CN103773739B

CN103773739B - 一种猫泛白细胞减少症病毒减毒疫苗株及其应用

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Publication number: CN103773739B
Application number: CN201310066422.4A
Authority: CN
Inventors: 林逢生; 侯艳霞; 寇芮; 董文龙
Original assignee: SHANGHAI QISHENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI QISHENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2013-03-01
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2033-03-01
Also published as: CN103773739A

Abstract

本发明涉及一种猫泛白细胞减少症病毒减毒疫苗株及其应用。本发明人通过对猫泛白细胞减少症病毒(Feline？panl？eukopeni？a？virus，FPLV)的多次传代，成功获得了一种猫泛白细胞减少症病毒减毒株(CCTCC？NO:V201301)及其衍生株。本发明的减毒株及衍生病毒株可用于制备单苗或联苗，用于预防猫泛白细胞减少症和水貂病毒性肠炎。试验表明，本发明的减毒株和疫苗组合物接种于猫科动物、鼬科动物后，可有效激活动物体内的免疫系统并对猫泛白细胞减少症和水貂病毒性肠炎有良好的预防作用。

Description

一种猫泛白细胞减少症病毒减毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程和免疫领域，具体地，为一种猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopeniavirus，FPLV)的减毒株、减毒株的衍生毒株以及其在猫科动物泛白细胞减少症(Felinepanleukopeniadisease，FPL)防治接种、疫苗组合物制备中的应用。

背景技术

FPLV可引起猫及猫科动物泛白细胞减少症(Felinepanleukopeniadisease，FPD)，以体温升高、呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特征，是一种高度急性传染病。FPLV强毒感染水貂后，一般呈亚临床症状。

水貂病毒性肠炎(Minkenteritis)是由水貂肠炎病毒(Minkenteritisvirus，MEV)引起的以肠粘膜炎症、剧烈下痢为特征的急性高度接触性传染病，是目前世界养貂业最严重的病毒性传染病之一，对养貂业危害很大，可造成重大经济损失。目前该病广泛流行于世界各养貂国家，已引起各国的重视，并采取了严格的防疫措施。

19世纪初，FPLV首次出现，由法国人Verge等于1928年首次鉴定，1939年式命名，其感染对象主要集中在猫和浣熊上，且病毒感染动物的致死率不高。到19世纪40年代，一种与FPLV感染极为相似的疾病在水貂中爆发，引起80%水貂发病死亡，此后这种疾病迅速呈全世界蔓延趋势，1949年Schofieldsh首次报道并将其命名为MEV，但MEV不感染猫。

FPLV与MEV均属于细小病毒科细小病毒属，虽然FPLV和MEV对水貂和猫有致病性的差异，但两种病毒抗原可产生交叉免疫效应。

因此，本领域迫切需要开发一种能够同时安全、有效地作用于猫和水貂以抵抗FPLV或MEV的疫苗制剂。

发明内容

本发明提供了一种能够安全、有效地施用于猫和水貂，从而能够抵抗FPLV以及MEV的疫苗。

本发明的第一方面，提供了一种猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopeniavirus，FPLV)的减毒株，所述减毒株是保藏号为CCTCCNO:V201301的猫泛白细胞减少症病毒减毒疫苗株。

本发明的第二方面，提供了一种衍生自本发明第一方面所述的猫泛白细胞减少症病毒的CCTCCNO:V201301减毒株的衍生病毒株；较佳地，所述衍生病毒株具有以下一个或多个特性：

(a)低毒力：毒力与CCTCCNO:V201301的毒力相近或相同；

(b)所述衍生病毒株中VP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示；

(c)所述衍生病毒株表达的VP2蛋白的第389位氨基酸为天冬酰胺(Asn)；

(d)所述衍生病毒株表达的VP2蛋白的第19-564如SEQIDNO.:2所示。

本发明的第三方面提供了一种疫苗组合物，所述组合物含有疫苗上可接受的载体和本发明第一和二方面中所述的猫泛白细胞减少症病毒的减毒株或其衍生病毒株。

在另一优选例中，所述的载体是兽药学上可接受的载体或药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为二联疫苗或多联疫苗。

在另一优选例中，所述疫苗组合物还含有源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：

(a)犬瘟热病毒；

(b)水貂绿脓杆菌；

(c)猫嵌杯状病毒；

(d)猫疱疹病毒。

在另一优选例中，所述的疫苗组分包括灭活株、减毒株、或蛋白、核酸等。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物是活苗和灭活苗。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物每剂量中含有10²～10⁶半数细胞培养感染剂量TCID₅₀的减毒株。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物包括：口服剂、注射剂型。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物用于免疫猫科动物或鼬科动物或犬科的动物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物用于预防猫嵌杯状病毒和猫疱疹病毒感染，水貂犬瘟热，水貂绿脓杆菌感染。

本发明的第四方面，提供了一种制备猫泛白细胞减少症病毒的减毒株的方法，包括步骤：将猫泛白细胞减少症病毒强毒株在猫肾成纤维细胞进行连续传代，从而制得减毒株。

在另一优选例中，所述的传代次数为10-100次，较佳地20-50次。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的猫泛白细胞减少症病毒的减毒株或其衍生病毒株的用途，用于制备预防猫泛白细胞减少症的疫苗组合物。较佳地，所述的疫苗组合物包括单苗或联苗、也包括活苗或灭活苗。

更佳地，所述的疫苗组合物用于保护猫科动物以及鼬科动物以抵抗猫泛白细胞减少症或水貂病毒性肠炎。

在另一优选例中，所述的猫科动物包括家猫，鼬科动物包括水貂。

本发明的第六方面，提供了一种制备疫苗组合物的方法，包括步骤：

(a)对保藏号为CCTCC.V201301的猫泛白细胞减少症减毒疫苗株进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；

(b)将步骤(a)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。

本发明的第七方面，提供了一种猫泛白细胞减少症(FPL)的多联疫苗，所述多联疫苗是包含(i)本发明所述的猫泛白细胞减少症病毒的减毒株或其衍生病毒株；和(ii)源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：

(ii)犬瘟热病毒；

(iii)水貂绿脓杆菌；

(iv)猫嵌杯状病毒；

(v)猫疱疹病毒。

本发明的第八方面，提供了一种对猫科动物以及鼬科动物进行接种的方法，包括步骤：给需要的动物接种本发明所述的猫泛白细胞减少症病毒的减毒株或其衍生病毒株，或接种本发明第三方面所述的疫苗组合物。

在另一优选例中，所述猫科动物包括家猫，鼬科动物包括水貂。

在另一优选例中，所述的接种方式包括：口服接种、滴鼻接种、点眼接种、肌肉注射接种、皮下注射接种。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明减毒株(CCTCCNO:V201301)与其他病毒株的VP2蛋白的部分序列的比对结果，显示本发明在第389位氨基酸具有特征性的天冬酰胺(Asn)残基。

图2显示了本发明减毒株(CCTCCNO:V201301)的VP2蛋白的编码序列(SEQIDNO.:1)。

图3显示了本发明减毒株(CCTCCNO:V201301)的VP2蛋白第19-564位的氨基酸序列(SEQIDNO.:2)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而具体的研究，对FPLV强毒株进行连续传代致弱，首次意外地获得了一种减毒株FPLV-NA04，该减毒株能够非常有效地应用于对猫泛白细胞减少症以及水貂病毒性肠炎的免疫。此外，该减毒株还可与来自其他病原体的免疫组分形成良好的多联疫苗，以对抗猫嵌杯状病毒和猫疱疹病毒感染，水貂犬瘟热，水貂绿脓杆菌感染等。在此基础上完成了本发明。

术语

本发明中，所述的“猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopeniavirus，FPLV)”、“FPLV”、“猫瘟病毒”、“猫细小病毒”可以互换使用，均指猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)。

如本文所用，术语，“FPLV-NA04”为衍生自FPLV-SH01的35代减毒株；“FPLV-NA04+5”，是FPLV-NA04经过5代传代得到的衍生株。FPLV-NA04+5的遗传背景和减毒性等特性与FPLV-NA04完全相同。

如本文所用，术语“减毒株”和“减毒疫苗株”可互换使用，都指减毒的、可作为疫苗活性成分使用的病毒株。

毒株来源及分离

2010年上海某兽医院一只患肠炎病猫，经快速胶体金试剂盒诊断为细小病毒感染。采集其粪便，用PBS(pH6.4)制成10%的悬液离心取上清，用0.22μm滤膜过滤除菌后接种CRFK细胞(约60%单层)进行病毒分离，并对分离株进行血凝特性测定、PCR和VP2核酸序列分析及动物感染试验。结果表明：病料接种CRFK细胞产生典型的FPLV细胞病变(CPE)，分离株凝集猪红细胞，动物感染试验的接种猫出现轻度肠炎症状和白细胞总数减少。用PCR技术检测病毒细胞培养液，扩增出特异性目的条带1700bp，并对目的片段VP2进行测序分析，由此确证分离株为猫泛白细胞减少症病毒，命名为FPLV-SH01株。

减毒方法和减毒株

在本发明中，通过对猫泛白细胞减少症病毒(FPLV-SH01)进行连续传代，获得减毒株。

在一优选例中，传代减毒方法包括：将分离的猫泛白细胞减少症病毒接种约50～60%单层的猫肾成纤维细胞(CRFK，Crandellfelinekidneycell；或F81-KL，felinekidneyfibroblastcells)。接种细胞放37℃培养，当细胞出现CPE后，收毒。收的病毒重新接种约50～60%单层的CRFK细胞或F81-KL细胞，总共连续在细胞上传了44代。第35代毒命名为FPLV-NA04。

猫泛白细胞减少症病毒减毒疫苗株FPLV-NA04，并于2013年1月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCCNO:V201301。

研究表明，VP2是细小病毒的主要衣壳蛋白，它包括了所有的中和抗原位点，VP2基因上的几个关键碱基和氨基酸发生变化会改变其抗原特性和宿主范围。

本发明CCTCCNO:V201301VP2测序扩增产物的条带大小约为1700bp，核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示，其编码的VP2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。

应理解，对于本发明减毒株的各基因序列(包括VP2基因序列)而言，应以保藏号CCTCCNO:V201301的减毒株的序列为准。

本发明人研究表明，本发明病毒株区别于其它FPLV的一个显著特征是：所表达的VP2蛋白的第389个氨基酸为天冬酰胺(Asn)(见图1)。

疫苗组合物

本发明还提供一种防治FPLV的组合物，所述组合物是指将本发明的减毒株和免疫(学)上可接受的载体混合后获得的可用于防治FPLV的组合物，尤其是疫苗组合物。

在本发明中，免疫(学)上可接受的载体指适合用于疫苗的载体，包括兽药学可接受的载体和药学上可接受的载体。

“兽药学可接受的载体”或“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(如减毒株或灭活的成分)给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

可接收的载体指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

此外，本发明的疫苗组合物还可含有额外的佐剂。代表性的疫苗佐剂包括(但并不限于)以下种类：

无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；

有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；

合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；

油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。

施用方式和应用

本发明的主要应用为给需要的猫科动物以及鼬科动物接种所述的FPLV的减毒株或其衍生病毒株，或接种由其制得的疫苗组合物，激活动物体内免疫反应并保护猫科动物以及鼬科动物以抵抗猫泛白细胞减少症和水貂病毒性肠炎。

本发明中，所述的猫科动物包括(但并不限于)：猫、老虎、豹；鼬科动物(但并不限于)：水貂、宠物雪貂的免疫接种。

本发明的减毒株或疫苗组合物，可用于6周龄以上的猫和水貂的免疫接种。

在进行给药时，多种给药方式都是可用的。例如，所述的疫苗组合物可以通过口服免疫、肌肉注射免疫、皮下注射免疫。

在进行给药时，活性成分(减毒株)通常在10²～10⁶TCID₅₀每剂量以产生良好的免疫效果。接种次数通常为1～2次。

在本发明中，免疫接种一次后的免疫持续期，通常为至少7个月。

本发明的有益效果：

1.免疫效果确切：本发明可对FPLV、MEV等产生良好的免疫效应,免疫时效长。

2.安全性高：可用于6周龄及以上的动物。

3.与其他疫苗组分的免疫相容性良好：本发明能与犬瘟热病毒弱毒，猫嵌杯状病毒弱毒、猫疱疹病毒弱毒株等疫苗株共同制备成联合疫苗，不影响其免疫效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法：

1.猫泛白细胞减少症以及水貂病毒性肠炎的发病判断标准：

1.1猫泛白细胞减少症发病判定标准如下：

1白细胞总数下降≥70%或因白细胞总数下降而死亡。

2白细胞总数下降>50%，但<70%。

3精神沉郁，食欲减退或废绝。

4体温升高至39.6℃以上。

5粪便中的猫泛白细胞减少症病毒检出率连续≥两天

具备第1项或同时具备其他3项判为发病。

1.2水貂病毒性肠炎发病判定标准如下：

1腹泻，粪便稀软、呈黄色、灰白或粉红色甚至煤焦油状。

2体温升高至40℃以上，并持续2日以上。

3精神沉郁，食欲减退或废绝。

4粪便对猪红细胞血凝(HA)效价应不低于1:128。

5发病死亡

具备第1项和第2～4项中任何两项或同时具备第3、4、5项，判为发病。

2.无菌检验、支原体检验

按现行《中华人民共和国兽药典(三部)》附录进行无菌检验和支原体检验，结果显示，无细菌、霉菌及支原体生长。

3.外源病毒检验

分别将病毒株，按现行《中华人民共和国兽药典(三部)》附录进行外源病毒检验。取病毒样品与等量抗猫泛白细胞减少症病毒特异性血清混合，中和病毒作为检品。

3.1致细胞病变检查法

将中和后的病毒液分别接种在T25的Vero和F81细胞瓶中，每瓶接毒1.0ml，置于37℃下吸附1小时，观察至少7日，检查是否出现由接种物引起的CPE，同时各设正常细胞对照和未中和病毒接种细胞对照。

3.2红细胞吸附性外源病毒检验

将中和后的病毒液分别接种在T25的Vero(两瓶)和F81(两瓶)细胞瓶中，每瓶接毒1.0ml，置于37℃下吸附1小时，观察至少7日，用PBS洗涤细胞单层3次，加入0.2%豚鼠红细胞和鸡红细胞的等量混合悬液，已覆盖整个单层表面为准。各取一瓶分别置于2～8℃和20～25℃放置30分钟，用PBS洗涤，在显微镜下检查红细胞吸附情况。

4.试验动物

本发明采用的试验动物为7～10周龄猫以及6-10周龄水貂，接种前均进行采血、采粪检测确定其体内无FPLV或无MEVHI抗体或无FPLV或无MEV。

实施例1FPLV-SH01强毒致病性验证

方法：取3只约10周龄猫，随机分成2组：

第1组2只(1、2号猫)，用FPLV-SH01的第4代次细胞毒接种，通过肌肉注射1.0ml、口服(灌胃)9.0ml方法接种,病毒滴度为10^5.6TCID₅₀/ml，总接种量为10^6.6TCID₅₀/只；

第2组1只(3号猫)，接种细胞培养液，设为对照，肌肉注射1.0ml、口服(灌胃)9.0ml方法接种。

对以上两组动物连续观察10天，记录临床症状；

采血：在接种前4天，接种后第4天、第6天、第8天进行白细胞计数；

采集直肠拭子：接种前4天，接种后第3、4、5、6、7和8天分离病毒并测定病毒效价。

接种10天后剖杀，观察剖检病变。

结果:1组猫接种毒后，1号、2号猫体温(肛温)稍升高(分别为39.7℃和39.8℃)并出现轻度腹泻，对照的3号猫正常；

所有猫接种前后采集直肠拭子分离病毒，1号和2号猫在接种后第3、4、5、6天分离到FPLV，对照3号猫未分离到FPLV；

接种后10天剖杀所有动物，1号和2号猫肠细膜淋巴结肿大和出血，内脏未发现异常变化；3号猫内脏未发现异常变化。

猫白细胞总数计数结果见表1，直肠拭子分离病毒滴度测定结果见表2；

表1总白细胞总数计数结果

注：括号内的数据是接种前后的白细胞总数的变化。

表2病毒滴度测定结果(TCID₅₀/ml)

结论：由表1可见，接种的1号和2号猫白细胞总数明显减少(超过50%但小于70%)，对照组3号猫白细胞总数变化不明显(小于50%)；

由表2可见，接种的1号和2号猫第3、4、5、6天分离到FPLV，对照3号猫未分离到FPLV。

因此，可以说明分离到的FPLV-SH01第4代次毒的对猫有一定的致病性，为强毒。

实施例2减毒株的制备

将自行分离的猫泛白细胞减少症病毒(FPLV-SH01)，接种于约50～60%CRFK或F81-KL细胞单层的。接种细胞放37℃培养，当细胞出现CPE后，收毒。收的病毒重新接种约50～60%单层的CRFK细胞或F81-KL细胞，总共连续在细胞上传了44代。

第35代毒命名为FPLV-NA04于2013年01月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCCNO:V201301。

实施例3FPLV-SH01致弱性评价1

方法：取3只约7周龄猫，随机分成2组:

第1组2只，用FPLV-SH01的30代次毒接种，通过肌肉注射(1.0ml病毒)和口服(灌胃，1.0ml病毒+2.0ml细胞培养液)方法接种，病毒滴度为10^7.2TCID₅₀/ml，总接种量为10^7.5TCID₅₀/只；

第2组1只，接种细胞培养液，接种细胞培养液，肌肉注射1.0ml和口服(灌胃，3.0ml)方法接种，设为对照；

对以上两组动物连续观察10天，记录临床症状；

采血、采集直肠拭子及处死处理方法同实施例1。

结果：

临床症状：第1组猫接种第30代次毒后，每日进行临床观察，无明显临床症状，体温均正常；

直肠拭子分离病毒：1号猫仅在接种后第5天分离到FPLV，2号猫在接种第4、5天分离到FPLV；对照3号猫未分离到FPLV；

血清抗体：接种组猫血清中抗FPLVHI效价均为1:1280；对照组血清中抗FPLVHI效价＜1:10；

接种后10天剖杀所有动物，内脏未发现异常变化。

对所有猫白细胞总数计数结果见表3，采集直肠拭子分离病毒的滴度测定结果见表4。

表3白细胞总数计数结果

注：括号内的数据是接种前后的白细胞总数的变化。

表4病毒滴度测定结果(TCID₅₀/ml)

结论:

由表3可见，所有猫在接种前后白细胞总数变化均不明显(<50%)；由表4数据可知，粪便中所分离的病毒滴度很低，并且仅在接种后第4和5天检测到。因此，本试验结果表明FPLV-SH01第30代次细胞毒已是弱毒。

实施例4FPLV-SH01致弱性评价2

方法：取5只约7周龄猫，随机分成3组：

第1组、第2组各2只(1、2、3、4号猫)，分别用FPLV-SH01的第35代次(10^7.5TCID₅₀/只)和第40代次毒(10^7.5TCID₅₀/只)接种，通过肌肉注射(1.0ml病毒)和口服(灌胃，1.0ml病毒+2.0ml细胞培养液)方法接种，病毒滴度为10^7.2TCID₅₀/ml，总接种量为10^7.5TCID₅₀/只；

第3组1只(5号猫)，接种细胞培养液，肌肉注射1.0ml和口服(灌胃，3.0ml)方法接种，设为对照；

对以上两组动物连续观察10天，记录临床症状；

采血、采集直肠拭子及处死处理方法同实施例1。

结果：

临床症状：1组和2组猫接种后，每日进行临床观察，无明显临床症状，体温均正常；

直肠拭子分离病毒：1号猫仅在第4天分离到FPLV；2号和3号猫在第4、5天分离到FPLV；4号猫仅在第5天分离到FPLV；5号猫未分离到FPLV；

血清抗体：接种第35代FPLV-SH01株猫的血清中抗FPLVHI效价分别为1:1280(1号)和1:2560(2号)；接种第40代FPLV-SH01株猫的血清中抗FPLVHI效价分别为1:2560(3号)和1:1280(4号)；对照组血清中抗FPLVHI效价＜1:10；

接种后10天剖杀所有动物，内脏未发现异常变化。

对所有猫白细胞总数计数结果见表5，采集直肠拭子分离病毒的滴度测定结果见表6。

表5白细胞总数计数结果

注：括号内的数据是接种前后的白细胞总数的变化。

表6病毒滴度测定结果(TCID₅₀/ml)

结论：

由表5可见，所有猫白细胞总数变化均不明显(<50%)，即白细胞总数未减少；表6说明了猫接种前后采集直肠拭子分离病毒，仅在接种后的4、5天可分离到滴度较低的病毒。因此可以证明，FPLV-SH01第35代和40代次细胞毒也是弱毒。从HI抗体水平来讲，该弱毒株免疫原性很好，是一株理想的FPLV疫苗候选株。

实施例5将实施例4中的FPLV-SH01的第35代毒对水貂进行致病性试验

方法：取7只约6周龄水貂，随机分成两组：

第1组5只，用FPLV-SH01的第35代毒通过肌肉注射(1.0ml病毒)和口服(灌胃，1.0ml病毒+1.0ml细胞培养液)方法接种，病毒滴度为10^7.2TCID₅₀/ml，总接种量为10^7.5TCID₅₀/只；

第2组2只，接种细胞培养液，肌肉注射1.0ml和口服(灌胃，2.0ml)方法接种，设为对照。

对以上两组动物连续观察10天，记录临床症状；

采血：接种10天后采血并剖杀，观察病变。

采集直肠拭子：接种前1天，接种后第3、4、5、6、7和8天分离病毒。

结果：

临床症状：1组水貂接种第35代次毒后，每日进行临床观察，无明显临床症状，体温均正常；

直肠拭子分离病毒：全部水貂未分离到FPLV；

血清抗体：接种10天后采的血清用MEV测抗HI效价，第1组水貂HI效价在1:1280和1:5120之间，第2组的两只水貂仍为<1:10；

接种后10天剖杀所有动物，内脏未发现异常变化。

结论：FPLV-SH01第35代次毒(命名为FPLV-NA04)对水貂无致病性，从HI抗体水平来讲，该弱毒株免疫原性很好，因此，也是一株预防水貂病毒性肠炎理想的疫苗候选株，同时也说明本发明减毒疫苗株对6周龄的水貂是安全的。

实施例6减毒疫苗(CCTCCNO:V201301)对猫的免疫效力试验

方法：取10只约9-10周龄小猫,分为两组，每组5只：

第1组为接种组，每只猫皮下接种FPLV-SH01第35代毒CCTCCNO:V201301(=FPLV-NA04)，接种量为10^4.5TCID₅₀/只；

第2组为对照组，接种细胞培养液。

21天后，所有试验猫攻FPLV强毒(可从山东农业大学购到)，口服8.0ml和腹腔注射2.0ml,病毒滴度为10^6.5TCID₅₀/ml,总的接种量为10^7.5TCID₅₀/只。

攻毒后，进行临床观察21天；

采血：在攻毒前4天，攻毒后第4天、第6天、第8天采血进行白细胞总数计数；第21天采血，测FPLVHI抗体效价。

采集直肠拭子分离病毒：攻毒前4天，攻毒后第3、4、5、6、7、9和10天，

根据猫泛白细胞减少症症状，计算保护率。

结果：

临床症状和总白细胞计数：免疫组所有猫进行免疫-攻毒后未出现临床症状，攻毒前后总白细胞数变化均小于50%；对照组猫则有100%发病，攻毒后总白细胞数降低程度均超过50%。

攻毒后粪便FPLV检测：免疫组所有猫的粪便未检到FPLV，而对照组所有猫在攻毒后第3至6天检测到FPLV。

血清抗体：免疫组所有猫免疫后17天(攻毒前)，HI效价均≥1:1280，而对照组仍为≤1:10。攻毒后21天，免疫组猫HI抗体效价≥1:2560，对照组≥1:1280。

免疫组与对照组白细胞及直肠拭子病毒分离情况见表7:

表7猫攻FPLV强毒后的临床症状

结论：本发明减毒疫苗株对猫有良好的免疫效力，免疫剂量为10^4.5TCID₅₀/只即可产生全部保护。

实施例7减毒疫苗对水貂的免疫效力试验

方法：取20只约9-10周龄水貂没有MEVHI抗体(≤1:10)，随机分为4组，每组5只。

第1组，每只水貂肌肉注射接种FPLV-SH01第35代毒CCTCCNO:V201301(=FPLV-NA04)，接种量为10^3.0TCID₅₀/ml/只；

第2组，每只水貂肌肉注射接种FPLV-SH01第35代毒CCTCCNO:V201301(=FPLV-NA04)，接种量为10^4.0TCID₅₀/ml/只；

第3组，每只水貂肌肉注射接种FPLV-SH01第35代毒CCTCCNO:V201301(=FPLV-NA04)，接种量为10^5.0TCID₅₀/ml/只；

第4组，每只水貂肌肉注射接种细胞培养液，1.0/ml/只。

免疫后14天，采血测抗MEVHI抗体效价，并对所有试验水貂攻MEV强毒株(可从东北林业大学购到)进行攻毒试验，每只肌肉注射2.0ml+口服2.0ml，病毒滴毒为10^6.5TCID₅₀/ml，攻毒总量为10^7.1TCID₅₀/只。

采集粪便拭子病毒分离：攻毒后3-8天，采集粪便拭子病毒分离并用1%猪红血球做HA来确定MEV的滴度。

攻毒后，进行临床观察14天，根据水貂病毒性肠炎症状和粪便中的MEVHA滴度，计算保护率。

结果：

临床症状：免疫组所有水貂在免疫-攻毒后均健活，未见异常临床症状；对照组(第4组)出现典型的肠炎症状，其中4只死亡。

攻毒后粪便MEV检测：免疫组所有水貂的粪便未检到MEVHA滴度，而对照组所有水貂在攻毒后第3至6天检测到大量MEV均>1:128。

血清抗体：免疫14天后，免疫1组MEVHI抗体效价≥1:160，免疫2和3组≥1:1280，对照组仍为<1:10；

直肠拭子滴度：免疫组所有水貂在免疫-攻毒后粪便中测MEVHA滴度为0；对照组(第4组)粪便中HA检测MEV滴度均>1:128；

各组在免疫后血清中MEV的HI抗体效价可见表8，对照组的水貂攻毒后发病临床症状及粪便HA滴度见表9。

表8免疫14天(攻毒前)后水貂血清中MEV的HI抗体效价

注：MEVHI抗体≤1:10为阴性，>1:10为阳性。

表9对照组水貂攻毒后症状

结论：由表8-9可见，对照组发病率为100%，保护率为0%；免疫1、2和3组保护率均为100%。因此，本发明减毒疫苗株对水貂的MEV能产生有效的免疫力。

此外，用弱毒株FPLV-NA04＋5重复上述试验，结果证实，与对照组（发病率为100%，保护率为0%）相比，该衍生株的3个免疫组保护率均为100%。

实施例8分子标记的研究

本实施例对本发明的弱毒株FPLV-NA04的基因(VP2)进行测序，并与已知其它的FPLV的氨基酸序列进行比对。

8.1引物设计

参照已发表的细小病毒VP2基因的保守序列设计通用引物：

FPLV-F：5'-ATGAGTGATGGAGCAGTT-3'(SEQIDNO.:3)

FPLV-R：5'-AGGTGCTAGTTGAGATTTTT-3'(SEQIDNO.:4)

由生工生物工程(上海)有限公司合成。

8.2病毒基因组DNA的提取

取病毒的细胞培养物加入10%SDS和蛋白酶K，55℃水浴作用30min，加入等体积的酚：氯仿抽提，加入无水乙醇，置于-20℃,10min，沉淀DNA，加入70%的乙醇洗DNA后，加入RTE溶解，置于37℃，水浴作用30min后，可直接PCR。

8.3VP2基因的扩增

按2×PowerTaqPCRMasterMix(购自北京百泰克生物技术有限公司)说明方法扩增FPLV-NA04VP2基因。

PCR反应程序为94℃4min；94℃30s、53℃30s、72℃1min，进行30个循环后，72℃10min。

反应结束后，取5μlPCR产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳40分钟，进行初步电泳鉴定，于紫外分光仪下观察并切下目的条带。

8.4PCR产物的回收和序列测定

应用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自上海捷瑞生物工程有限公司)说明方法进行PCR产物的纯化回收。为进一步进行鉴定，将经过鉴定阳性的PCR回收纯化产物，送往生工生物工程(上海)有限公司测序。

8.5核苷酸和氨基酸测序序列比较

减毒株FPLV-NA04的VP2基因及蛋白序列测试结果如下：

测序扩增产物的条带大小约为1700bp，核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示，VP2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。

将弱毒株FPLV-NA04与Genbank上已公布的121株FPLV的VP2蛋白的氨基酸序列进行比对后(见图1)，发现FPLV-NA04的第389个氨基酸为天冬酰胺(Asn)，而其它120株FPLV毒株第389个氨基酸均为苏氨酸(Thr)，因此可认为这个氨基酸位点是FPLV-NA04的标志性位点之一。

实施例9减毒疫苗株FPLV-NA04(CCTCCNO:V201301)与犬瘟热病毒弱毒疫苗的免疫相容性试验

方法：取30只约9-10周龄水貂，随机分为6组，每组5只。

第1和2组，每只水貂肌肉注射接种1.0ml含FPLV-NA0410^4.0TCID₅₀/只和犬瘟热病毒弱毒10^4.7TCID₅₀/只。

第3组，每只水貂肌肉注射接种1.0ml含FPLV-NA0410^4.0TCID₅₀。

第4组，每只水貂肌肉注射接种1.0ml含犬瘟热病毒弱毒10^4.7TCID₅₀。

第5和6组，每只水貂肌肉注射接种细胞培养液，1.0ml/只。

免疫后21天。第1，3和5组，所有水貂攻水貂病毒性肠炎强毒，每只肌肉注射2.0ml+口服2.0ml，病毒滴毒为10^6.5TCID₅₀/ml，攻毒总量为10^7.1TCID₅₀/只。攻毒后3-8天，采集粪便拭子病毒分离并用1%猪红血球做HA来确定MEV的滴度。

攻毒后，进行临床观察14天，计算保护率。

免疫后21天，第2，4和6组所有水貂攻犬瘟热病毒强毒，每只鼻内接种0.5ml+肌肉注射3.0ml+腹腔接种3.0ml，病毒滴度为10^4.2TCID₅₀/ml，攻毒总量为10^5.0TCID₅₀/只。攻毒后，进行临床观察21天，计算保护率。

结果：

所有水貂免疫后未发现异常情况。

水貂病毒性肠炎病毒攻毒结果：免疫组(第1和3组)所有水貂健活，对照组(第5组)出现典型的肠炎症状并且全部死亡；粪便拭子MEV滴度：免疫组(第1和3组)所有水貂在攻毒后粪便中测MEVHA滴度为0；对照组(第5组)粪便中HA检测MEV滴度均>1:128。

水貂犬瘟热病毒攻毒结果：免疫组(第2和4组)所有水貂健活，对照组(第6组)出现典型的犬瘟热症状并且2只死亡。

结论：本发明减毒疫苗株可以与水貂犬瘟热病毒弱毒株制成的二联疫苗，并且这二联疫苗对水貂病毒性肠炎和犬瘟热的保护率均是100%。

实施例10减毒疫苗对水貂的免疫持续期试验

方法：取7只约9-10周龄水貂，随机分为2组，第1组5只，第2组2只。

第1组，每只水貂肌肉注射接种1.0ml含FPLV-NA0410^4.0TCID50/只。第2组，每只水貂肌肉注射接种细胞培养液，1.0ml/只。

免疫后，第21天、2个月、4个月和7个月采血，分离血清，测MEVHI抗体，结果见表10。

表10水貂免疫后的血清中抗MEVHI抗体

注：抗MEVHI抗体≤1:10为阴性，>1:10为阳性。

所有免疫水貂的MEVHI抗体均≥1:320，这抗体水平远高于可提供保护的公认抗体效价1:80。因此，本发明减毒疫苗株对水貂病毒性肠炎的持续期至少7个月。

菌种保藏

猫泛白细胞减少症病毒（Felinepanleukopeniavirus）FPLV-NA04(减毒株)，于2013年01月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCCNO:V201301。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种猫泛白细胞减少症病毒的减毒株，其特征在于，所述减毒株是保藏号为CCTCCNO:V201301的猫泛白细胞减少症病毒减毒疫苗株。

2.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物含有疫苗上可接受的载体和权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒的减毒株。

3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为二联疫苗。

4.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为多联疫苗。

5.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还含有源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：

(a)犬瘟热病毒；

(b)水貂绿脓杆菌；

(c)猫嵌杯状病毒；

(d)猫疱疹病毒。

6.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物包括：口服剂或注射剂型。

7.权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒的减毒株的用途，其特征在于，用于制备预防猫泛白细胞减少症的疫苗组合物。

8.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)对保藏号为CCTCC.V201301的猫泛白细胞减少症减毒疫苗株进行培养，从而制得权利要求1所述的减毒疫苗株；

9.一种猫泛白细胞减少症的多联疫苗，其特征在于，所述多联疫苗是包含(i)权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒的减毒株；和(ii)源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：

(ii)犬瘟热病毒；

(iii)水貂绿脓杆菌；

(iv)猫嵌杯状病毒；

(v)猫疱疹病毒。