ES2925232T3

ES2925232T3 - Proceso para la formulación farmacéutica liofilizada de una proteína terapéutica

Info

Publication number: ES2925232T3
Application number: ES18779167T
Authority: ES
Inventors: Clea Talley
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2018-09-10
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2038-09-10
Also published as: JP2023126930A; CL2020000625A1; MX2020002896A; EP3681483B1; US20190083402A1; LT3681483T; EP3681483A1; WO2019055357A1; AU2018334502A1; EA202090731A1; PL3681483T3; CN111148510A; US20210369616A1; DK3681483T3; KR20200054251A; MA50239A; IL272513A; IL272513B; PT3681483T; CA3072600A1

Abstract

Esta invención se refiere a un proceso para hacer una formulación farmacéutica liofilizada de una proteína terapéutica, que comprende (a) proporcionar una formulación de una cantidad a granel de la proteína terapéutica, (b) medir la concentración de la proteína terapéutica en dicha formulación a granel, (c) ajustar el peso de llenado de la proteína en dicha formulación a granel para lograr una dosis fija de la proteína, y (d) liofilizar la formulación ajustada por peso de llenado de proteína para lograr una formulación final en un recipiente, en el que la concentración del producto después de la reconstitución con un el volumen fijo está dentro de un rango de aceptación predeterminado. El proceso es particularmente adecuado para formulaciones con bajas concentraciones de proteínas (p. ej., 0,05 mg/mL a 20 mg/mL). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para la formulación farmacéutica liofilizada de una proteína terapéutica

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procesos de preparación de formulaciones farmacéuticas liofilizadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En los últimos diez años, los avances en la tecnología han hecho posible producir una variedad de moléculas activas para aplicaciones farmacéuticas. A medida que avanza la naturaleza de la comprensión de los mecanismos de acción biológica, estas moléculas se pueden diseñar para ciertos atributos, donde pequeñas cantidades de producto pueden ser eficaces.

Debido a que estas moléculas pueden ser más grandes y/o más complejas que los fármacos orgánicos e inorgánicos tradicionales (es decir, que poseen múltiples grupos funcionales, además de estructuras tridimensionales complejas), la formulación de dichos productos plantea problemas especiales. Para que un producto siga siendo activo biológicamente, una formulación debe conservar intacta la integridad conformacional de al menos una secuencia central de los aminoácidos de la proteína, mientras que al mismo tiempo proteja los múltiples grupos funcionales de las proteína de la degradación. Las vías de degradación para las proteínas pueden implicar inestabilidad química (es decir, cualquier proceso que implique la modificación de la proteína por formación o escisión de enlaces dando como resultado una nueva entidad química) o inestabilidad física (es decir, cambios en la estructura de orden superior de la proteína). La inestabilidad química puede resultar de desamidación, racemización, hidrólisis, oxidación, beta eliminación o intercambio de disulfuro. La inestabilidad física puede resultar de, por ejemplo, desnaturalización, agregación, precipitación o adsorción. Las tres vías de degradación de proteínas más comunes son la agregación, la desamidación y la oxidación de proteínas. Cleland et al. (1993), Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377.

Estas moléculas diseñadas, debido a su naturaleza sintética, se liofilizan (se secan por congelación) predominantemente, ya que la presentación puede proporcionar estabilidad en anaquel mejorada. La liofilización es una técnica empleada comúnmente para conservar proteínas que sirve para retirar el agua de la preparación de proteína de interés. El secado por congelación, o la liofilización, es un proceso por el que el material a secar se congela primero y luego el hielo o disolvente congelado se retira por sublimación en un entorno de vacío. Se puede incluir un excipiente en las formulaciones preliofilizadas para potenciar la estabilidad durante el proceso de secado por congelación y/o para mejorar la estabilidad del producto liofilizado tras el almacenamiento. Pikal, M. (1990), Biopharm.

3(9)26-30 y Arakawa et al. (1991), Pharm. Res. 8(3):285-291.

El documento de patente WO 2013/096791 A1 desvela un proceso de liofilización para proteínas que se van a reconstituir en bajas concentraciones para administración parenteral.

Una molécula diseñada con dianas biológicas específicas y los requisitos de dosis resultante para el producto plantea nuevos problemas para el proceso de fabricación. La técnica actual implica un proceso simple, donde el producto se formula a un concentración seleccionada y luego se envasa en llena a un volumen establecido.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un proceso de generación de formulaciones farmacéuticas liofilizadas de una proteína terapéutica. En particular, se refiere a la formulación, el llenado y la garantía de la cantidad requerida de producto presente después de la reconstitución con un volumen fijo de diluyente de un producto liofilizado para su uso.

Según la presente invención, se proporciona un proceso de preparación de una formulación farmacéutica liofilizada de una proteína terapéutica, que comprende:

(a) proporcionar una formulación de una cantidad en masa de la proteína terapéutica,

(b) medir la concentración de la proteína terapéutica en dicha formulación en masa,

(c) ajustar el peso de llenado de la proteína en dicha formulación en masa para lograr una dosis fija de la proteína, y

(d) liofilizar la formulación ajustada en el peso de llenado de proteína para lograr una formulación final en un envase.

en donde la concentración de producto después de la reconstitución con un volumen fijo está dentro de un intervalo de aceptación predeterminado y en donde el peso de llenado ajustado de la proteína se calcula según una fórmula específica como se reivindica.

En el proceso anterior, se prefiere que la concentración de proteína en la formulación final sea inferior o igual a aproximadamente 20 o 25 mg/ml, siendo más preferido aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,05 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml y aproximadamente 21 mg/ml. Las proteínas terapéuticas preferidas en los procesos de la presente invención son romiplostim, blinatumomab, infliximab, trastuzumab, AMG 701 y AMG 330. AMG 701 y AMG 330 son construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico y otras construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico (por ejemplo, acopladores biespecíficos de linfocitos T) son proteínas terapéuticas preferidas en los procesos de la invención. Los excipientes farmacéuticos preferidos presentes en la formulación comprenden azúcares, siendo los más preferidos la trehalosa, la sacarosa y un hidrato de cualquiera. Los excipientes farmacéuticos preferidos también comprenden tampones, siendo preferidos la histidina, el ácido cítrico monohidrato, el fosfato de sodio, el fosfato de potasio y el ácido glutámico. Los excipientes preferidos comprenden además tensioactivos, siendo los más preferidos polisorbato 20 y polisorbato 80. Los excipientes preferidos y las proteínas terapéuticas usadas según los procesos de la presente invención aparecen en la Tabla 1, con aproximadamente las concentraciones preferidas de cada una de las proteínas y excipientes que se enumeran a continuación.

Tabla I-Componentes de formulación preferidos

Además, según la presente invención, la formulación puede comprender otros excipientes como se describen a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un mapa de superficie de respuesta que muestra un espacio de diseño de ejemplo para un producto de baja dosis en el que la formulación y el peso de llenado seguirían una estrategia de control típica. El espacio gris representa donde la variabilidad del método/reconstitución tendría más del 50 % de probabilidad de tener un resultado de concentración de proteína fallido. El cuadrado grande muestra el actual intervalo operativo para el desarrollo de la formulación. El rectángulo más pequeño muestra un intervalo operativo eficaz.

La Figura 2 es un mapa de superficie de respuesta que muestra un espacio de diseño de ejemplo para un producto de baja dosis en el que se considera la osmolalidad, además de la concentración en masa y el volumen de llenado. La región gris clara muestra la especificación de concentración de medicamento escalonada en donde la variabilidad del método/reconstitución tendría más del 50 % de probabilidad de tener un resultado de concentración de proteína fallido. El área en gris oscuro muestra la especificación de osmolalidad. El rectángulo muestra el intervalo del espacio de diseño para el peso de llenado (eje x) y la concentración en masa formulada (eje y) para el control durante el proceso (IPC)/intervalo de operación del límite de alerta (ALOR).

La Figura 3 es un mapa de superficie de respuesta que muestra un ejemplo de un peso de llenado viable, pero no tolerante a fallos, y la estrategia de control de la formulación. La curva y la fecha de dos puntas muestran el probable error del objetivo de llenado. El área gris clara representa la especificación de concentración de medicamento escalonada, mostrando el área gris clara donde la variabilidad del método/reconstitución tendría más del 50 % de probabilidad de tener un resultado de concentración de proteína fallido. El área gris oscura define la especificación de osmolalidad. El rectángulo muestra IPC/ALOR.

La Figura 4 es un mapa de superficie de respuesta que muestra un ejemplo de un peso de llenado y estrategia de control de la formulación con dificultad en el límite del control de intervalo, con un peso en masa formulado más bajo y de llenado más bajo. La curva izquierda y la fecha de dos puntas muestra el probable error del objetivo de llenado en un volumen de llenado bajo. La curva derecha y la flecha de dos puntas muestran el probable error del objetivo de llenado con un mayor volumen de llenado. El área gris clara representa la especificación de concentración de medicamento escalonada, mostrando el área gris clara donde la variabilidad del método/reconstitución tendría más del 50 % de probabilidad de tener un resultado de concentración de proteína fallida. El área gris oscura define la especificación de osmolalidad. El rectángulo muestra el IPC/ALOR.

La Figura 5 es un mapa de superficie de respuesta que muestra un ejemplo de una estrategia combinada de uso del resultado en masa de formulación con luego ajustar el punto de referencia del peso de llenado basado en una dosis de producto total en el objetivo del vial, que da como resultado un proceso de fármaco liofilizado viable y tolerante al error. La curva y la flecha de dos puntas muestran el probable error del objetivo de llenado. El área gris clara define la especificación de concentración de medicamento escalonada como en las Figuras 1 a 4. El área gris oscura define la especificación de osmolalidad. El romboide muestra IPC/ALOR, cortado por la especificación de osmolalidad a los volúmenes de llenado más altos dentro de IPC/ALOR.

La Figura 6 muestra los pesos de llenado normalizados frente a la concentración de proteína del producto después de la reconstitución como se determina según el Ejemplo 1 en lo sucesivo.

La Figura 7 muestra los pesos de llenado normalizados frente a la osmolalidad como se determina según el Ejemplo 1 en lo sucesivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definición de términos

En la descripción que sigue, se usan ampliamente varios términos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de la invención.

A menos que se especifique de otro modo, "un", "una", "el", "la" y "al menos un" se usan indistintamente y significan uno o más de uno. Además, a menos que se requiera de otro modo por el contexto, términos en singular deben incluir pluralidades y términos en plural deben incluir el singular.

Como se usa en el presente documento, una "formulación farmacéutica" o una "formulación" es una composición estéril de (i) un fármaco farmacéuticamente activo, tal como una proteína biológicamente activa, que es adecuada para administración parenteral (que incluye, pero no se limita a, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, aerosolizada, intrapulmonar, intranasal e intratecal) a un paciente en necesidad de la misma y (ii) uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, diluyentes, y otros aditivos considerados seguros por la Administración Federal de Fármacos u otras autoridades nacionales extranjeras. Las formulaciones farmacéuticas incluyen disoluciones líquidas (por ejemplo, acuosas) que pueden ser directamente administradas, y polvos liofilizados que se pueden reconstituir en disoluciones añadiendo un diluyente antes de la administración. El término "formulación farmacéutica" excluye específicamente, sin embargo, composiciones para administración tópica a pacientes, composiciones para ingestión oral y composiciones para nutrición parenteral.

"Estabilidad en almacén", como se usa en el presente documento, significa el periodo de almacenamiento durante el cual un principio activo (por ejemplo, un anticuerpo) en una formulación farmacéutica tiene degradación mínima (por ejemplo, no más de aproximadamente del 5 % al 10 % de degradación) cuando la formulación farmacéutica se almacena en condiciones de almacenamiento especificadas (por ejemplo, 2-8 °C). Las técnicas de evaluación de la degradación varían dependiendo de la identidad de la proteína en la formulación farmacéutica. Las técnicas a modo de ejemplo incluyen cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)-HPLC para detectar, por ejemplo, agregación; (RP)-HPLC de fase inversa para detectar, por ejemplo, la fragmentación de proteínas; HPLC de intercambio iónico para detectar, por ejemplo, cambios en la carga de la proteína; y espectrometría de masas, espectroscopia de fluorescencia, espectroscopía de dicroismo circular (CD), espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) y espectroscopía Raman para detectar cambios conformacionales de las proteínas. Todas estas técnicas se pueden usar individualmente o en combinación para evaluar la degradación de la proteína en la formulación farmacéutica y determinar la estabilidad en almacén de esa formulación. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención presentan preferentemente no más de aproximadamente del 5 al 10 % de aumentos en la degradación (por ejemplo, fragmentación, agregación o desplegamiento) durante dos años cuando se almacenan a 2-8 °C.

Como se usa en el presente documento, formulaciones "estables" de proteínas biológicamente activas son formulaciones que presentan o (i) agregación reducida y/o pérdida reducida de actividad biológica de al menos el 20 % tras el almacenamiento a 2-8 °C durante al menos 2 años en comparación con una muestra de fórmula de control, o (ii) agregación reducida y/o pérdida de actividad biológica reducida en condiciones de estrés térmico (por ejemplo, 25 °C durante 1 semana a 12 semanas; 40 °C durante 1 a 12 semanas; 52 °C durante 7-8 días, etc.). En una realización, una formulación se considera estable cuando la proteína en la formulación retiene su estabilidad física, estabilidad química y/o actividad biológica.

Se puede decir que una proteína "retiene su estabilidad física" en una formulación si, por ejemplo, no muestra signos de agregación, precipitación y/o desnaturalización tras el examen visual de color y/o claridad, o como se mide por la dispersión de luz UV o por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o electroforesis, tales como con referencia a turbidez o formación de agregados.

Se puede decir que una proteína "retiene su estabilidad química" en una formulación si, por ejemplo, la estabilidad química en un momento dado es tal que no resulta ninguna entidad química nueva de la modificación de la proteína por formación o escisión de enlaces. En una realización adicional, la estabilidad química se puede evaluar detectando y cuantificando formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar, por ejemplo, modificación del tamaño (por ejemplo, corte), que se puede evaluar usando cromatografía de exclusión por tamaño, SDS-PAGE y/o espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz/tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS). Otros tipos de alteración química incluyen, por ejemplo, alteración de carga (por ejemplo, resultante de desamidación), que se puede evaluar por cromatografía de intercambio iónico. La oxidación es otra modificación química comúnmente observada.

Se puede decir que una proteína "retiene su actividad biológica" en una formulación farmacéutica con respecto a la proteína si, por ejemplo, el porcentaje de actividad biológica de la proteína formulada (por ejemplo, un anticuerpo) como se ha determinado por un ensayo (por ejemplo, un ensayo de unión al antígeno) en comparación con la disolución de control está entre o aproximadamente el 50 % y aproximadamente el 200 %, aproximadamente el 60 % y aproximadamente el 170 %, aproximadamente el 70 % y aproximadamente el 150 %, aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 125 %, o aproximadamente el 90 % y aproximadamente el 110 %. En una realización adicional, se puede decir que una proteína "retiene su actividad biológica" en una formulación farmacéutica si, por ejemplo, sin limitación, la actividad biológica de la proteína en un momento dado es al menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %.

Como se usa en el presente documento, los términos "que comprende" y "comprende" pretenden significar que las formulaciones y métodos incluyen los elementos enumerados, pero no excluyen otros elementos no enumerados. Los términos "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en", cuando se usan para definir formulaciones y métodos, incluyen los elementos enumerados, excluyen elementos no enumerados que alteran la naturaleza básica de la formulación y/o método, pero no excluyen otros elementos no enumerados. Por lo tanto, una formulación que consiste esencialmente en los elementos definidos en el presente documento no excluiría cantidades traza de otros elementos, tales como contaminantes de cualquier método de aislamiento y purificación o vehículos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), conservantes y similares, pero excluiría, por ejemplo, aminoácidos no especificados adicionales. Los términos "que consiste en" y "consiste en", cuando se usan para definir formulaciones y métodos, excluyen más que los oligoelementos de otros componentes y etapas de método sustanciales para administrar las composiciones descritas en el presente documento. Las realizaciones definidas por cada una de estos términos de transición están dentro del alcance de la presente divulgación y las invenciones integradas en el presente documento.

El término "aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, la proteína se purificará (1) hasta más del 95 % en peso de anticuerpo como se ha determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos aminoterminal o interna por uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. La proteína aislada incluye la proteína in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural de la proteína no estará presente. En general, sin embargo, la proteína aislada se preparará por al menos una etapa de purificación.

La invención se refiere a procesos para formulaciones farmacéuticas de proteínas terapéuticas, tales como anticuerpos. Los "anticuerpos" (Ab) y el sinónimo "inmunoglobulinas" (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión por un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad por antígenos. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por ejemplo, en bajos niveles por el sistema linfático y en niveles elevados por mielomas. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" o "péptido(s) de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, un derivado de anticuerpo, un análogo de anticuerpo, un anticuerpo genéticamente alterado, un anticuerpo que tiene una marca detectable, un anticuerpo que compite por la unión específica con un anticuerpo desvelado en esta especificación, o un fragmento de unión al antígeno (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpo de un solo dominio) del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica e incluye anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y biespecíficos. En ciertas realizaciones, los fragmentos de unión al antígeno se producen, por ejemplo, por técnicas de ADN recombinante. En realizaciones adicionales, los fragmentos de unión al antígeno se producen por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión al antígeno incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab)', F(ab')2, Fv y anticuerpos monocatenarios.

El término "anticuerpos intactos", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Por lo tanto, este término incluye sin limitación anticuerpos completamente humanos, anticuerpos genéticamente alterados, anticuerpos biespecíficos y derivados de anticuerpos siempre que dichos anticuerpos comprendan dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridomas. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, que incluye cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al método por el que se produce.

Los anticuerpos monoclonales y las construcciones de anticuerpo formuladas según la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, mientras que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. N.° 4.816.567; Morrison et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión al antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio superior, etc.) y secuencias de la región constante humana. Se ha descrito una variedad de enfoques de preparación de anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison et al. (1985), Proc. Natl. Acad Sci. U S A.

81:6851; Takeda et al. (1985), Nature 314:452. Cabilly et al., patente de EE. UU. N.° 4.816.567; Boss et al., patente de EE. UU. N.° 4.816.397; Tanaguchi et al., documentos de patente EP 0171496; EP 0173494; y GB 2177096.

Los anticuerpos monoclonales y las construcciones de anticuerpo formuladas según la presente invención incluyen específicamente anticuerpos denominados "humanos" o "completamente humanos". Los términos "anticuerpo humano" y "anticuerpo completamente humano" se refieren cada uno a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, que incluye anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas; por ejemplo, anticuerpos Xenomouse® y anticuerpos como se describen por Kucherlapati et al. en la patente de EE. UU. N.° 5.939.598.

El término "anticuerpos genéticamente alterados" significa anticuerpos en donde la secuencia de aminoácidos ha sido variada de la de un anticuerpo nativo. Debido a la relevancia de las técnicas de ADN recombinante en la generación de anticuerpos, no se necesita estar confinado a las secuencias de aminoácidos descubiertas en los anticuerpos naturales; los anticuerpos pueden ser rediseñados para obtener características deseadas. Las posibles variaciones son muchas y varían de cambios a solo un aminoácido o a algunos aminoácidos para completar el rediseño de, por ejemplo, la región variable y/o constante. Los cambios en la región constante se harán, en general, para mejorar o alterar las características, tales como fijación del complemento, interacción con membranas y otras funciones efectoras, así como fabricabilidad y viscosidad. Los cambios en la región variable se harán para mejorar las características de unión al antígeno.

Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y las regiones Ch1 y variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada.

Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios Ch1 y Ch2, de manera que se pueda formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas para formar una molécula de F(ab')2.

Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios Ch1 y Ch2, de manera que se pueda formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas.

Los términos "fragmento Fv" y "anticuerpo monocatenario" se refieren a polipéptidos que contienen regiones variables del anticuerpo de tanto las cadenas pesadas como ligeras, pero que carecen de regiones constantes. Al igual que un anticuerpo completo, es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de solo aproximadamente 25 kDa, los fragmentos Fv son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kD) que están compuestos de dos cadenas pesadas de proteína y dos cadenas ligeras, e incluso más pequeños que los fragmentos Fab (aproximadamente 50 kDa, una cadena ligera y la mitad de una cadena pesada).

Un "anticuerpo de un solo dominio" es un fragmento de anticuerpo que consiste en una única unidad de dominio Fv, por ejemplo, Vh o Vl. Al igual que un anticuerpo completo, es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de solo 12-15 kDa, los anticuerpos de un solo dominio son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kDa) que están compuestos de dos cadenas pesadas de proteína y dos cadenas ligeras, e incluso más pequeños que los fragmentos Fab (aproximadamente 50 kDa, una cadena ligera y la mitad de una cadena pesada) y fragmentos de una sola cadena variable (aproximadamente 25 kDa, dos dominios variables, uno de una cadena ligera y uno de una cadena pesada). Los primeros anticuerpos de un solo dominio se manipularon de anticuerpos de cadena pesada encontrados en camélidos. Aunque la mayoría de la investigación en los anticuerpos de un solo dominio se basa actualmente en dominios variables de la cadena pesada, también se ha mostrado que los dominios variables de la cadena ligera y los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopes diana.

El término "biespecífico", como se usa en el presente documento, se refiere a una construcción de anticuerpo que es "al menos biespecífico", es decir, comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en donde el primer dominio de unión se une a un antígeno o diana (por ejemplo, CD3) y el segundo dominio de unión se une a otro antígeno o diana (por ejemplo, BCMA; por ejemplo, CD33). Por consiguiente, las construcciones de anticuerpo según la invención comprenden especificidades por al menos dos antígenos o dianas diferentes. El término "construcción de anticuerpo biespecífico" de la invención también engloba construcciones de anticuerpo multiespecífico, tales como construcciones de anticuerpo triespecífico, incluyendo los últimos tres dominios de unión, o construcciones que tienen más de tres especificidades (por ejemplo cuatro, cinco...).

Dado que las construcciones de anticuerpo según la invención son (al menos) biespecíficas, no existen naturalmente y son notablemente diferentes de los productos que existen de forma natural. Una construcción de anticuerpo "biespecífico" o inmunoglobulina es, por lo tanto, un anticuerpo híbrido artificial o inmunoglobulina que tiene al menos dos sitios de unión distintos con diferentes especificidades. Las construcciones de anticuerpo biespecífico se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

Los al menos dos dominios de unión y los dominios variables de la construcción de anticuerpo de la presente invención pueden o pueden no comprender conectores peptídicos (péptidos espaciadores). El término "conector peptídico" comprende según la presente invención una secuencia de aminoácidos por la que las secuencias de aminoácidos de un dominio (variable y/o de unión) y otro dominio (variable y/o de unión) de la construcción de anticuerpo de la invención se unen entre sí. Una característica técnica esencial de dicho conector peptídico es que no comprende actividad de polimerización. Entre los conectores peptídicos adecuados están los descritos en las patentes de EE. UU.

4.751.180 y 4.935.233 o el documento de patente WO 88/09344. Los conectores peptídicos también se pueden usar para unir otros dominios o módulos o regiones (tales como dominios que prolongan la semiviva) a la construcción de anticuerpo de la invención.

En el supuesto caso de que se use un conector, este conector es preferentemente de una longitud y secuencia suficiente para garantizar que cada uno del primer y segundo dominios puedan retener, independientemente entre sí, sus especificidades de unión diferenciales. Para conectores peptídicos que conectan los al menos dos dominios de unión (o dos dominios variables) en la construcción de anticuerpo de la invención, se prefieren los conectores peptídicos que comprenden solo un número reducido de restos de aminoácidos, por ejemplo 12 restos de aminoácidos o menos. Por lo tanto, se prefieren los conectores peptídicos de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 restos de aminoácidos. Un conector peptídico previsto con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o un aminoácido(s), en donde se prefieren los conectores ricos en Gly. Un aminoácido "individual" particularmente preferido en el contexto de dicho "conector peptídico" es Gly. Por consiguiente, dicho conector peptídico puede consistir en el aminoácido individual Gly. Otra realización preferida de un conector peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), o polímeros de la misma, es decir, (Gly4Ser)x, donde x es un número entero de 1 o mayor (por ejemplo, 2 o 3). Las características de dicho conector peptídico, que comprenden la ausencia de la promoción de estructuras secundarias, se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol. Immunol. (1992) 29, 21-30) y Raag y Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Se prefieren los conectores peptídicos que además no promueven estructuras secundarias. El enlace de dichos dominios entre sí se puede proporcionar, por ejemplo, por ingeniería genética, como se describe en los ejemplos. Los métodos de preparación de construcciones monocatenarias biespecíficas fusionadas y operativamente unidas y su expresión en células de mamífero o bacterias se conocen bien en la técnica (por ejemplo, documento de patente WO 99/54440 o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

Según una realización particularmente preferida, y como se documenta en los ejemplos adjuntos, las construcciones de anticuerpo AMG 701 y AMG 330 de la invención son cada una una "construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico", más preferentemente un "Fv monocatenario" biespecífico (scFv). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, estén codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un conector sintético - como se describe anteriormente en este documento - que les permite ser preparados como una única cadena de proteína en las que se emparejan las regiones VL y VH para formar una molécula monovalente; véanse, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se evalúan para la función del mismo modo, ya que son anticuerpos completos o de longitud completa. Un fragmento de una sola cadena variable (scFv) es, por lo tanto, una proteína de fusión de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de inmunoglobulinas, normalmente conectadas con un péptido conector corto de aproximadamente diez a aproximadamente 25 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 15 a 20 aminoácidos. El conector es normalmente rico en glicina para su flexibilidad, así como serina o treonina para su solubilidad, y puede o conectar el extremo N de VH con el extremo C de VL, o viceversa. Esta proteína retiene la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la retirada de las regiones constantes y la introducción del conector.

Se conocen en la técnica moléculas biespecíficas monocatenarias y se describen en el documento de patente WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, entre otros, la patente de EE. UU.4.946.778) se pueden adaptar para producir construcciones de anticuerpo monocatenario que reconocen específicamente una diana (s) elegida(s).

Los fragmentos variable monocatenarios bivalentes (también denominados divalentes) o biespecíficos (bi-scFv o discFv) que tienen el formato (scFv)2 se pueden manipular uniendo dos moléculas de scFv (por ejemplo, con conectores como se describe anteriormente en este documento). Si estas dos moléculas de scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula (scFv)2 resultante se denominará preferentemente bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítope diana). Si las dos moléculas scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula (scFv)2 resultante se denominará preferentemente biespecífica. El enlace se puede hacer produciendo una única cadena de péptido con dos regiones VH y dos regiones VL, dando scFv en tándem (véase, por ejemplo, Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas de scFv con péptidos conectores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen (por ejemplo, aproximadamente cinco aminoácidos), forzando a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos (véase, por ejemplo, Hollinger, Philipp et al., (julio de 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).

Como se describe en el presente documento anteriormente, la invención proporciona una realización preferida en donde la construcción de anticuerpo está en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)2, mAb de un solo dominio scFv, diacuerpos y oligómeros de cualquiera de aquellos formatos.

Según una realización también preferida de la construcción de anticuerpo de la invención, la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VL) de un dominio de unión que se une o al antígeno diana CD3 y CD33 o BCMA no se conectan directamente por un conector peptídico anteriormente descrito, sino que el dominio de unión se forma debido a la formación de una molécula biespecífica como se describe para el diacuerpo. Por lo tanto, la cadena de VH del dominio de unión a CD3 se puede fusionar con VL del dominio de unión a CD33 o BCMA por dicho conector peptídico, mientras que la cadena de VH del dominio de unión a CD3 está fusionada con VL del dominio de unión a CD33 o BCMA por dicho conector peptídico.

Los términos "aminoterminal" y "carboxiterminal" y sus formas abreviadas "extremo N" y "extremo C" se usan en el presente documento para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. Donde el contexto lo permita, estos términos se usan con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia situada carboxiterminal con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido se sitúa próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos o naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen glicina y tanto los isómeros ópticos D como L, análogos de aminoácidos y peptidomiméticos, que incluyen, sin limitación, análogos de N-acetilo de isómeros ópticos D o L (por ejemplo, N-acetil arginina). En algunos aspectos, el término aminoácido se refiere a aminoácidos monoméricos.

En general, las nomenclaturas usadas a propósito de, y las técnicas de, cultivo de células y de tejido, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se realizan, en general, según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que son citadas y tratadas en toda la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al. (1992), Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates, y Harlow y Lane (1990), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Cuando las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. La terminología usada a propósito de, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica, descritos en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Las técnicas convencionales se pueden usar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.

Uso de concentraciones formuladas intermedias

El objetivo de la formulación de proteínas es transformar una disolución de proteína recombinante altamente purificada (principio activo) en una forma galénica biofarmacéutica estable y eficaz. Kamerzell et al. (2011), 63(13): 1118-59. La primera etapa, denominada frecuentemente caracterización de la preformulación, implica determinar las propiedades fisicoquímicas de la proteína y las vías de inestabilidad, que permiten el diseño de las formulaciones que contienen diversos excipientes para garantizar la estabilidad de las proteínas en condiciones de almacenamiento definidas. Al mismo tiempo, se necesitan desarrollar métodos analíticos para monitorizar la integridad fisicoquímica y la actividad biológica de las proteínas en las condiciones de formulación (por ejemplo, en presencia de excipientes), junto con especificaciones para definir límites aceptables para cualquier cambio en estos parámetros. Las formulaciones específicas en diferentes concentraciones de proteína con niveles seleccionados de diversos excipientes farmacéuticos se prueban entonces experimentalmente para garantizar la estabilidad, la solubilidad y la tonicidad con respecto a la estabilidad en almacén. Además, se selecciona (por ejemplo, vial, cartucho o jeringa precargada) el envase primario para guardar la mezcla de proteína-excipiente y facilitar la administración parenteral por el paciente o un profesional médico. Todo el fármaco biofarmacéutico o forma farmacéutica de vacuna (proteína, excipientes, envase primario y dispositivo de administración) se debe diseñar para tanto cambiar la escala, permitir la fabricación comercial en condiciones estériles, como para cumplir todas las normas reglamentarias para la producción y la prueba de formas galénicas biofarmacéuticas para uso humano.

El desarrollo de formulaciones empieza, en general, identificando el pH adecuado y el sistema tampón mediante una estrategia de cribado biofísico. Se añaden tampones a la disolución de proteína para estabilizar el pH, que a su vez estabiliza la proteína debido a que una estabilidad de la proteína se asocia, en general, con un estrecho intervalo de pH característico. Véase Garidel y Bassarab (2009), "Impact of formulation design on stability and quality" en: Quality for Biologies: Critical Quality Attributes, Process and Change Control. Production Variation, Characterisation, Impurities and Concerns, Biopharm Knowledge Publishing, London, UK, pp. 94-113 (incorporado como referencia). Otros excipientes de formulación, tales como estabilizadores (por ejemplo, azúcares), agentes de carga (por ejemplo, manitol) y tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 20) se añaden entonces a la disolución de proteína tamponada. Para una formulación liofilizada, entonces se liofiliza dicha mezcla de formulación en forma líquida.

En la liofilización como en otros procesos del medicamento, un control clave es el peso de llenado de la proteína terapéutica para administrar la dosis requerida al paciente. Para productos de mayor concentración, es adecuada una simple estrategia de control de la concentración de producto en la etapa de formulación, seguida del control del peso de llenado como parte del proceso de llenado. Sin embargo, para la administración de dosis muy baja en micro o incluso miligramos de producto, esta simple estrategia para asegurar la administración de dosis empieza a tener problemas en asegurar que el paciente pueda recibir la dosis requerida. Problemas relacionados son que la etiqueta del producto puede no reflejar el producto dentro del envase y que se pueda tener dificultad en extraer el material para su administración. Existe la necesidad, por lo tanto, de un proceso para proporcionar mayor control del peso de llenado de una proteína terapéutica en una formulación farmacéutica liofilizada.

Como se observa anteriormente, una simple estrategia de control de la concentración de producto en la etapa de formulación, seguida entonces del control del peso de llenado como parte del proceso de llenado, es adecuada para concentraciones más altas de proteína terapéutica, pero puede conducir a problemas a concentraciones más bajas. El espacio de diseño para el control del peso de llenado para producto de baja dosis cuando el peso de llenado y el objetivo de formulación se controlan por separado muestra una mayor variabilidad, con una mayor probabilidad de que el producto no cumpla la especificación de comercialización. Debido a la variabilidad de la fabricación, no se puede lograr el control con precisión de la masa formulada debido a la escala del proceso y a la variabilidad inherente del equipo en la fabricación. Otro problema es que la elevada variabilidad es inherente en el producto liofilizado debido a que el producto se debe reconstituir, que también es un proceso variable.

Una estrategia de control típica (mostrada en la Figura 1) tendría más del 50 % de probabilidad de tener un resultado de concentración de proteína fallida. En la Figura 1, la variabilidad global observada de los datos de homogeneidad liofilizada es 0,01 mg/ml. Para asegurar una capacidad mínima, el intervalo operativo promedio debe estar limitado de forma que corresponda a un intervalo de especificación "escalonado" por 3*0,01=0,03 mg/ml. Un proceso que es elegido dentro del espacio blanco tiene calidad inferior al 0,1 % de los viales fuera de especificación (OOS) por lote. Un proceso que es elegido dentro del área sombreada, a diferencia, tiene mayores tasas de OOS. Como se puede apreciar de la Figura 1, el actual intervalo operativo (cuadrado grande) contiene límites de fallo de la formulación deseada. Un intervalo operativo eficaz (rectángulo más pequeño en la Figura 1), sin embargo, requiere tolerancias de llenado más ajustadas que se pueden lograr como parte de tanto la variabilidad de la formulación como el control del peso de llenado.

Por lo tanto, un proceso que también necesita considerar otros atributos de calidad de producto (por ejemplo, osmolalidad, pH), así como concentración de proteína, podría no ser producible o viable por la metodología habitual. La Figura 2 muestra un espacio de diseño de ejemplo en el que se considera una especificación de osmolalidad. El color gris muestra las extensas condiciones de fracaso dentro del IPC/intervalo de operación del límite de alerta.

La metodología convencional también puede producir un peso de llenado viable pero no tolerante a fallos y estrategia de control de la formulación (véase la Figura 3). Como en la Figura 1, IPC/ALOR contiene áreas que no cumplen la especificación de concentración de medicamento. Dentro del área que cumple la especificación de concentración de medicamento (área blanca dentro de IPC/ALOR), hay muy poco margen de error en el objetivo de llenado. Por lo tanto, como se muestra en la Figura 3, la metodología convencional puede producir un proceso con dificultad en el límite del control de intervalo, viable pero sin suficiente tolerancia a fallos.

Un aumento en el volumen de llenado podría no ser suficiente para que una variación de proceso creara una formulación viable con tolerancia a fallos adecuada. La Figura 4 es un mapa de superficie de respuesta en el que se aumenta el volumen de llenado. El intervalo del objetivo de llenado puede ser llevado dentro del IPC/ALOR y las especificaciones de producto, pero la tolerancia a fallos puede seguir siendo inadecuada. El intervalo de peso de llenado con respecto al intervalo permisible de concentración en masa formulada tiene insuficiente tolerancia a fallos.

Si el resultado en masa formulado se usa para ajustar entonces el peso de llenado de proteína terapéutica, el intervalo operativo se puede cambiar suficientemente para permitir una formulación que es tanto viable como suficientemente tolerante a fallos. Como se muestra en la Figura 5, el intervalo operativo modificado (IPC/ALOR) permite que el intervalo del objetivo de llenado esperado esté perfectamente dentro de la concentración y especificaciones de osmolalidad. De esta forma, el intervalo del objetivo de llenado se puede proporcionar dentro de la concentración y otras especificaciones con suficiente tolerancia a fallos.

Hasta la fecha, esta técnica se ha usado para una unidad de mantenimiento de existencias (SKU) de baja dosis para SKU de baja dosis de romiplostim (Nplate®), blinatumomab (Blincyto®), infliximab y trastuzumab. Los detalles del uso de esta técnica aparecen en los Ejemplos de trabajo que siguen.

Excipientes en general

Un reto en las formulaciones es estabilizar el producto contra las agresiones en la fabricación, el transporte y el almacenamiento, que se puede llevar a cabo por ciertos excipientes de formulación. En general, los excipientes se pueden clasificar basándose en los mecanismos por lo que estabilizan las proteínas contra diversas agresiones químicas y físicas. Algunos excipientes alivian los efectos de una agresión específica o regulan una susceptibilidad particular de una proteína específica. Otros excipientes afectan más en general las estabilidades físicas y covalentes de las proteínas.

Los excipientes comunes de las formulaciones líquida y liofilizada de proteína aparecen en la Tabla 2 (véase Kamerzell et al. (2011), Advanced Drug Delivery Rev. 63(13): 1118-59).

Tabla 2: Componentes de excipiente de formulaciones de proteína

Otros excipientes se conocen en la técnica y se pueden encontrar en Powell et al. (1998), "Compendium of Excipients for Parenteral Formulations", PDA J. Pharm. Sci. Tech., 52:238-311.

Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionada en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán qué cantidad o intervalo de excipiente se puede incluir en cualquier formulación particular para lograr una formulación biofarmacéutica de la invención. Por ejemplo, la cantidad y el tipo de una sal a incluir en una formulación biofarmacéutica de la invención se pueden seleccionar basándose en la osmolalidad deseada (es decir, isotónica, hipotónica o hipertónica) de la disolución final, así como las cantidades y la osmolalidad de otros componentes a incluir en la formulación. Similarmente, por ejemplificación con referencia al tipo de poliol o azúcar incluido en una formulación, la cantidad de dicho excipiente dependerá de su osmolalidad.

Los expertos en la técnica pueden determinar qué cantidad o intervalo de excipiente se puede incluir en cualquier formulación particular para lograr una formulación biofarmacéutica de la invención que promueva la retención de la estabilidad del biofármaco. Por ejemplo, la cantidad y el tipo de una sal a incluir en una formulación biofarmacéutica de la invención se pueden seleccionar basándose en la osmolalidad deseada (es decir, isotónica, hipotónica o hipertónica) de la disolución final, así como las cantidades y la osmolalidad de otros componentes a incluir en la formulación. Similarmente, por ejemplificación con referencia al tipo de poliol o azúcar incluido en una formulación, la cantidad de dicho excipiente dependerá de su osmolalidad.

Aproximadamente 5 % (p/vol) de sorbitol, por ejemplo, puede lograr isotonicidad, mientras que se necesita aproximadamente 9 % (p/vol) de un excipiente de sacarosa para lograr la isotonicidad. La selección de la cantidad o el intervalo de concentraciones de uno o más excipientes que se pueden incluir dentro de una formulación biofarmacéutica de la invención se ha ejemplificado anteriormente con referencia a sales, polioles y azúcares. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que las consideraciones descritas en el presente documento y ejemplificadas adicionalmente como referencia a excipientes específicos son igualmente aplicables a todos los tipos y combinaciones de excipientes que incluyen, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, tensioactivos, estabilizadores, agentes de carga, crioprotectores, lioprotectores, antioxidantes, iones metálicos, quelantes y/o conservantes.

Además, donde se informa un excipiente particular en una formulación por, por ejemplo, porcentaje (%) en p/vol, los expertos en la técnica reconocerán que la concentración molar equivalente de ese excipiente también se contempla.

Los expertos habituales en la técnica reconocerían que las concentraciones de los excipientes anteriormente mencionados comparten una interdependencia dentro de una formulación particular. A modo de ejemplo, la concentración de un agente de carga puede ser reducida donde, por ejemplo, exista una alta concentración de proteína/péptido o una alta concentración de agente estabilizante. Además, un experto habitual en la técnica reconocería que, para mantener la isotonicidad de una formulación particular en la que no hay agente de carga, la concentración de un agente estabilizante se ajustaría en consecuencia (es decir, se usaría una cantidad "tonificante" de estabilizador).

Tampones

El pH de la disolución afecta a la integridad química de los restos de aminoácidos de una proteína (por ejemplo, desamidación de Asn y oxidación de Met) y el mantenimiento de su estructura de orden superior. Por lo tanto, los expertos en la técnica usan agentes de tamponamiento para controlar el pH de la disolución y optimizar la estabilidad de las proteínas. La máxima estabilidad de un fármaco de proteína está normalmente dentro de un estrecho intervalo de pH. Varios enfoques (por ejemplo, estudios de estabilidad acelerada y estudios de cribado calorimétrico) son útiles para este fin (Remmele et al. (1999), Biochemistry, 38(16): 5241-7). Una vez se finaliza una formulación, el medicamento se debe fabricar y mantener dentro de una especificación predefinida durante toda su estabilidad en almacén. Por lo tanto, casi siempre se emplean agentes de tamponamiento para controlar el pH en la formulación.

Se emplean habitualmente ácidos orgánicos, fosfatos y Tris como tampones en formulaciones de proteína (véase la Tabla 3). La capacidad del tampón de tamponar especies es máxima a un pH igual al pKa y disminuye a medida el pH que aumenta o se aleja de este valor. El noventa por ciento de la capacidad de tamponamiento existe dentro de una unidad de pH de su pKa. La capacidad de tamponamiento aumenta proporcionalmente al aumentar la concentración del tampón.

Tabla 3: Agentes de tamponamiento comúnmente usados y sus valores de pKa

Además de lo anterior, algunas proteínas terapéuticas pueden ser auto-tamponantes a una concentración farmacéuticamente relevante. Las formulaciones de dichas proteínas no necesitan incluir un tampón convencional en absoluto. Véase la solicitud de patente de EE. UU. 2012/0028877.

Azúcares e hidratos de carbono

Se usan frecuentemente azúcares para estabilizar las proteínas en tanto formulaciones líquidas como liofilizadas. Se cree que los disacáridos, tales como la sacarosa y la trehalosa, estabilizan las proteínas por hidratación preferencial a altas concentraciones en el estado líquido y por interacciones específicas con proteínas y formación de matrices vítreas viscosas en el estado sólido. Las moléculas de azúcar pueden aumentar la viscosidad de las disoluciones de anticuerpos monoclonales, supuestamente debido a un mecanismo de hidratación preferencial. Los alcoholes de azúcar, tales como el sorbitol, pueden estabilizar las proteínas en disolución y en el estado liofilizado. El manitol se usa frecuentemente como agente de carga en formulaciones liofilizadas. La lactosa se usa como un molécula portadora para formulaciones inhaladas de proteínas. Los derivados de ciclodextrina pueden estabilizar las proteínas en formulaciones líquidas de anticuerpos, antígenos de vacuna, y dichas proteínas más pequeñas como factores de crecimiento, interleucina-2 e insulina. Estabilizadores y agentes de carga

Se usan normalmente agentes de carga en formulaciones liofilizadas para potenciar la elegancia del producto y para prevenir el secado. Las condiciones en la formulación se diseñan, en general, de manera que el agente de carga cristalice en la fase amorfa congelada (ya sea durante la congelación o el recocido por encima de Tg') dando la estructura de torta y masa. El manitol y la glicina son ejemplos de agentes de carga usados comúnmente.

Los estabilizadores incluyen una clase de compuestos que puede servir de crioprotectores, lioprotectores y agentes formadores de vidrio. Los crioprotectores actúan estabilizando las proteínas durante la congelación o en el estado congelado a bajas temperaturas (P. Cameron, ed., Good Pharmaceutical Freeze-Drying Practice, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, (1997)). Los lioprotectores estabilizan las proteínas en la forma farmacéutica sólida secada por congelación conservando las propiedades conformacionales de tipo nativas de la proteína durante las etapas de deshidratación de la liofilización. Se han clasificado propiedades en el estado vítreo como "fuertes" o "frágiles" dependiendo de sus propiedades de relajación en función de la temperatura. Es importante que los crioprotectores, lioprotectores y agentes formadores de vidrio permanezcan en la misma fase con la proteína para conferir estabilidad. Los azúcares, polímeros y polioles se clasifican en esta categoría y algunas veces pueden servir para las tres funciones.

Los polioles engloban una clase de excipientes que incluyen azúcares (por ejemplo, manitol, sacarosa, sorbitol) y otros alcoholes polihidroxilados (por ejemplo, glicerol y propilenglicol). El polímero polietilenglicol (PEG) se incluye en esta categoría. Los polioles se usan comúnmente como excipientes estabilizantes y/o agentes de isotonicidad en tanto formulaciones de proteína parenterales líquidas como liofilizadas. Con respecto a la serie de Hofmeister, los polioles son cosmotrópicos y se excluyen preferentemente de la superficie de la proteína. Los polioles pueden proteger a las proteínas de las vías de degradación tanto físicas como químicas. Los codisolventes excluidos preferentemente aumentan la tensión superficial eficaz del disolvente en la interfase de la proteína, por lo que la mayoría de las conformaciones de proteína energéticamente favorables son aquellas con las áreas superficiales más pequeñas.

El manitol es un agente de carga popular en formulaciones liofilizadas debido a que cristaliza en la fase de proteína amorfa durante la liofilización, confiriendo estabilidad estructural a la torta (por ejemplo, Leukine®, Enbrel ® - Lyo, Betaseron®). En general, se usa en combinación con un crio- y/o lioprotector, como la sacarosa. Debido a la tendencia del manitol a cristalizar en condiciones congeladas, el sorbitol y la sacarosa son los agentes de tonicidad/estabilizadores preferidos en las formulaciones líquidas para proteger el producto contra los estreses de congelación-descongelación encontrados durante el transporte o cuando se congela la masa antes de la fabricación. El sorbitol y la sacarosa son mucho más resistentes a la cristalización y, por lo tanto, es menos probable que se separen las fases de la proteína. Es interesante señalar que, mientras que el manitol se ha usado en cantidades tonificantes en varias formulaciones líquidas comercializadas, tales como Actimmune®, Forteo® y Rebif®, las etiquetas de producto de estos fármacos llevan una advertencia de 'No congelar'. Se debe evitar el uso de azúcares reductores (que contienen grupos aldehído o cetona libres), tales como glucosa y lactosa, debido a que pueden reaccionar y glicar los restos lisina y arginina de la superficie de las proteínas por la reacción de Maillard de aldehídos y aminas primarias (Chevalier F, et al., Nahrung, 46(2): 58-63 (2002); Humeny A, et al., J Agric Food Chem. 50(7): 2153-60 (2002)). La sacarosa se puede hidrolizar dando fructosa y glucosa en condiciones ácidas (Kautz C. F. y Robinson A. L., JACS, 50(4) 1022-30 (1928)) y, por consiguiente, puede provocar la glicación.

En realizaciones particulares de las presentes composiciones, un estabilizador (o una combinación de estabilizadores) se añade a una formulación de liofilización para prevenir o reducir la agregación inducida por la liofilización o inducida por el almacenamiento y la degradación química. Una disolución neblinosa o turbia tras la reconstitución indica que la proteína ha precipitado. El término "estabilizador" significa un excipiente capaz de prevenir la agregación u otra degradación física, así como la degradación química (por ejemplo, autólisis, desamidación, oxidación, etc.) en un estado acuoso y sólido. Los estabilizadores que se emplean convencionalmente en las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa, manitol, sorbitol, glicina, HCl de arginina, compuestos de poli-hidroxi, que incluye polisacáridos, tales como dextrano, almidón, hidroxietilalmidón, ciclodextrinas, N-metilpirolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro sódico, Carpenter et al. (1991), Develop. Biol. Standard 74:225.

Osmolitos

Los osmolitos actualmente usados como excipientes de formulación de proteínas se enumeran en la Tabla 2. Otros osmolitos comúnmente usados encontrados en la naturaleza que pueden ser útiles como excipientes incluyen taurina, betaína, N-óxido de trimetilamina (TMAO), colina-O-sulfato y sarcosina.

Proteínas y polímeros

Los excipientes basados en proteínas añaden complejidad a la formulación, especialmente en el desarrollo de métodos analíticos para monitorizar la estabilidad del fármaco basado en proteína o vacuna en presencia de un excipiente basado en proteína. Los polímeros se han evaluado como excipientes (por ejemplo, como agentes de carga) en formulaciones de proteína liofilizadas. Se están estudiando formulaciones de liberación controlada de fármacos de proteína y vacunas, en las que las proteínas se formulan con polímeros, tales como poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y polietilenglicol (PEG). Se han utilizado muchos polímeros solubles en agua adicionales (por ejemplo, hidroxietilcelulosa (HEC), carboximetilcelulosa (CMC)) para formulaciones tópicas de fármacos de proteína.

El PEG puede estabilizar las proteínas por dos mecanismos dependientes de la temperatura diferentes. A temperaturas más bajas, se excluye preferentemente de la superficie de la proteína, pero se ha mostrado que interactúa con la forma no plegada de la proteína a temperatura más alta dada su naturaleza anfipática (Lee y Lee (1987), Biochemistry, 26(24): 7813-9). Puede proteger las proteínas mediante exclusión preferencial a temperaturas más bajas, pero posiblemente reduciendo el número de colisiones productivas entre moléculas no plegadas a temperaturas más altas. El PEG también es un crioprotector y se ha empleado en Recombinate®, una formulación liofilizada de factor antihemófilo recombinante.

Antioxidantes

Muchas fuentes diferentes pueden oxidar restos de proteína. El daño oxidativo de las proteínas se puede minimizar controlando cuidadosamente el proceso de fabricación y almacenamiento del producto, que incluye factores tales como oxígeno atmosférico, temperatura, exposición a la luz y contaminación química. Donde dichos controles sean inadecuados, se pueden incluir excipientes de antioxidante en la formulación.

Los excipientes de antioxidante farmacéutico más comúnmente usados son agentes reductores, secuestrantes de oxígeno/radicales libres o agentes quelantes. Los antioxidantes en las formulaciones de proteína terapéutica deben ser solubles en agua y seguir activos durante toda la estabilidad en almacén del producto. Los agentes reductores y secuestrantes de oxígeno/radicales libres funcionan destruyendo las especies de oxígeno activo en disolución. Los agentes quelantes (por ejemplo, EDTA) pueden ser eficaces uniendo contaminantes de oligoelementos que promueven la formación de radicales libres. En la formulación líquida de factor de crecimiento de fibroblastos ácido, por ejemplo, el EDTA inhibe la oxidación catalizada por iones metálicos de restos de cisteína. El EDTA se ha usado en productos comercializados, como Kineret® y Ontak®.

Iones metálicos

En general, los iones de metales de transición no se desean en las formulaciones de proteína debido a que pueden catalizar reacciones de degradación física y química en las proteínas. En las formulaciones se incluyen iones metálicos específicos, sin embargo, cuando actúan como cofactores para las proteínas. Los iones metálicos también se pueden usar en formulaciones en suspensión de proteínas donde forman complejos de coordinación (por ejemplo, suspensión de insulina con cinc). Se ha propuesto el uso de iones magnesio (10-120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico en ácido isoaspártico (documento de patente WO 2004/039337).

Se encontró que los iones metálicos conferían estabilidad y/o elevada actividad en una formulación de desoxirribonucleasa humana (rhDNAsa, Pulmozyme®). Los iones Ca2+ (hasta 100 mM) aumentaron la estabilidad de la enzima a través de un sitio de unión específico (Chen et al. (1999), J Pharm Sci. 88(4): 477-82). En realidad, la retirada de iones de calcio de la disolución con EGTA causó un aumento en la desamidación y la agregación. Sin embargo, este efecto se observó solo con iones Ca2+; se observó que otros cationes divalentes - Mg2+, Mn2+ y Zn2+ -desestabilizaban la rhDNAsa.

Se observaron efectos similares en la formulación del factor VIII. Los iones Ca2+ y Sr2+ estabilizaron la proteína mientras que otros, como Mg2+, Mn2+ y Zn2+, Cu2+ y Fe2+, la desestabilizaron (Fatouros, et al. (1997), Int. J. Pharm., 155, 121-131). En un estudio separado con factor VIII, se observó un aumento significativo en la tasa de agregación en presencia de iones Al3+ (Derrick et al. (2004), J. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57). Los autores observaron que otros excipientes, como las sales de tampón, están contaminadas frecuentemente con iones Al3+ e ilustran la necesidad de usar excipientes de calidad apropiada en productos formulados. Las vacunas que contienen picornavirus atenuados vivos o muertos, tales como la hepatitis A y la poliomielitis, se estabilizan conformacionalmente por magnesio. Los iones metálicos, tales como el calcio, el magnesio y el cinc, mejoran la estabilidad de la oxitocina en una disolución acuosa. La insulina se puede unir al cinc, que conduce a la formación de dímeros y hexámeros en una forma cristalina, que permite la preparación de diferentes formulaciones con diferentes perfiles de liberación in vivo. La estabilidad química y térmica de la formulación de insulina hexamérica varía en presencia de diferentes niveles de cinc y fenol.

Ligandos específicos

Un enfoque para mejorar la estabilidad conformacional de los fármacos terapéuticos de proteína es aprovechar los sitios de unión a ligando inherentes de la proteína. Por ejemplo, Pulmozyme® no solo requiere iones metálicos bivalentes para su actividad enzimática, tiene estabilidad conformacional mejorada en presencia de iones de calcio. Se han evaluado clínicamente tanto el factor de crecimiento de fibroblastos ácido como básico (aFGF y bFGF) para su capacidad para promover la cicatrización, y ambas proteínas se unen naturalmente a los proteoglicanos altamente negativamente cargados sobre superficies celulares. Una variedad de otros compuestos altamente negativamente cargados también se unen y estabilizan espectacularmente el aFGF por interacción con el sitio de unión al polianión de la proteína.

Tensioactivos

Las moléculas de proteína tienen una alta tendencia a interactuar con superficies, haciendo que sean susceptibles a la adsorción y la desnaturalización en interfases aire-líquido, vial-líquido y líquido-líquido (aceite de silicona). Esta vía de degradación es inversamente dependiente de la concentración de proteína y da como resultado agregados de proteína solubles o insolubles, o la pérdida de proteína de la disolución mediante adsorción a superficies. Además de la adsorción superficial al envase, la degradación inducida por la superficie se agrava con agitación física, como sería experimentado durante el transporte y la manipulación.

Los tensioactivos se usan comúnmente en formulaciones de proteína para prevenir la degradación inducida en la superficie. Los tensioactivos son moléculas anfipáticas con la capacidad de competir con las proteínas por las posiciones interfaciales. Las porciones hidrófobas de las moléculas de tensioactivo ocupan posiciones interfaciales (por ejemplo, aire/líquido), mientras que las porciones hidrófilas de las moléculas siguen estando orientadas hacia el disolvente en masa. A concentraciones suficientes (normalmente alrededor de la concentración micelar crítica del detergente), una capa superficial de moléculas de tensioactivo sirve para prevenir que las moléculas de proteínas se adsorban en la interfase. Por lo tanto, se minimiza la degradación inducida en la superficie.

Los tensioactivos más comúnmente usados son los ésteres de ácidos grasos no iónicos de polietoxilatos de sorbitano, es decir, polisorbato 20 y polisorbato 80 (por ejemplo, en los medicamentos Avonex®, Neupogen®, Neulasta®). Los dos solo se diferencian en la longitud de la cadena alifática que confiere carácter hidrófobo a las moléculas, C-12 y C-18, respectivamente. El polisorbato 80 es más activo en la superficie y tiene una menor concentración micelar crítica que el polisorbato 20. Se ha mostrado que tanto el polisorbato 20 como el polisorbato 80 protegen contra la agregación inducida por la agitación. El polisorbato 20 y 80 también protegen contra el estrés inducido por la congelación, la liofilización y la reconstitución. Tanto el polisorbato 20 como 80 pueden contener peróxidos que pueden oxidar proteínas y ellos mismos se pueden degradar por u oxidación o hidrólisis con efectos variables sobre la estabilidad de las proteínas. También puede ser difícil controlar el nivel de polisorbato 20 u 80 en las formulaciones debido a su comportamiento complejo durante la filtración en membrana (especialmente a concentraciones en las que los polisorbatos forman micelas en disolución). El tensioactivo poloxámero 188 también se ha usado en varios productos líquidos comercializados, tales como Gonal-F®, Norditropin® y Ovidrel®. En general, se cree que los tensioactivos no iónicos estabilizan las proteínas principalmente compitiendo con las moléculas de proteína por las superficies hidrófobas (por ejemplo, interfases aire-agua), previniendo así que las proteínas se desplieguen en estas interfases hidrófobas. Los tensioactivos no iónicos también pueden bloquear que las moléculas de proteínas se adsorban a otras superficies hidrófobas presentes durante el procesamiento. Además, los tensioactivos no iónicos pueden interactuar directamente con regiones hidrófobas en moléculas de proteína. Los anticuerpos monoclonales pueden afectar la concentración micelar crítica del polisorbato 20 en comparación con el tampón solo.

Los detergentes también pueden afectar la estabilidad conformacional termodinámica de las proteínas. Nuevamente aquí, los efectos de un excipiente dado serán específicos de la proteína. Por ejemplo, se ha mostrado que los polisorbatos reducen la estabilidad de algunas proteínas y aumentan la estabilidad de otras. La desestabilizacón por detergente de las proteínas puede ser racionalizada en términos de las colas hidrófobas de las moléculas de detergente que pueden cooperar en la unión específica con estados de proteína parcialmente o completamente desplegada. Estos tipos de interacciones podrían provocar un desplazamiento en el equilibrio conformacional hacia estados de proteína más expandidos (es decir, aumentando la exposición de porciones hidrófobas de la molécula de proteína además de unir el polisorbato). Alternativamente, si el estado nativo de la proteína presenta algunas superficies hidrófobas, la unión del detergente al estado nativo puede estabilizar esa conformación.

Otro aspecto de los polisorbatos es que son inherentemente susceptibles a la degradación oxidativa. Frecuentemente, como materiales de partida, contienen cantidades suficientes de peróxidos para causar la oxidación de cadenas laterales de restos de proteína, especialmente metionina. Las posibilidades de daño oxidativo que surgen de la adición de estabilizador enfatiza el hecho de que en las formulaciones se deben usar las concentraciones eficaces más bajas de excipientes. Para tensioactivos, la concentración eficaz para una proteína dada dependerá del mecanismo de estabilización. Se ha postulado que si el mecanismo de estabilización de tensioactivos está relacionado con la prevención de la desnaturalización superficial, entonces la concentración eficaz será aproximadamente la concentración micelar crítica del detergente. En cambio, si el mecanismo de estabilización está asociado con interacciones específicas proteína-detergente, la concentración eficaz de tensioactivo se relacionará con la concentración de proteína y la estequiometría de la interacción (Randolph et al. (2002), Pharm Biotechnol., 13:159-75).

Los tensioactivos también se pueden añadir en cantidades apropiadas para prevenir la agregación relacionada con la superficie durante la congelación y el secado (Chang (1996), J. Pharm. Sci. 85:1325). Los tensioactivos a modo de ejemplo incluyen tensioactivos aniónicos, catiónicos, no iónicos, de ion bipolar y anfóteros, que incluyen tensioactivos derivados de aminoácidos que existen de forma natural. Los tensioactivos aniónicos incluyen, pero no se limitan a, laurilsulfato de sodio, dioctil sulfosuccinato de sodio y dioctil sulfonato de sodio, ácido quenodesoxicólico, sal de sodio de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de litio, sal de sodio de ácido 1-octanosulfónico, hidrato de colato de sodio, desoxicolato de sodio y sal de sodio de ácido glicodesoxicólico. Los tensioactivos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, cloruro de cetilpiridinio monohidrato y bromuro de hexadeciltrimetilamonio. Los tensioactivos de ion bipolar incluyen, pero no se limitan a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 y SB3-12. Los tensioactivos no iónicos incluyen, pero no se limitan a, digitonina, T riton X-100, T riton X-114, TWEEN-20 y TWEEN-80. En otra realización, los tensioactivos incluyen lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, lecitina de soja y otros fosfolípidos, tales como DOPC, DMPG, DMPC y DOPG; éster de ácido graso de sacarosa, metil celulosa y carboximetil celulosa.

Sales

Las sales se añaden frecuentemente para aumentar la fuerza iónica de la formulación, que puede ser importante para la solubilidad de proteínas, estabilidad física e isotonicidad. Las sales pueden afectar la estabilidad física de las proteínas en una variedad de formas. Los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas uniéndose a restos cargados sobre la superficie de la proteína. Alternativamente, pueden estabilizar el estado desnaturalizado uniéndose a grupos de péptidos a lo largo del esqueleto de la proteína (-CONH-). Las sales también pueden estabilizar la conformación nativa de la proteína protegiendo las interacciones electrostáticas repulsivas entre restos dentro de una molécula de proteína. Los electrolitos en las formulaciones de proteína también pueden proteger las interacciones electrostáticas atractivas entre moléculas de proteínas que pueden conducir a la agregación e insolubilidad de proteínas.

El efecto de la sal sobre la estabilidad y la solubilidad de proteínas varía significativamente con las características de las especies iónicas. La serie de Hofmeister se originó en los años 1880 como una forma de clasificar el orden de los electrolitos basándose en su capacidad para precipitar proteínas (Cacace et al. (1997), Quarterly Reviews of Biophysics, 30(3): 241-277). En esta memoria, se usa la serie de Hofmeister para ilustrar una escala de estabilización de efectos de las proteínas por cosolutos iónicos y no iónicos. En la Tabla C, los cosolutos se ordenan con respecto a sus efectos generales sobre las proteínas en estado de disolución, de estabilizantes (cosmotrópicos) a desestabilizantes (caotrópicos). En general, las diferencias en los efectos a través de los aniones son muy superiores a las observadas para los cationes, y, para ambos tipos, los efectos son más evidentes a mayores concentraciones que son aceptables en las formulaciones parenterales. Las altas concentraciones de cosmótropos (por ejemplo, sulfato de amonio >1 molar) se usan comúnmente para precipitar proteínas en la disolución por un proceso denominado 'precipitación por adición de sal', donde el cosmótropo se excluye preferentemente de la superficie de la proteína reduciendo la solubilidad de la proteína en su conformación nativa (plegada). La retirada o dilución de la sal devolverá la proteína a la disolución. El término 'disolución por adición de sal' se refiere al uso de iones desestabilizantes (por ejemplo, como guanidina y cloruro) que aumentan la solubilidad de proteínas por solvatación de los enlaces peptídicos del esqueleto de proteína. Las concentraciones crecientes del caótropo favorecerán la conformación en el estado desnaturalizado (desplegado) de la proteína a medida que aumenta la solubilidad de la cadena peptídica. La eficacia relativa de iones a la 'disolución por adición de sal' y 'precipitación por adición de sal' define su posición en la serie de Hofmeister.

Tabla 4: La serie de Hofmeister de sales

Para mantener la isotonicidad en una formulación parenteral, las concentraciones de sales están limitadas, en general, a menos de 150 mM para combinaciones de iones monovalentes. En este intervalo de concentración, el mecanismo de estabilización de sales es probablemente debido al apantallamiento de fuerzas intramoleculares repulsivas electrostáticas o fuerzas intermoleculares atractivas (apantallamiento de Debye-Hückel). Es interesante señalar que se ha mostrado que las sales caotrópicas son más eficaces en la estabilización de la estructura de las proteínas que concentraciones similares de cosmótropos por este mecanismo. Se cree que los aniones caotrópicos se unen más fuertemente que los iones cosmotrópicos. Con respecto a la degradación de proteínas covalentes, se esperan efectos diferenciales de la fuerza iónica sobre este mecanismo mediante la teoría de Debye-Hückel. Por consiguiente, los informes publicados de estabilización de proteínas por cloruro sódico van acompañados de aquellos donde el cloruro sódico aceleró la degradación covalente. Los mecanismos por los que las sales afectan la estabilidad de las proteínas son específicos de la proteína y pueden variar significativamente en función del pH de la disolución. Un ejemplo donde un excipiente puede ser útil en permitir la administración de un fármaco de proteína es el de algunas formulaciones de anticuerpo de alta concentración. Durante los últimos años, se ha mostrado que las sales son eficaces en reducir la viscosidad de dichas formulaciones (Liu et al. (2005, 2006), J. Pharm Sci., 94(9): 1928-40, errata en J Pharm Sci., 95(1): 234-5.

Conservantes

Los conservantes son necesarios cuando se desarrollan formulaciones multiuso parenterales que implican más de una extracción del mismo envase. Su función primaria es inhibir el crecimiento microbiano y garantizar la esterilidad del producto durante toda la estabilidad en almacén o las condiciones de uso del medicamento. Los conservantes comúnmente usados incluyen alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservantes tienen una larga historia de uso, el desarrollo de formulaciones de proteína que incluyen conservantes puede ser exigente. Los conservantes casi siempre tienen un efecto desestabilizante (agregación) sobre las proteínas, y esto ha llegado a ser un factor importante en limitar su uso en formulaciones multidosis de proteína (Roy et al. (2005), J. Pharm. Sci., 94(2): 382-96). También se ha mostrado que el alcohol bencílico afecta la estructura y la estabilidad de las proteínas en un modo dependiente de la concentración, la temperatura y el tiempo. Debido a estos efectos desestabilizantes, muchas formulaciones de proteína liofilizada se reconstituyen con diluyente que contiene alcohol bencílico para minimizar el tiempo de contacto con la proteína antes de la administración.

La mayoría de los fármacos de proteína se han formulado únicamente para un solo uso. Sin embargo, cuando son posibles formulaciones multidosis, tienen la ventaja añadida de permitir la comodidad del paciente, y elevada comerciabilidad. Un buen ejemplo es el de la hormona de crecimiento humana (hGH), donde el desarrollo de formulaciones conservadas ha conducido a una comercialización de presentaciones en pluma para inyección multiuso más convenientes. Actualmente están disponibles al menos cuatro de dichos dispositivos de pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH. Norditropin® (líquido), Nutropin AQ® (líquido) y Genotropin (cartucho liofilizado de cámara doble) contienen fenol mientras que Somatrope® se formula con m-cresol.

Se necesita considerar varios aspectos durante el desarrollo de formulaciones de formas farmacéuticas conservadas. La concentración de conservante eficaz en el medicamento se debe optimizar. Esto requiere probar un conservante dado en la forma farmacéutica con intervalos de concentración que confieren eficacia antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína. Por ejemplo, se cribaron con éxito tres conservantes en el desarrollo de una formulación líquida para el receptor de interleucina-1 (tipo I) usando calorimetría diferencial de barrido (DSC). Los conservantes se ordenaron basándose en sus impactos sobre la estabilidad a concentraciones comúnmente usadas en los productos comercializados (Remmele et al. (1998), Pharm. Res., 15(2): 200-8).

Como cabría esperar, el desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservantes es más exigente que el de formulaciones liofilizadas. Los productos secados por congelación se pueden liofilizar sin el conservante y reconstituir con un conservante que contiene diluyente en el momento de uso. Esto acorta el tiempo durante el que un conservante está en contacto con la proteína, por lo que se minimizan significativamente los riesgos de estabilidad asociados. Con formulaciones líquidas, la eficacia y la estabilidad del conservante se tienen que mantener durante toda la estabilidad en almacén del producto (normalmente aproximadamente 18 - 24 meses). Un punto importante a tener en cuenta es que la eficacia del conservante se tiene que demostrar en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes de excipiente.

Algunos conservantes pueden causar reacciones del lugar de inyección, que es otro factor que necesita consideración cuando se elige un conservante. En ensayos clínicos que se centraron en la evaluación de conservantes y tampones en Norditropin®, se observó que la percepción de dolor era más baja en formulaciones que contenían fenol y alcohol bencílico en comparación con una formulación que contenía m-cresol (Kappelgaard (2004), Horm. Res. 62 Suppl 3:98-103). Es interesante señalar que, entre los conservantes comúnmente usados, el alcohol bencílico posee propiedades anestésicas (Minogue y Sun (2005), Anesth. Analg. 100(3): 683-6).

EJEMPLOS DE TRABAJO

EJEMPLO 1

Este experimento demuestra que ajustando los objetivos de peso de llenado, la concentración de proteína puede ser seleccionada con precisión para el medicamento reconstituido respectivo.

Materiales

• Tampón que contiene: Manitol, sacarosa, L-histidina, polisorbato 20 a pH 5

• Envase Vial, 3 cm3, con retorno de aire, vidrio de tipo I, no tratado, acabado de 13 mm con tapón, 13 mm, 4432/50 V-50,

• romiplostim Filtrado, purificado, en masa

Método

1. Diluir el fármaco hasta la formulación de producto objetivo (0,5 mg/ml) utilizando la cantidad requerida de tampón de dilución.

2. Filtrar la disolución formulada usando un filtro de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) de 0,22 pm.

3. Asegurar que los viales y el tapón: los viales de 3 cm3 se han lavado y despirogenado.

4. Llenar los viales con una cantidad suficiente hasta los objetivos de peso de llenado respectivos: 0,307, 0,322, 0,342, 0,357, 0,373 g.

5. Viales parcialmente con el tapón y poner en el liofilizador.

6. Realizar el ciclo de liofilización requerido con congelación suficiente, vacío, con secado primario y secundario, seguido por taponamiento y descarga del producto liofilizado en viales sellados.

7. Reconstituir el producto con volumen de reconstitución establecido de 0,32 ml de agua para inyectables.

8. Medir la concentración de proteína resultante en viales utilizando absorción ultravioleta (UV). La absorbancia se define como la cantidad de luz de una longitud de onda específica que se absorbe a medida que pasa a través de un analito. La unidad de absorbancia es una función de la absorbancia intrínseca de la molécula, su concentración y la longitud de trayecto del analito. Los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano en moléculas de proteínas absorben luz en el intervalo UV de 260-290 nm. La absorción UV en este intervalo se usa habitualmente para medir la presencia de proteína en una disolución.

9. Medir la osmolalidad del producto utilizando la depresión del punto de congelación.

10. Realizar el análisis para determinar el efecto de los objetivos de peso de llenado ajustados para tanto la proteína como la osmolalidad.

Tabla 5: Resumen de pesos de llenado y concentración de proteína

Se observó una fuerte relación lineal entre la concentración de proteína reconstituida y el volumen de llenado como se demuestra por la R2 de 0,9964 como se muestra en la Figura 6. Esta relación lineal se puede explicar teóricamente basándose en el balance de masas de proteína, como se muestra a continuación:

^reconstitución * ^reconstitución = (S Formulada Lpérdida )* V 1llenado ^{[Ecuación 1]}

donde Creconstitución es la concentración de proteína post-reconstitución, Vreconstitución es el volumen de producto post reconstitución, Cformulada es la concentración en masa de proteína formulada, Cpérdida es la pérdida de proteína debido a la unión al filtro y envases, y Vanado es el volumen de llenado en cada vial. Puesto que la concentración en masa formulada, la pérdida por unión de proteína y el volumen de reconstitución son constantes en una serie dada, la concentración de proteína post-reconstitución es proporcional al volumen de llenado como se indica en la Ecuación 2.

En el experimento a escala piloto, la variabilidad de la concentración de proteína del medicamento (DP) reconstituido final se determinó usando 10 repeticiones en cada condición de llenado, como se muestra en la Tabla 6. Por lo tanto, la variabilidad observada representa tanto la variabilidad del proceso como analítica, que incluye la variabilidad asociada a la reconstitución del producto.

Tabla 6: Variabilidad de la concentración de proteína (reconstituida) en cada condición de llenado

Impacto del peso de llenado sobre la osmolalidad (DP reconstituido)

Se probó la osmolalidad del medicamento final después de la reconstitución para su osmolalidad, para viales llenados a cinco objetivos de peso de llenado. Los resultados de osmolalidad antes del llenado y post-reconstitución se resumen en la Tabla 7. La osmolalidad no cambia después del llenado y la reconstitución, basada en los resultados en el peso de llenado objetivo de 0,341 gramos, que indica que los excipientes no se perdieron en cantidades apreciables. La osmolalidad aumenta ligeramente a volúmenes de llenado más altos y disminuye ligeramente a volúmenes de llenado más bajos cuando el volumen de reconstitución se mantiene constante.

Tabla 7: Resumen de pesos de llenado y osmolalidad

Se encontró una relación lineal si el peso de llenado/volumen (normalizado basado en el objetivo de 0,341 g) se representa frente a la osmolalidad del producto (normalizada basada en la osmolalidad objetivo de 313 mOsm/kg al peso de llenado objetivo), como se muestra en la Figura 7. Esta relación lineal se puede explicar por la definición de osmolalidad y su relación con la concentración de componente tampón.

La osmolalidad es una medida de la concentración de soluto, definida como el número de osmoles (Osm) de soluto por kilogramo de disolvente (osmol/kg u osm/kg). Distinto de la molaridad (mol/l), la osmolalidad mide los moles de partículas de soluto (tal como ion disociado) en vez de moles de soluto. La osmolalidad de una disolución se puede calcular a partir de la siguiente expresión:

Osmolalidad (osm /kg) = densidad * ₃ _4i _níQ[Ecuación 3]

donde j es el coeficiente osmótico, n es el número de partículas (por ejemplo, iones) en los que se disocia una molécula y C es la concentración molar (mol/l) del soluto.

En el caso cuando el peso de llenado (o volumen) es el 10 % superior al volumen objetivo, la concentración de cada especie de excipiente en la formulación aumenta en 10 % tras la reconstitución a volumen constante. Puesto que j i y ni son constantes en una formulación conocida, el aumento del 10 % en la concentración de cada especie resulta en un aumento del 10 % en la osmolalidad como se muestra en la Ecuación 3. Similarmente, la disminución del 10 % del volumen de llenado resulta en una disminución del 10 % en la concentración de excipiente y, por consiguiente, una disminución del 10 % en la osmolalidad.

EJEMPLO 2

La proteína blinatumomab tiene 55 pg/ml formulada en L-lisina-HCl 200 mM, ácido cítrico 25 mM, 15 % (p/vol) de trehalosa dihidrato, 0,1 % (p/vol) de polisorbato 80, pH 7,0. El intervalo permisible de proteína formulada se mide en la fase en masa filtrada. Se usan concentraciones en masa que varían desde 48,0 pg/ml hasta 65,0 pg/ml. Los pesos de llenado objetivo se calculan basándose en la concentración de proteína medida para seleccionar un medicamento reconstituido de 12,5 mcg/ml cuando se reconstituye con 3 ml de agua.

^reconstitución * ^reconstitución (CFormulada Cpérdida ) * ^llenado

donde

Creconstitución * ^reconstitución Contenido de pvotem a objetivoreconstitución

Entonces el Contenido de proteína objetivo se puede multiplicar entonces por la densidad del producto y dividir entre la concentración de fármaco medida (ajustada para la perdida debido a la unión, si es necesario) para determinar el Peso de llenado objetivo.

El Peso de llenado objetivo se calcula según la siguiente fórmula, con un intervalo de peso de llenado correspondiente de 0,634 a 0,858 g.

dosis objetivo >38,5 B ^ g l) x densidad >1,07 &^j) Peso de llenado (g) =

Concentración de DS >x B&/)

en donde DS es generalmente entendido por los expertos habituales en la técnica para referirse a principio activo. En términos más generales

(dosis fi ja objetivo de la proteína terapéutica) x (densidad) Peso de llenado ajustado = ---------------------------------------------------------------------------------------------------- concentración de proteína terapéutica en la formulación en masa EJEMPLO 3

El medicamento infliximab tiene 20 ± 1,5 mg/ml de infliximab, formulado con fosfato de sodio 10 mM, 10 % (p/vol) de sacarosa, 0,01 % (p/vol) de polisorbato 80, pH 7,2 después de la reconstitución con 10 ml de agua para inyectables. El peso de llenado objetivo se calcula según la siguiente fórmula, con un intervalo de peso de llenado correspondiente de 4,85 a 5,63 g.

Cálculo del peso de llenado objetivo

(Contenido de proteína objetivo (100 mgj) x >Densidad >1,042 m d) Peso de llenado objetivo (g) =

Concentración de proteína liberada del medicamento >&&/) EJEMPLO 4

Trastuzumab tiene 21 mg/ml formulado con 0,303 mg/ml de L-histidina, 0,470 de mg/ml de clorhidrato de L-histidina monohidrato, 19,1 mg/ml de a,a-trehalosa dihidrato, 0,0840 mg/ml de polisorbato 20, a pH 6,1. El peso de llenado objetivo se calcula según la fórmula que sigue, con intervalos de peso de llenado variables basados en los requisitos de administración del producto. Los objetivos de peso de llenado varían desde 3,1 hasta 21,2 g (que dependen de la presentación respectiva). Este producto tiene múltiples presentaciones con una concentración de principio activo conjunta de 21 mg/ml.

El peso de llenado objetivo para cada lote de medicamento para este Ejemplo 4 y los ejemplos posteriores se calcula usando la siguiente información:

(Contenido de proteína objetivo [mg]) x (Densidad [g/ml]) Peso de llenado objetivo [g] = -------------------------- ;— ------------------------------------------- --------— -------- Concentración de medicamento conjunta [mg/ml]

Como un ejemplo, el peso de llenado objetivo para una presentación de 150 mg [g]

(156 mg) x (1,01 g /m l)

Concentración de medicamento conjunta [21 mg/ml] Como otro ejemplo, el peso de llenado objetivo para una presentación de 420 mg [g]

(440 mg) x (1,01 g /m l)

Concentración de medicamento conjunta [21 mg/ml] Como un ejemplo adicional, el peso de llenado objetivo para una presentación de 60 mg [g]

(65 mg) x (1,01 g /m l)

Concentración de medicamento conjunta [21 mg/ml] EJEMPLO 5

AMG 701 es una construcción de anticuerpo anti-BCMA/anti-CD3 monocatenario de dominio variable Bi-specific T-cell Engager (BiTE®) (véase NCI Drug Dictionary y otras referencias). AMG 701 con concentración de proteína de 1 mg/ml se formuló con ácido L-glutámico 10 mM, 9,0 % (p/vol) de sacarosa, 0,010 % (p/vol) de polisorbato 80, a pH 4,2. El peso de llenado objetivo se calcula según la fórmula que sigue, con intervalos de peso de llenado variables basados en los requisitos de administración de producto. AMG 701 tiene tres presentaciones, con los objetivos de peso de llenado variando para la primera presentación desde 0,47 hasta 0,57 g, la segunda presentación desde 1,60 hasta 1,96 g y la tercera presentación desde 3,28 hasta 4,01 g.

Para la primera presentación:

Para la segunda presentación:

Para la tercera presentación:

Peso de llenado objetivo (g)

Cooncentración liberada de proteína del medicamento >1,0 m//)

EJEMPLO 6

AMG 330 es un anti-CD33/anti-CD3 monocatenario de dominio variable Bi-specific T-cell Engager (BiTE®) (véase NCI Drug Dictionary y otras referencias). AMG 300 con concentración de proteína de 0,5 mg/ml se formuló con fosfato de potasio 10 mM, 8,0 % (p/vol) de sacarosa, 1,0 % (p/vol) de sulfobutil éter betaciclodextrina (SBE-CD), 0,010 % (p/vol) de polisorbato 80 a pH 6,1. El peso de llenado objetivo se calcula según la fórmula que sigue, con intervalos de peso de llenado variable basados en los requisitos de administración de producto. Los objetivos de peso de llenado varían desde 1,2 hasta 1,5 g. El peso de llenado objetivo se calcula del siguiente modo:

(Contenido de proteína objetivo (0,64 mg)) x ^Densidad >1,033 m ) ) Peso de llenado objetivo (g) =

Concentración de proteína del medicamento >0,5 m¡g¡[)

En general, la metodología se puede usar en el caso en el de que una cantidad de producto objetivo se requiera en el envase para garantizar que el producto post-reconstitución esté en la concentración requerida. Este resultado se logra determinando la cantidad de volumen del producto reconstituido; por ejemplo, 1 ml de volumen con una concentración deseada de 1 mg/ml de proteína terapéutica, que conduce a una cantidad total de contenido de proteína requerido de 1 mg. Contenido de proteína objetivo [mg] = (Concentración de proteína [mg/ml] x Volumen reconstituido [ml])

El contenido de proteína objetivo se usa entonces para calcular el peso de llenado objetivo basado en la fórmula que sigue. La concentración de fármaco durante el proceso o medida se mide normalmente como parte del proceso de formulación para compensar cualquier variabilidad del proceso. En algunos casos, se hace un ajuste al contenido de proteína objetivo para compensar la pérdida de producto debida a la unión. Se requiere la confianza en la concentración de fármaco medida para garantizar la selección precisa de los pesos de llenado.

(Contenido de proteína objetivo [mg]) x (Densidad [g/ml]) Peso de llenado objetivo (g) = ------------------------------- ;— -— —----------------- — — -------— -------------- Concentración de fármaco medida [mg/ml]

Este es un ejemplo específico ya que el producto terapéutico tanto para la concentración durante el proceso como el producto reconstituido puede variar de microgramos (mcg o gg) por mililitro (ml) a miligramos (mg) por mililitro (ml).

Se requiere la verificación de la osmolalidad, como se trata anteriormente (basada en resultados experimentales). Las limitaciones a la concentración de fármaco medida permitida se establecen en combinación con los objetivos de peso de llenado para lograr la cantidad requerida de fármaco activo envasado en el envase para proporcionar garantía de que el producto reconstituido cumpla tanto la concentración de producto (fármaco activo o proteína), así como los límites de especificación de osmolalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de preparación de una formulación farmacéutica liofilizada de una proteína terapéutica, que es adecuada para administración parenteral, que comprende:

a. proporcionar una formulación de una cantidad en masa de la proteína terapéutica,

b. medir la concentración de la proteína terapéutica en dicha formulación en masa,

c. ajustar el peso de llenado de la proteína en dicha formulación en masa para lograr una dosis fija de la proteína, y

d. liofilizar la formulación ajustada en el peso de llenado de proteína para lograr una formulación final en un envase,

en donde la concentración de producto post-reconstitución con un volumen fijo está dentro de un intervalo de aceptación predeterminado y en donde el peso de llenado ajustado de la proteína se calcula según la fórmula (dosis fi ja objetivo de la proteína terapéutica) x (densidad) Peso de llenado ajustado = - _c - _o -- _n -- _c -- _e - _n -- _t -- _r - _a -- _ci —

_ó —

_{n d} ;- _e --- _p -- _r - _o -- _t - _e -;

_í -

_n -- _a --- _t - _e -- _r -- _a - _p -- _é ;—

_uti :- _c -- _a --- _e - _n - ;—

_la - _f - _o -- _r -- _m -- _u - ;

_l —

_ac —

_ió -- _n --- _e -- _n -- _m --- _a -- _s - _a -2. El proceso de la reivindicación 1, en donde la concentración de proteína en la formulación final es inferior o igual a aproximadamente 20 mg/ml.

3. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica se selecciona de romiplostim, blinatumomab, infliximab, trastuzumab, AMG 701 y AMG 330.

4. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica es romiplostim y la concentración de proteína terapéutica en la formulación final es aproximadamente 0,5 mg/ml.

5. El proceso de la reivindicación 1, en donde la formulación final comprende aproximadamente 0,5 mg/ml de romiplostim en histidina aproximadamente 10 mM, aproximadamente 4 % p/vol de manitol, aproximadamente 2 % p/vol de sacarosa y aproximadamente 0,004 % de polisorbato 20 a aproximadamente pH 5,0.

6. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica es blinatumomab y la concentración de proteína terapéutica en la formulación final es aproximadamente 55 pg/ml.

7. El proceso de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende aproximadamente 55 pg/ml de blinatumomab en ácido cítrico monohidrato aproximadamente 25 mM, aproximadamente 15 % (p/vol) de trehalosa, clorhidrato de L-lisina aproximadamente 200 mM y aproximadamente 0,1 % (p/vol) de polisorbato 80 a aproximadamente pH 7,0. 8. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica es infliximab y la concentración de proteína terapéutica en la formulación final es aproximadamente 20 ± 1,5 mg/ml.

9. El proceso de la reivindicación 1, en donde la formulación final comprende aproximadamente 20 ± 1,5 mg/ml de infliximab, fosfato de sodio aproximadamente 10 mM, aproximadamente 10 % (p/vol) de sacarosa y aproximadamente 0,01 % (p/vol) de polisorbato 80 a aproximadamente pH 7,2.

10. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica es trastuzumab y la concentración de proteína terapéutica en la formulación final es aproximadamente 21 mg/ml.

11. El proceso de la reivindicación 1, en donde la formulación final comprende aproximadamente 21 mg/ml de trastuzumab, aproximadamente 0,303 mg/ml de L-histidina, aproximadamente 0,470 mg/ml de clorhidrato de L-histidina monohidrato, aproximadamente 19,1 mg/ml de á,á-trehalosa dihidrato y aproximadamente 0,0840 mg/ml de polisorbato 20 a aproximadamente pH 6,1.

12. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica es AMG 701 y la concentración de proteína terapéutica en la formulación final es aproximadamente 1 mg/ml.

13. El proceso de la reivindicación 1, en donde la formulación final comprende aproximadamente 1 mg/ml de AMG 701, ácido L-glutámico aproximadamente 10 mM, aproximadamente 9,0 % (p/vol) de sacarosa y aproximadamente 0,010 % (p/vol) de polisorbato 80 a aproximadamente pH 4,2.

14. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica es AMG 330 y la concentración de proteína terapéutica en la formulación final es aproximadamente 0,5 mg/ml.

15. El proceso de la reivindicación 1, en donde la formulación final comprende aproximadamente 0,5 mg/ml de AMG 330, fosfato de potasio aproximadamente 10 mM, aproximadamente 8,0 % (p/vol) de sacarosa, aproximadamente 1,0 % (p/vol) de sulfobutil éter betaciclodextrina (SBE-CD) y aproximadamente 0,010 % (p/vol) de polisorbato 80 a aproximadamente pH 6,1.

16. El proceso de la reivindicación 1, en donde la concentración de proteína en la formulación final es inferior o igual a aproximadamente 25 mg/ml.

17. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica es una construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico.

18. El proceso de la reivindicación 1, en donde la proteína terapéutica se selecciona de AMG 701 y AMG 330.