의 발굴

2009년 국내 엔테로바이러스 실험실 감시시스템에서 양성을 나타낸 검체 중 엔테로바이러스 71(EV71)이 검출된 검체를 세계보건기구 진단 표준주인 RD-A 세포주와 기존 연구로 확보된 VERO 세포주에 접종하여 세포변성효과 (Cytopathic effect : CPE)를 확인하고, 양 세포주에 모두 세포변성효과를 나타내는 백신 후보주를 선별하였다.

먼저, 전처리 과정을 통해 바이러스 분리에 영향을 줄 수 있는 이물질, 세균, 곰팡이 등 모든 성분을 제거하였다. 검체 약 2g에 10ml PBS (항생제 포함), 1ml chloroform, glass bead를 혼합하여 20분 동안 진탕한 후 14,000rpm, 5분, 4℃에서 원심 분리하였다.

전처리가 완료된 검체를 EV71에 감수성을 가진 RD 및 Vero 세포주에 각각 접종하여 바이러스에 의한 세포변성효과를 현미경을 통해 관찰하였다. 구체적으로, T-75 flask에 mono-layer cultured vero cell line 또는 RD cell line을 미리 준비한 후 상층액을 걷어내고 EV71을 약 2시간동안 접종한 후, 접종액(inoculum)을 걷어내고 1% 우태아혈청 (FBS)이 포함된 DMEM 배지를 10ml 채운 후 3-4일 동안 관찰하였다. 두 세포주 모두에서 80% 이상의 세포변성효과(Cytopathic effect : CPE)를 확인한 후 -80℃ 에 보관 및 해동을 2회 반복하여 상층액을 회수한 후 2000rpm 5분간 원심분리를 실시한 후 바이러스가 포함된 상층액 중 일부를 -80℃에 보관하고 1ml은 동일한 방법으로 접종을 실시하였다(도 1 a,b).

하기 표 1은 국내 실험실 감시결과 중 세포변성효과를 나타낸 분리주를 정리한 표이다.

sample 번호	바이러스 타입	환자 증상	세포병변확인		비고
			RD cell	Vero cell
1	CA16	other	CPE확인
2	CA16	seizure	CPE확인
3	EV71	meningitis	CPE확인
4	EV71	paralysis	CPE확인
5	EV71	meningitis	CPE확인
6	EV71	meningitis	CPE확인
7	EV71	rash	CPE확인
8	EV71	meningitis	CPE확인
9	EV71	meningitis	CPE확인
10	EV71	meningitis	CPE확인	CPE확인	백신후보주 확보

그 후 상기 분리주를 대상으로 최종 백신 후보주 선정을 위한 clonal selection을 수행하였다. 다양한 희석배수로 희석한 EV71 대량 배양액을 RD cell이 배양된 96 well plate에 10^-1 ~ 10^-3 희석하여 접종한 후 2-3일 동안 배양 하여 CPE를 확인한다. 최종적으로 2회에 걸친 반복 실험 후 염색이 완료된 가장 낮은 희석배수의 well에서 바이러스를 회수하여 sequencing을 확인하고 vero cell에 재접종하여 세포변성효과(CPE)가 일어난 클론(clone)을 선정하였다.

clonal selection 수행으로 순수한 바이러스 분리 후 효능 및 안정성 평가를 위해 대량 배양 후 농축을 진행하였다. Amicon centrifugal filter tube를 이용하여 바이러스 배양액을 20ml로 농축하였고, 단백질 정량 결과 1.35mg/ml의 농도로 확인되었다.

<실시예 2>

백신 후보주의 전장 유전체 분석

상기 실시예 1에서 선별된 바이러스 백신후보주 strain에 대한 항원 특성자료 확보를 위하여 유전체 분석을 수행하였다. 각 strain 별로 whole genome reference sequence를 참고하여 random primer sequence를 제작한 후, 각각을 PCR하여 cDNA를 합성하고, 이를 선별하여 sequencing을 진행하였다. 그 결과 본 발명의 EV71 백신후보주는 기존 중국, 홍콩 등 분리주와 염기서열 상으로 1% 상이한 결과를 나타내었다(총 7.4kb 중 80여개의 염기서열에서 차이를 확인함. 표 2 참조).

유전형		참조 바이러스주	상동성 비교 (%)		발생 국가*	Accession No.(genbank)
			nucleotide	amino acid
C4	C4a	GZ08-530	99	99	CHN	HQ456310
		V8-2221581	99	99	HK	KC436269
		70365-TW-2010	98	99	TW	KJ786973
		SEP042	97	99	CBD	KX197465
		540v/VNM/05	96	99	VNM	JQ965759
		15/EV71/Wenzhou/CHN/2014	96	99	CHN	KT345960
		CQ03-1/CQ/CHN/2003	95	99	CHN	JX678874
		V04-2218217	93	99	HK	KC436265
		JiLin-11-China	93	98	CHN	KC414134
	C4b	SHZH98	91	96	CHN	AF302996
		AFP2001071/EV71/GX/CHN/2001	93	98	CHN	JQ742002

^* 발생 국가 : 중국 (CHN), 홍콩 (HK), 대만 (TW), 캄보디아 (CBD), 베트남 (VNM)

< 실시예 3>

수족구병 예방 백신 후보주의 불활화

본 발명의 EV71 바이러스를 0.02% 포름알데하이드(formaldehyde)를 첨가하여 37℃ incubator에서 5일간 불활화하였다.

< 실시예 4>

마우스에서의 백신후보물질의 농도별 면역반응 분석

<4-1> 마우스 실험군 설정 및 실험 일정

본 발명의 EV71 불활화백신 후보주를 5주령 Balb/c 마우스 6마리씩 항원농도에 따라 4개의 실험군으로 나누어 접종하였다. 총 16주간 실험을 진행하였으며 접종 후 2주차에 boosting을 하여 4주 간격으로 마리당 200~500㎕ 의 혈액을 채취 하였다(도 2).

<4-2> 체액성 면역반응 분석에 따른 면역능 평가

마우스(5주령 Balb/c) 모델에 불활화된 백신후보주(10ug, 15ug 및 20ug)와 면역증가제인 Alum(10ug/ul) 50ul를 혼합하여 접종한 후 항체가 및 중화항체능을 측정하였다.

항체가 측정은 EV71 바이러스를 항원(100ng)으로 사용하였으며, 4℃에서 16시간 동안 96well plate(EIA/RIA high bound)에 코팅하였다. PBST (PBS + 0.1% tween20)로 2회 washing 후 5% skim milk 용액으로 37℃에서 1시간 동안 blocking한 후, washing 2회 반복 후 혈청을 희석 용액 (5% skim milk)에 1:100부터 2배씩 희석하여 well에 분주하고 37℃에서 2시간 동안 반응하였다. PBST로 washing 3회 실시 후, 2nd antibody (Goat anti mouse IgG-HRP)를 1:20000으로 희석 용액에 희석하여 37℃에서 1시간 반응하였다. PBST로 washing 5회 수행 후 TMB solution을 넣고 30분 반응시키고 stop solution (2M H₂SO₄)를 첨가하여 hydrolysis 반응을 중지시킨 후 microplate reader에서 450nm 파장으로 O.D값을 측정하였다.

중화항체능 측정방법은 마우스 혈청을 2배씩 희석한 후 100 TCID₅₀의 EV71 바이러스와 1:1 비율로 혼합하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 2시간동안 중화반응을 실시하였다. 96well plate에 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 키운 vero 세포 (2x10⁴/well)를 미리 준비하여 마우스 혈청의 중화반응이 끝난 후 접종을 실시하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 5일 배양 후 중화항체가를 확인하였다.

그 결과, 10ug과 15ug의 백신이 접종된 실험군에서 접종 8주 후 최고치의 항체가가 형성되고(도 3A), 10ug의 백신이 접종된 실험군의 중화항체능이 가장 높고 오래 유지되는 것을 확인하였으며(도 3B), 종합적으로 불활화 백신 10ug+Alum(50ul)의 접종이 가장 효과적임을 알 수 있었다.

<4-3> 백신후보주의 감염방어능 평가 결과

방어능 측정을 위해 Balb/c neonatal 마우스(1일령)의 뇌에 EV71을 dose별로 접종하여 백신주 방어능 평가를 위한 lethal dose를 측정하였다. 마우스(5주령 Balb/c)에 불활화된 백신후보주(10ug)를 접종한 후 mating을 통해 태어난 1일령 마우스에 lethal dose인 EV71 바이러스 5x10⁵ TCID₅₀를 뇌에 접종하였다. 음성대조군은 PBS를 접종한 후 mating을 통해 태어난 1일령 마우스를 이용하여 같은 방법으로 EV71 바이러스 5x10⁵ TCID₅₀를 뇌에 접종하였다. 총 15일동안 죽는 마우스를 counting하여 survival rate 측정하여 방어능을 확인한 결과, 음성대조군에 비해 약 40% 높은 survival rate이 확인되었다(도 4).

<4-4> 백신후보주의 수동면역반응 평가 결과

수동면역반응을 평가하기 위해 1일령 마우스에 EV71의 중화항체가 포함된 혈청(중화항체가 농도 1:16, 1:32)을 ip로 주입하고 1일 후에 앞에서 측정한 lethal dose인 5x10⁵TCID₅₀의 EV71 바이러스를 뇌에 접종하였다. 음성대조군은 PBS를 접종한 마우스의 혈청을 ip로 주입하고 1일 후에 같은 방법으로 EV71 바이러스를 5x10⁵TCID₅₀으로 뇌에 접종하였다. 총 19일 동안 죽는 마우스를 counting하여 survival rate을 측정하여 수동면역반응을 확인한 결과 음성대조군에 비해 높은 수동면역능이 확인되었다(도 5).

<실시예 5>

마우스에서의 백신후보물질의 면역증강제별 면역반응 분석

<5-1> 마우스 실험군 설정 및 실험 일정

EV71 불활화백신 후보주를 5주령 Balb/c 마우스 5마리씩 항원 농도 및 adjuvant 혼합에 따라 5개의 실험군으로 나누어 접종하였다. 총 16주간 실험을 진행하였으며 접종 후 2주차에 boosting을 하여 4주 간격으로 마리당 200~500㎕ 의 혈액을 채취하였다(도 6).

<5-2> 체액성 면역반응 분석에 따른 면역능 평가

마우스(5주령 Balb/c) 모델에 불활화된 백신후보주와 면역증강제(마우스 마리당 적정농도로 희석) 종류별로 Alum(10ug/ul), Poly I:C(0.2ug/ul), MPLA(0.04ug/ul) 각각 50ul씩 혼합하여 접종한 결과 10ug+Alum 실험군의 마우스에서 중화항체능(도 7)이 높게 형성됨을 확인하였다.

<실시예 6>

영장류에서의 백신후보물질의 면역반응 분석

<6-1> 영장류 실험군 설정 및 실험 일정

EV71 불활화백신 후보주를 3세의 cynomolgus monkey 5마리에 2개의 실험군으로 나누어 접종하였다. 총 54주간 실험을 진행하였으며 접종 후 4주차, 8주차에 boosting을 하여 1차 접종 전, 2차 접종 전, 3차 접종 전, 접종 후 12, 16, 28, 54주차에 영장류의 대퇴정맥에서 마리당 약 5ml의 혈액을 채취하였다(도 8).

<6-2> 체액성 면역반응 분석에 따른 면역능 평가

영장류(3세 cynomoglus monkey)에 본 발명의 불활화된 백신후보주 20ug과 면역증가제 Alum 50ul를 접종한 후 중화항체능을 분석하였다.

중화항체능 측정방법은 영장류 혈청을 2배씩 희석한 후 100 TCID₅₀의 EV71 바이러스와 1:1 비율로 혼합하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 2시간동안 중화반응을 실시한다. 96well plate에 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에서 키운 vero 세포 (2x10⁴/well)를 미리 준비하여 영장류 혈청의 중화반응이 끝난 후 접종을 실시하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 5일 배양 후 중화항체가를 확인하였다.

그 결과 54주까지 높은 중화항체능이 유지되었으며(도 9A), 다양한 EV71 유전형에 대해서 중화항체능을 가지는 것으로 확인되었다(도 9B).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

KCTC (한국생명공학연구원) KCTC18548P 20170209

Claims (8)

1. 삭제
2. 기탁번호 KCTC18548P로 기탁된, 국내 수족구 환자의 검체로부터 분리된 엔테로바이러스 71형 바이러스의 불활화 균주를 항원으로 포함하며, 약학적으로 허용가능한 애쥬번트로서 Alum을 추가로 포함하고, 상기 균주는 RD 세포주 및 Vero 세포주 모두에서 세포 변성 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 한국형 수족구병 예방용 백신 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 포르말린으로 균주를 불활화시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 기탁번호 KCTC18548P로 기탁된, 국내 수족구 환자의 검체로부터 분리된 엔테로바이러스 71형 바이러스의 불활화 균주 10ug 및 애쥬번트로서 10ug/ul 농도의 Alum 50ul를 혼합하여 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 한국형 수족구병을 예방 또는 치료하는 방법.
8. 1) 국내 수족구 환자의 검체를 전처리하여 이물질을 제거한 후, 원심분리하는 단계;
   2) 상기 검체를 엔테로바이러스 71형에 대한 감수성을 가진 RD 세포주에 접종한 후, 배양액을 추가하여 3 내지 4일 동안 배양하는 단계;
   3) 상기 검체가 포함된 배양액을 수득하고, 상기 RD 세포주에 세포변성효과(Cytopatic Effect: CPE) 를 나타낸 엔테로바이러스 71형 균주를 선별하는 단계;
   4) 상기 선별된 균주의 배양액을 RD 세포주가 배양된 96 well plate 에 10^-1 내지 10^-3 배로 희석하여 접종 후 배양하고, 이를 회수하여 Vero 세포주에 재 접종 하는 단계;및
   5) 상기 재 접종된 Vero 세포주에서 세포변성효과를 나타낸 클론(Clone)을 선정하는 단계를 포함하는 기탁번호 KCTC18548P로 기탁된 엔테로바이러스 71형 바이러스를 항원으로 포함하는 한국형 수족구병을 예방 또는 치료용 백신 조성물의 제조 방법.
   

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