BR112020004902A2

BR112020004902A2 - processo para formulação farmacêutica liofilizada de uma proteína terapêutica

Info

Publication number: BR112020004902A2
Application number: BR112020004902-6A
Authority: BR
Inventors: Clea TALLEY
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2018-09-10
Publication date: 2020-09-15
Also published as: AU2018334502A1; IL297824A; KR20200054251A; CN111148510A; ES2925232T3; MA50239A; HUE059339T2; WO2019055357A1; LT3681483T; EP3681483B1; JP2020534255A; CA3072600A1; EA202090731A1; JP2023126930A; PL3681483T3; IL272513B2; IL272513A; DK3681483T3; SG11202001449VA; US20210369616A1

Abstract

Esta invenção diz respeito a um processo para preparação de uma formulação farmacêutica liofilizada de uma proteína terapêutica, que compreende (a) proporcionar uma formulação de uma quantidade a granel da proteína terapêutica, (b) medição da concentração da proteína terapêutica na referida formulação a granel, (c) ajuste do peso de enchimento da proteína na referida formulação a granel para se alcançar uma dose fixa da proteína e (d) liofilização da formulação ajustada quanto ao peso de enchimento de proteína para se alcançar uma formulação final em um recipiente, em que a concentração de produto pós-reconstituição com um volume fixo está dentro de uma gama de aceitação predeterminada. O processo é particularmente adequado para formulações com baixas concentrações de proteína (por exemplo, 0,05 mg/mL a 20 mg/mL).

Description

PROCESSO PARA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA LIOFILIZADA DE UMA PROTEÍNA TERAPÊUTICA CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Esta invenção se relaciona com biofarmacêuticos, particularmente com proteínas terapêuticas, métodos de seu uso, suas formulações farmacêuticas e processos de preparação de formulações farmacêuticas. Em particular, esta invenção se relaciona com processos para preparação de formulações farmacêuticas liofilizadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Nos últimos dez anos, avanços na tecnologia têm tornado possível produzir uma variedade de moléculas ativas para aplicações farmacêuticas. À medida que a natureza de entendimento de mecanismos de ação biológica progride, estas moléculas podem ser desenhadas para certos atributos, onde pequenas quantidades de produto podem ser eficazes.

[0003] Como estas moléculas podem ser maiores e/ou mais complexas do que fármacos orgânicos e inorgânicos tradicionais (i.e., possuindo múltiplos grupos funcionais adicionalmente a estruturas tridimensionais complexas), a formulação de tais produz coloca problemas especiais. Para um produto permanecer biologicamente ativo, uma formulação tem de preservar intacta a integridade conformacional de pelo menos uma sequência nuclear dos aminoácidos da proteína enquanto ao mesmo tempo protege os múltiplos grupos funcionais da proteína da degradação. As vias de degradação para proteínas podem envolver instabilidade química (i.e., qualquer processo que envolva modificação da proteína por formação de ligações ou clivagem resultando em uma nova entidade química) ou instabilidade física (i.e., mudanças na estrutura de ordem superior da proteína). A instabilidade química pode resultar de desamidação, racemização, hidrolise, oxidação, eliminação beta ou permuta de dissulfetos. A instabilidade física pode resultar de desnaturação, agregação, precipitação ou adsorção, por exemplo. As três vias de degradação de proteínas mais comuns são agregação, desamidação e oxidação de proteínas. Cleland et al. (1993), Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (4): 307-377.

[0004] Estas moléculas desenhadas devido à sua natureza sintética são prevalentemente liofilizadas (criodessecadas) pois a apresentação pode proporcionar estabilidade de prateleira melhorada. A criodessecação é uma técnica comumente empregue para preservação das proteínas que serve para remover água da preparação de proteínas de interesse. A criodessecação, ou liofilização, é um processo pelo qual o material a ser seco é em primeiro lugar congelado e depois o gelo ou solvente gelado é removido por sublimação em um ambiente de vácuo. Um excipiente pode ser incluído em formulações pré-liofilizadas para intensificar a estabilidade durante o processo de criodessecação e/ou para melhorar a estabilidade do produto liofilizado após armazenamento. Pikal, M. (1990), Biopharm. 3 (9) 26-30 e Arakawa et al. (1991), Pharm. Res. 8 (3): 285-291.

[0005] Uma molécula desenhada com alvos biológicos específicos e os requisitos de dosagem resultantes para o produto colocam novos problemas para o processo de fabricação. A técnica corrente envolve um processo simples onde o produto é formulado até uma concentração alvo e depois cheio em recipientes a um volume definido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Esta invenção está dirigida a um processo para gerar produto de fármaco liofilizado. Em particular se relaciona com a formulação, enchimento e garantia da quantidade requerida de produto presente pós-reconstituição com um volume fixo de diluente de um produto liofilizado para uso.

[0007] É proporcionado de acordo com a presente invenção um processo para preparação de uma formulação farmacêutica liofilizada de uma proteína terapêutica, que compreende: (a) proporcionar de uma formulação de uma quantidade a granel da proteína terapêutica, (b) medição da concentração da proteína terapêutica na referida formulação a granel, (c) ajuste do peso de enchimento da proteína na referida formulação a granel para se alcançar uma dose fixa da proteína e (d) liofilização da formulação ajustada quanto ao peso de enchimento da proteína para se alcançar uma formulação final em um recipiente. em que a concentração de produto pós-reconstituição com um volume fixo está dentro de uma gama de aceitação predeterminada.

[0008] No processo anterior é preferencial que a concentração de proteína na formulação final seja menor ou igual a cerca de 20 ou 25 mg/mL, com cerca de 0,5 mg/mL, cerca de 0,05 mg/mL, cerca de 18 mg/mL, cerca de 20 mg/mL e cerca de 21 mg/mL sendo as mais preferidas. Proteínas terapêuticas preferenciais nos processos desta invenção são romiplostim, blinatumomab, infliximab, trastuzumab, AMG 701 e AMG 330. AMG 701 e AMG 330 são construtos de anticorpos de cadeia única biespecíficos e outros construtos de anticorpos de cadeia única biespecíficos (por exemplo, envolvedores de células T biespecíficos) são proteínas terapêuticas preferenciais nos processos da invenção. Excipientes farmacêuticos preferenciais presentes na formulação compreendem açúcares, com trealose, sacarose e um hidrato de qualquer um deles sendo os mais preferidos. Excipientes farmacêuticas preferenciais compreendem também tampões, com histidina, ácido cítrico mono-hidratado, fosfato de sódio, fosfato de potássio e ácido glutâmico preferenciais. Excipientes preferenciais compreendem adicionalmente tensoativos, com polissorbato 20 e polissorbato 80 sendo os mais preferidos. Excipientes e proteínas terapêuticas preferenciais usados de acordo com os processos desta invenção aparecem na Tabela 1, com cerca das concentrações preferenciais de cada um listadas em baixo de cada proteína e excipiente.

[0009] Tabela 1—Componentes de Formulação Preferenciais Proteína Açúcar Tampão Agente de Tensoativo pH volume/

Agente solubi- lizante romiplostim Sacarose Histidina Manitol Polissorbato 5,0 0,5 mg/mL 2% p/v 10 mM 4% p/v 20 0,004% p/v blinatumomab Trealose Ácido -- Polissorbato 7,0 55 mcg/mL 15% p/v cítrico 80 mono- 0,1% p/v hidratado 25 mM; Hidro- cloreto de L- lisina 200 mM infliximab Sacarose Fosfato -- Polissorbato 7,2 20 ± 1,5 10% p/v de sódio 80 mg/mL 10 mM 0,01% p/v trastuzumab α,α- Histidina -- Polissorbato 6,1 21 mg/mL trealose 0,303 20 di- mg/mL; 0,0840 mg/mL hidratada Hidro- 19,1 cloreto mg/mL de L- histidina mono- hidratado

0,470 mg/mL AMG 701 Sacarose Ácido L- -- Polissorbato 4,2 1 mg/mL 9% p/v glutâmico 80 10 mM 0,010% p/v AMG 330 Sacarose Fosfato SBE-CD Polissorbato 6,1 0,5 mg/mL 8% p/v de 1% p/v 80 potássio 0,010% p/v 10 mM

[0010] Adicionalmente de acordo com a presente invenção, a formulação pode compreender outros excipientes como descrito doravante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A Figura 1 é um mapa de superfície de resposta mostrando um espaço de desenho exemplificativo para um produto a baixa dose no qual a formulação e peso de enchimento seguiriam uma estratégia de controle típica. O espaço cinza representa em que a variabilidade do método/reconstituição teria uma probabilidade maior do que 50% de ter um resultado de concentração de proteína falhado. O quadrado grande mostra a gama de operação corrente para desenvolvimento da formulação. O retângulo mais pequeno mostra uma gama de operação eficaz.

[0012] A Figura 2 é um mapa de superfície de resposta mostrando um espaço de desenho exemplificativo para um produto a baixa dose no qual a osmolalidade é considerada adicionalmente à concentração a granel e volume de enchimento. A região cinza-clara mostra a especificação de concentração de produto de fármaco aumentada em que a variabilidade do método/reconstituição teria uma probabilidade maior do que 50% de ter um resultado de concentração de proteína falhado. A área cinza-escura mostra a especificação de osmolalidade. O retângulo mostra a gama de espaços de desenho para a gama operacional de limite de alerta (ALOR) de controle dentro do processo do volume (IPC) de enchimento (eixo dos x) e da concentração a granel formulada (eixo dos y).

[0013] A Figura 3 é um mapa de superfície de resposta mostram um exemplo de uma estratégia de controle do volume de enchimento e formulação viável mas não tolerante a falhas. A curva e seta com duas cabeças mostram o provável erro alvo de enchimento. A área cinza-clara representa a especificação de concentração de produto de fármaco aumentada, com a área cinza-clara mostrando onde a variabilidade do método/reconstituição teria uma probabilidade maior do que 50% de ter um resultado de concentração de proteína falhado. A área cinza-escura define a especificação de osmolalidade. O retângulo mostra o IPC/ALOR.

[0014] A Figura 4 é um mapa de superfície de resposta mostrando um exemplo de uma estratégia de controle do peso de enchimento e formulação com dificuldade na extremidade do controle da gama, com um granel formulado mais baixo esperado e peso de enchimento mais baixo. A curva esquerda e seta de duas cabeças mostram o provável erro alvo de enchimento a um baixo volume de enchimento. A curva direita e seta de duas cabeças mostram o provável erro alvo de enchimento a um volume de enchimento mais elevado. A área cinza-clara representa a especificação de concentração de produto de fármaco aumentada, com a área cinza-clara mostrando onde a variabilidade do método/reconstituição teria uma probabilidade maior do que 50% de ter um resultado de concentração de proteína falhado. A área cinza-escura define a especificação de osmolalidade. O retângulo mostra o IPC/ALOR.

[0015] A Figura 5 é um mapa de superfície de resposta mostrando um exemplo de uma estratégia combinada de uso do resultado a granel de formulação para depois se ajustar o ponto definido do peso de enchimento com base em uma dose de produto total do alvo de frasco, resultando em um processo de fármaco liofilizado viável, tolerante a falhas. A curva e seta com duas cabeças mostram o provável erro alvo de enchimento. A área cinza-clara define a especificação de concentração de produto de fármaco aumentada como nas Figuras 1 a 4. A área cinza-escura define a especificação de osmolalidade. O romboide mostra o IPC/ALOR, limitada pela especificidade de osmolalidade aos volumes de enchimento mais elevados dentro do IPC/ALOR.

[0016] A Figura 6 mostra pesos de enchimento normalizados vs. concentração de proteína de produto pós-reconstituição como determinado de acordo com o Exemplo 1 doravante.

[0017] A Figura 7 mostra pesos de enchimento normalizados vs. osmolalidade como determinado de acordo com o Exemplo 1 doravante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definição de termos

[0018] Na descrição que se segue, um número de termos é usado extensivamente. As seguintes definições são proporcionadas para facilitar o entendimento da invenção.

[0019] A não ser que de outro modo especificado, “um”, “uma”, “o/a” e “pelo menos um(a)” são usados indistintamente e significam um ou mais do que um. Adicionalmente, a não ser que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singulares deverão incluir pluralidades e os termos plurais deverão incluir o singular.

[0020] Como usada aqui, uma “composição farmacêutica” ou uma “formulação” é uma composição estéril de (i) um fármaco farmaceuticamente ativo, tal como uma proteína biologicamente ativa, que é adequada para administração parenteral (incluindo mas não se limitando a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, aerossolizada, intrapulmonar, intranasal ou intratecal) a um paciente com sua necessidade e (ii) um ou mais excipientes, diluentes e outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis considerados seguros pela Federal Drug Administration ou outras autoridades nacionais estrangeiras. As formulações farmacêuticas incluem soluções líquidas (por exemplo, aquosas) que podem ser diretamente administradas e pós liofilizados que podem ser reconstituídos em soluções por adição de um diluente antes da administração. O termo “formulação farmacêutica” exclui especificamente, no entanto, composições para administração tópica a pacientes,

composições para ingestão oral e composições para alimentação parenteral.

[0021] “Vida de prateleira”, como usado aqui, significa que o período de armazenamento durante o qual um ingrediente ativo (por exemplo, um anticorpo) em uma formulação farmacêutica tem degradação mínima (por exemplo, não mais do que cerca de 5% a 10% de degradação) quando a formulação farmacêutica é armazenada sob condições de armazenamento especificadas (por exemplo, 2-8 °C). As técnicas para avaliação da degradação variam dependendo da identidade da proteína na formulação farmacêutica. Técnicas exemplificativas incluem cromatografia por exclusão de tamanhos (SEC)-HPLC para detectar, por exemplo, a agregação, HPLC de fase reversa (RP) para detectar, por exemplo, a fragmentação da proteína, HPLC de permuta iônica para detectar, por exemplo, mudanças na carga da proteína, espectrometria de massa, espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de dicroísmo circular (CD), espectroscopia de infravermelhos com transformada de Fourier (FT-IR) e espectroscopia Raman para detectar mudanças conformacionais da proteína. Todas estas técnicas podem ser usadas isoladamente ou em combinação para se avaliar a degradação da proteína na formulação farmacêutica e se determinar a vida de prateleira dessa formulação. As formulações farmacêuticas da presente invenção exibem tipicamente aumentos de não mais do que cerca de 5% a 10% na degradação (por exemplo, fragmentação, agregação ou desdobramento) ao longo de dois anos quando armazenadas a 2-8 °C.

[0022] Como usado aqui, formulações “estáveis” de proteínas biologicamente ativas são formulações que exibem (i) agregação reduzida e/ou perda de atividade biológica reduzida de pelo menos 20% após armazenamento a 2-8 °C durante pelo menos 2 anos em comparação com uma amostra de fórmula de controle, ou (ii) agregação reduzida e/ou perda de atividade biológica reduzida sob condições de estresse térmico (por exemplo, 25 °C durante 1 semana a 12 semanas; 40 °C durante 1 a 12 semanas; 52 °C durante 7-8 dias, etc.). Em uma modalidade, uma formulação é considerada estável quando a proteína na formulação retém sua estabilidade física, estabilidade química e/ou atividade biológica.

[0023] Se pode dizer que uma proteína “retém sua estabilidade física” em uma formulação se, por exemplo, não mostrar sinais de agregação, precipitação e/ou desnaturação após exame visual da cor e/ou limpidez ou como medida por dispersão da luz UV ou por cromatografia por exclusão de tamanhos (SEC) ou eletroforese, tal como com referência à turbidez ou formação de agregados.

[0024] Se pode dizer que uma proteína “retém sua estabilidade química” em uma formulação se, por exemplo, a estabilidade química em um dado momento for tal que nenhuma entidade química nova resulta da modificação da proteína por formação de ligações ou clivagem. Em uma modalidade adicional, a estabilidade química pode ser avaliada por detecção e quantificação de formas quimicamente alteradas da proteína. A alteração química pode envolver, por exemplo, modificação do tamanho (por exemplo, recorte), que pode ser avaliada usando cromatografia por exclusão de tamanhos, SDS- PAGE e/ou ionização por dessorção a laser assistida por matriz/espectrometria de massa com tempo de voo (MALDI/TOF MS). Outros tipos de alteração química incluem, por exemplo, alteração da carga (por exemplo, resultando da desamidação), que pode ser avaliada por cromatografia de permuta iônica. A oxidação é outra modificação química comumente vista.

[0025] Se pode dizer que uma proteína “retém sua atividade biológica” em uma formulação farmacêutica em relação à proteína não modificada se, por exemplo, a percentagem de atividade biológica da proteína formulada (por exemplo, um anticorpo) como determinado por um ensaio (por exemplo, um ensaio de ligação ao antígeno) em comparação com a solução de controle estiver entre cerca de 50% e cerca de 200%, cerca de 60% e cerca de 170%, cerca de 70% e cerca de 150%, cerca de 80% e cerca de 125% ou cerca de 90% e cerca de 110%. Em uma modalidade adicional se pode dizer que uma proteína “retém sua atividade biológica” em uma formulação farmacêutica se, por exemplo, sem limitação, a atividade biológica da proteína em um dado momento for pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[0026] Como usados aqui, os termos “compreendendo” e “compreende” se destinam a significar que as formulações e métodos incluem os elementos listados mas não excluem outros elementos não listados. Os termos “consistindo essencialmente em” e “consiste essencialmente em”, quando usados para definir formulações e métodos, incluem os elementos listados, excluem elementos não listados que alteram a natureza básica da formulação e/ou método, mas não excluem outros elementos não listados. Logo, uma formulação consistindo essencialmente em elementos definidos aqui não excluiria quantidades vestigiais de outros elementos, tais como contaminantes de quaisquer métodos de isolamento e purificação ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), conservantes e similares, mas excluiria, por exemplo, aminoácidos não especificados adicionais. Os termos “consistindo em” e “consiste em” quando usados para definir formulações e métodos excluem mais do que elementos vestigiais de outros ingredientes e passos de método substanciais para administração das composições descritas aqui. As modalidades definidas por cada um destes termos de transição estão dentro do escopo desta divulgação e das invenções incorporadas aqui.

[0027] O termo “isolado” como usado aqui se refere a uma proteína (por exemplo, um anticorpo) que foi identificada e separada e/ou recuperada a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com usos de diagnóstico ou terapêuticos para a proteína e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferenciais, a proteína será purificado (1) até mais do que 95% em peso do anticorpo como determinado pelo método de Lowry e, o mais preferencialmente, mais do que 99% em peso, (2) até um grau suficiente para se obterem pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por uso de um sequenciador de copo giratório ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando corante de azul de Coomassie ou, preferencialmente, prata. A proteína isolada inclui a proteína in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural da proteína não estará presente. Habitualmente, no entanto, a proteína isolada será preparada por pelo menos um passo de purificação.

[0028] A invenção diz respeito a processos para formulações farmacêuticas de proteínas terapêuticas tais como anticorpos. “Anticorpos” (Ab) e o sinônimo “imunoglobulinas” (Ig) são glicoproteínas tendo as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorpos exibem especificidade de ligação a um antígeno específico, as imunoglobulinas incluem tanto os anticorpos como outras moléculas tipo anticorpos que não têm especificidade de antígeno. Os polipeptídeos deste último tipo são, por exemplo, produzidos a baixos níveis pelo sistema linfático e a níveis aumentados por mielomas. Assim, como usado aqui, o termo “anticorpo” ou “peptídeo(s) de anticorpo” se refere a um anticorpo intacto, um derivado de anticorpo, um análogo de anticorpo, um anticorpo geneticamente alterado, um anticorpo tendo um marcador detectável, um anticorpo que compete quanto à ligação específica com um anticorpo divulgado em este relatório descritivo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv,

anticorpo de domínio único) que compete com o anticorpo intacto quanto à ligação específica e inclui anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos e biespecíficos. Em certas modalidades, os fragmentos de ligação ao antígeno são produzidos, por exemplo, por técnicas de DNA recombinante. Em modalidades adicionais, os fragmentos de ligação ao antígeno são produzidos por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv e anticorpos de cadeia única.

[0029] O termo “anticorpos intactos” como usado aqui se refere a anticorpos compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Este termo inclui assim sem limitação anticorpos totalmente humanos, anticorpos geneticamente alterados, anticorpos biespecíficos e derivados de anticorpos contanto que tais anticorpos compreendam duas cadeias pesadas e duas cadeias leves.

[0030] O termo “anticorpo monoclonal” como usado aqui não está limitado aos anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não ao método pelo qual é produzido.

[0031] Os anticorpos monoclonais e construtos de anticorpo formulados de acordo com a presente invenção especificamente incluem anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o resto da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente dos E.U.A. No. 4,816,567; Morrison et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855). Os anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos “primatizados” compreendendo sequências de ligação ao antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, Símio, etc.) e sequências de região constante humana. Uma variedade de abordagens para preparação de anticorpos quiméricos foi descrita. Ver, por exemplo, Morrison et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851; Takeda et al. (1985), Nature 314: 452, Cabilly et al., Patente dos E.U.A. No. 4,816,567; Boss et al., Patente dos E.U.A. No. 4,816,397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; e GB 2177096.

[0032] Os anticorpos monoclonais e construtos de anticorpo formulados de acordo com a presente invenção incluem especificamente anticorpos referidos como “humanos” ou “totalmente humanos”. Os termos “anticorpo humano” e “anticorpo totalmente humano” se referem cada um a um anticorpo que tem uma sequência de aminoácido de uma imunoglobulina humana, incluindo anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou a partir de animais transgênicos quanto a uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas; por exemplo, anticorpos Xenomouse® e anticorpos como descritos por Kucherlapati et al. na Patente dos E.U.A. No. 5,939,598.

[0033] O termo “anticorpos geneticamente alterados” significa anticorpos em que a sequência de aminoácidos foi variada a partir daquela de um anticorpo nativo. Devido à relevância das técnicas de DNA recombinante na geração de anticorpos, não é necessário se estar confinado às sequências de aminoácidos encontradas em anticorpos naturais; os anticorpos podem ser redesenhados para se obterem características desejadas. As variações possíveis são muitas e variam de mudanças a apenas um ou alguns aminoácidos ao redesenho completo, por exemplo, da região variável e/ou constante. As mudanças na região constante serão, em geral, feitas de modo a melhorar ou alterar características, tais como fixação do complemento, interação com membranas e outras funções efetoras, bem como manufaturabilidade e viscosidade. As mudanças na região variável serão feitas de modo a melhorar as características de ligação ao antígeno.

[0034] Um “fragmento Fab” é compreendido por uma cadeia leve e as regiões CH1 e variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.

[0035] Um “fragmento Fab'” contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém mais da região constante, entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação de dissulfeto intercadeias possa ser formada entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2.

[0036] Um “fragmento F(ab')2” contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação de dissulfeto intercadeias seja formada entre as duas cadeias pesadas.

[0037] Os termos “fragmento Fv” e “anticorpo de cadeia única” se referem a polipeptídeos contendo regiões variáveis de anticorpo de cadeias tanto pesadas como leves mas não tendo regiões constantes. Tal como um anticorpo completo é capaz de se ligar seletivamente a um antígeno específico. Com um peso molecular de somente cerca de 25 kDa, os fragmentos Fv são muito mais pequenos do que os anticorpos comuns (150-160 kD) que são compostos por duas cadeias de proteínas pesadas e duas cadeias leves e ainda mais pequenos do que fragmentos Fab (cerca de 50 kDa, uma cadeia leve e metade de uma cadeia pesada).

[0038] Um “anticorpo de domínio único” é um fragmento de anticorpo consistindo em uma unidade Fv de domínio único, por exemplo, VH ou VL. Tal como um anticorpo completo é capaz de se ligar seletivamente a um antígeno específico. Com um peso molecular de somente 12-15 kDa, os anticorpos de domínio único são muito mais pequenos do que os anticorpos comuns (150-160 kDa) que são compostos por duas cadeias de proteínas pesadas e duas cadeias leves e ainda mais pequenos do que fragmentos Fab (cerca de 50 kDa, uma cadeia leve e metade de uma cadeia pesada) e fragmentos variáveis de cadeia única (cerca de 25 kDa, dois domínios variáveis, um de uma cadeia leve e um de uma pesada). Os primeiros anticorpos de domínio único foram manipulados a partir de anticorpos de cadeia pesada encontrados em camelídeos. Embora a maioria da investigação em anticorpos de domínio único esteja correntemente baseada em domínios variáveis de cadeia pesada foi também mostrado que os domínios variáveis de cadeia leve e nanocorpos derivados de cadeias leves se ligam especificamente a epítopos alvo.

[0039] O termo “biespecífico” como usado aqui se refere a um construto de anticorpo que é “pelo menos biespecífico”, i.e., compreende pelo menos um primeiro domínio de ligação e um segundo domínio de ligação, em que o primeiro domínio de ligação se liga a um antígeno ou alvo (por exemplo, CD3) e o segundo domínio de ligação se liga a outro antígeno ou alvo (por exemplo, BCMA; por exemplo, CD33). Conformemente, os construtos de anticorpo de acordo com a invenção compreendem especificidades para pelo menos dois antígenos ou alvos diferentes. O termo “construto de anticorpo biespecífico” da invenção engloba também construtos de anticorpo multiespecíficos tais como construtos de anticorpo triespecíficos, incluindo estes últimos três domínios de ligação, ou construtos tendo mais do que três (por exemplo, quatro, cinco…) especificidades.

[0040] Dado que os construtos de anticorpo de acordo com a invenção são (pelo menos) biespecíficos, não ocorrem naturalmente e são marcadamente diferentes de produtos ocorrendo naturalmente. Um construto de anticorpo ou imunoglobulina “biespecífico” é consequentemente um anticorpo ou imunoglobulina híbrido artificial tendo pelo menos dois locais de ligação distintos com diferentes especificidades. Os construtos de anticorpo biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab’. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990).

[0041] Os pelo menos dois domínios de ligação e os domínios variáveis do construto de anticorpo da presente invenção podem ou não compreendem agentes de ligação de peptídeo (peptídeos espaçadores). O termo “agente de ligação de peptídeo” compreende de acordo com a presente invenção uma sequência de aminoácidos pela qual as sequências de aminoácidos de um domínio (variável e/ou de ligação) e outro domínio (variável e/ou de ligação) do construto de anticorpo da invenção são ligados entre si. Uma característica técnica essencial de tal agente de ligação de peptídeo é que não compreende qualquer atividade de polimerização. Entre os agentes de ligação de peptídeo adequados estão aqueles descritos nas Patentes dos E.U.A. 4,751,180 e 4,935,233 ou WO 88/09344. Os agentes de ligação de peptídeos podem ser usados para anexar outros domínios ou módulos ou regiões (tais como domínios prolongadores da meia-vida) ao construto de anticorpo da invenção.

[0042] No caso de ser usado um ligante, este ligante tem preferencialmente um comprimento e sequência suficientes para assegurar que cada um dos primeiro e segundo domínios possa, independentemente um do outro, reter suas especificidades de ligação diferenciais.

Para ligantes de peptídeo que conectam os pelo menos dois domínios de ligação (ou dois domínios variáveis) no construto de anticorpo da invenção são preferenciais aqueles ligantes de peptídeo que compreendem somente um pequeno número de resíduos de aminoácido, por exemplo, 12 resíduos de aminoácido ou menos.

Assim, ligantes de peptídeo de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 resíduos de aminoácido são preferenciais.

Um ligante de peptídeo previsto com menos do que 5 aminoácidos compreende 4, 3, 2 ou um aminoácido, em que ligantes ricos em Gly são preferenciais.

Um aminoácido “único” particularmente preferencial no contexto do referido “ligante de peptídeo” é Gly.

Conformemente, o referido ligante de peptídeo pode consistir no aminoácido único Gly.

Outra modalidade preferencial de um ligante de peptídeo é caracterizada pela sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, i.e., Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), ou seus polímeros, i.e., (Gly4Ser)x, onde x é um número inteiro de 1 ou mais (por exemplo, 2 ou 3). As características do referido ligante de peptídeo, que compreendem a ausência da promoção de estruturas secundárias são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em Dall’Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol.

Immunol. (1992) 29, 21-30) e Raag e Whitlow (FASEB (1995) 9 (1), 73-80). Ligantes de peptídeo que além do mais não promovem quaisquer estruturas secundárias são preferenciais.

A ligação dos referidos domínios entre si pode ser proporcionada, por exemplo, por modificação genética, como descrito nos exemplos.

Métodos para preparação de construtos de cadeia única biespecíficos fundidos e operacionalmente ligados e expressão dos mesmos em células de mamífero ou bactérias são bem conhecidos na técnica (por exemplo, WO 99/54440 ou Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2001).

[0043] De acordo com uma modalidade particularmente preferencial, e como documentado nos exemplos anexos, os construtos de anticorpo AMG 701 e AMG 330 da invenção são cada um um “construto de anticorpo de cadeia única biespecífico”, mais preferencialmente um “Fv de cadeia única” (scFv) biespecífico. Embora os dois domínios dos fragmentos de Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um agente de ligação sintético - como descrito anteriormente - que permite que os mesmos sejam feitos como uma cadeia de proteína única na qual as regiões de VL e VH emparelham para formar uma molécula monovalente; ver, por exemplo, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à função da mesma maneira como o são anticorpos inteiros ou de comprimento total. Um fragmento variável de cadeia única (scFv) é consequentemente uma proteína de fusão da região variável da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) de imunoglobulinas, usualmente conectada com um curto peptídeo agente de ligação de cerca de dez a cerca de 25 aminoácidos, preferencialmente cerca de

15 a 20 aminoácidos. O agente de ligação é usualmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar o terminal N do VH ao terminal C do VL ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e introdução do agente de ligação.

[0044] Moléculas de cadeia única biespecíficas são conhecidas na técnica e são descritas em WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (ver, inter alia, Patente dos EUA 4,946,778) podem ser adaptadas para produzirem construtos de anticorpo de cadeia única reconhecendo especificamente (um) alvo(s) eleito(s).

[0045] Fragmentos variáveis bivalentes (também chamados divalentes) ou de cadeia única biespecíficos (bi-scFvs ou di-scFvs tendo o formato (scFv)2) podem ser manipulados por ligação de duas moléculas de scFv (por exemplo, com agentes de ligação como descrito anteriormente). Se estas duas moléculas de scFv tiverem a mesma especificidade de ligação, a molécula (scFv)2 resultante será preferencialmente chamada bivalente (i.e., tem duas valências para o mesmo epítopo alvo). Se as duas moléculas scFv tiverem diferentes especificidades de ligação, a molécula (scFv)2 resultante será preferencialmente chamada biespecífica. A ligação pode ser feita por produção de uma cadeia de peptídeo única com duas regiões VH e duas regiões VL, originando scFvs em tandem (ver, por exemplo, Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22 (5): 238-244). Outra possibilidade é a criação de moléculas scFv com peptídeos agentes de ligação que são demasiado curtos para as duas regiões variáveis se dobrarem em conjunto (por exemplo, cerca de cinco aminoácidos), forçando as scFvs a dimerizarem. Este tipo é conhecido como diacorpos (ver, por exemplo, Hollinger, Philipp et al., (julho 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8).

[0046] Como descrito acima, a invenção proporciona uma modalidade preferencial em que o construto de anticorpo está em um formato selecionado do grupo consistindo em (scFv)2, scFv-mAb de domínio único, diacorpos e oligômeros de qualquer um destes formatos.

[0047] De acordo com uma modalidade também preferencial do construto de anticorpo da invenção, a cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) de um domínio de ligação se ligando ao antígeno alvo CD3 e CD33 ou BCMA não estão diretamente conectadas através do agente de ligação de peptídeo descrito acima mas o domínio de ligação é formado devido à formação de uma molécula biespecífica como descrito para o diacorpo. Assim, a cadeia VH do domínio de ligação a CD3 pode ser fundido à VL do domínio de ligação a CD33 ou BCMA através de tal agente de ligação de peptídeo, enquanto a cadeia VH do domínio de ligação a CD3 é fundida à VL do domínio de ligação a CD33 ou BCMA através de tal agente de ligação de peptídeo.

[0048] Os termos “amino-terminal” e “carboxila-terminal” e suas formas encurtadas “terminal N” e “terminal C” são usados aqui para denotar posições dentro de polipeptídeos. Onde o contexto permitir, estes termos são usados com referência a uma sequência ou porção de um polipeptídeo particular para denotar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma certa sequência posicionada carboxila-terminal em relação a uma sequência de referência dentro de um polipeptídeo está localizada proximal do terminal carboxila da sequência de referência, mas não está necessariamente no terminal carboxila do polipeptídeo completo.

[0049] Como usado aqui, o termo “aminoácido” se refere a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D e L, análogos de aminoácidos e peptidomiméticos, incluindo sem limitação análogos N-acetila de isômeros ópticos D ou L (por exemplo, arginina de N-acetila). Em alguns aspectos, o termo aminoácido se refere a aminoácidos monoméricos.

[0050] Geralmente, as nomenclaturas usadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e ácidos nucleicos e hibridação descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo a não ser que de outro modo indicado. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al. (1992), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e Harlow e Lane (1990), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Quaisquer reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente alcançado na técnica ou como descrito aqui. A terminologia usada em conexão com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Podem ser usadas técnicas padrão para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e administração farmacêuticas e tratamento de pacientes. Uso de concentrações formuladas intermediárias

[0051] O objetivo da formulação de proteínas é transformar uma solução de proteína recombinante, altamente purificada (substância de fármaco) em uma forma de dosagem biofarmacêutica eficaz, estável. Kamerzell et al. (2011), 63 (13): 1118-59 (incorporado por referência). O primeiro passo, frequentemente chamado caracterização pré-formulação, envolve determinação das propriedades físico-químicas e vias de instabilidade da proteína, o que permite o desenho de formulações contendo vários excipientes para assegurar a estabilidade da proteína sob condições de armazenamento definidas. Ao mesmo tempo, métodos analíticos para monitorizar a integridade físico-química e atividade biológica da proteína sob condições de formulação (por exemplo, na presença de excipientes) necessitam de ser desenvolvidos, em conjunto com especificações para definir limites aceitáveis para quaisquer mudanças em estes parâmetros. Formulações específicas a diferentes concentrações de proteína com níveis visados de vários excipientes farmacêuticos são depois experimentalmente testadas para assegurar a estabilidade, solubilidade e tonicidade ao longo da vida de prateleira. Adicionalmente, o recipiente primário é selecionado (por exemplo, frasco, cartucho ou seringa pré-cheia) para armazenar a mistura excipiente-proteína e facilitar a administração parenteral pelo paciente ou um profissional médico. A forma de dosagem de fármaco ou vacina biofarmacêutico inteira (proteína, excipientes, recipiente primário e dispositivo de administração) tem de ser desenhada quanto à escalabilidade, para permitir fabricação comercial sob condições estéreis, e para atender a todas as diretrizes regulatórias para a produção e teste de formas de dosagem biofarmacêuticas para uso humano.

[0052] O desenvolvimento da formulação começa geralmente com a identificação do pH e sistema de tampão certos através de uma estratégia de rastreamento biofísico. São adicionados tampões à solução de proteína para estabilizar o pH, o que por seu turno estabiliza a proteína porque a estabilidade de uma proteína está geralmente ligada a uma gama de pH estreita, característica. Ver Garidel e Bassarab (2009), “Impact of formulation design on stability and quality”, em: Quality for Biologics: Critical Quality Attributes, Process and Change Control, Production Variation, Characterisation, Impurities and Concerns, Biopharm Knowledge Publishing, Londres, RU, pp. 94–113 (incorporado por referência). Outros excipientes de formulação, tais como estabilizantes (por exemplo, açúcares), agentes de volume (por exemplo, manitol) e tensoativos (por exemplo, polissorbato 20) são depois adicionados à solução de proteína tamponada. Para uma formulação liofilizada, uma tal mistura de formulação em forma líquida é depois liofilizada.

[0053] Na liofilização como em outros processos de produto de fármaco, um controle-chave é peso de enchimento da proteína terapêutica para administrar a dose requerida ao paciente. Para produtos de concentração mais elevada, uma estratégia simples de controle da concentração de produto na etapa de formulação, seguida por controle do peso de enchimento como parte do processo de enchimento, é adequada. Para administração de dose muito baixa em micro ou mesmo miligramas de produto, no entanto, esta estratégia simples para assegurar a administração da dose começa a ter problemas em assegurar que o paciente possa receber a dose requerida. Preocupações relacionadas são que o rótulo do produto pode não refletir o produto dentro do recipiente e que se pode ter dificuldade na extração do material para dosagem. Existe uma necessidade, portanto, de um processo proporcionando maior controle sobre o peso de enchimento de uma proteína terapêutica em uma formulação farmacêutica liofilizada.

[0045] Como notado acima, uma estratégia simples de controle da concentração de produto na etapa de formulação, seguida depois por controle do peso de enchimento como parte do processo de enchimento, é adequada para concentrações mais elevadas de proteína terapêutica mas pode levar a problemas em concentrações mais baixas. O espaço de desenho para controle do peso de enchimento para produto a baixa dose quando o peso de enchimento e alvo de formulação são controlados separadamente mostra uma variabilidade mais elevada, com uma maior probabilidade de que o produto não cumprirá a especificação de liberação. Devido à variabilidade da fabricação, o controle preciso do granel formulado não é alcançável devido à escala do processo e à variabilidade inerente do equipamento na fabricação. Outro problema é que a variabilidade aumentada é inerente no produto liofilizado porque o produto tem de ser reconstituído, o que é também um processo variável.

[0046] Uma estratégia de controle típica (mostrada na Figura 1) teria uma probabilidade maior do que 50% de ter um resultado de concentração de proteína falhado. Na Figura 1, a variabilidade global observada dos dados de homogeneidade liofilizada é 0,01 mg/mL. Para assegurar capacidade mínima, a gama de operação média tem de ser restrita tal que corresponda a uma gama de especificação “aumentada” por 3*0,01=0,03 mg/mL. Um processo que é visado dentro do espaço branco tem qualidade de menos do que 0,1% de frascos Fora da Especificação (OOS) por lote. Um processo que é visado dentro da área sombreada, em contraste, tem taxas de OOS maiores. Como pode ser visto a partir da Figura 1, a gama de operação corrente (quadrado grande) contém extremidades de falha da formulação desejada. Uma gama de operação eficaz (retângulo mais pequeno na Figura 1), no entanto, requer tolerâncias de enchimento mais estreitas do que podem ser alcançadas como parte tanto da variabilidade de formulação como do controle do peso de enchimento.

[0047] Assim, um processo que também necessita de considerar outros atributos de qualidade do produto (por exemplo, osmolalidade, pH) bem como concentração de proteína poderia não ser reprodutível ou viável pela metodologia padrão. A Figura 2 mostra um espaço de desenho exemplificativo no qual uma especificação de osmolalidade é considerada. A coloração cinza mostra as condições de falhas extensivas dentro do IPC/gama de operação de limite de alerta.

[0048] A metodologia padrão pode também resultar em uma estratégia de controle do peso de enchimento e controle de formulação viável mas não tolerante a falhas (ver Figura 3). Como na Figura 1, o IPC/ALOR contém áreas que não cumprem a especificação de concentração de produto de fármaco. Dentro da área que não cumpre a especificação de concentração de produto de fármaco (área branca dentro do IPC/ALOR) existe muito pouco espaço para erro no alvo de enchimento. Assim, como mostrado na Figura 3, a metodologia padrão pode resultar em um processo com dificuldade na extremidade da gama de controle, viável mas sem tolerância a falhas suficientes.

[0049] Um aumento no volume de enchimento poderia não ser suficiente de uma variação de processo para criar uma formulação viável com tolerância a falhas adequada. A Figura 4 é um mapa de superfície de resposta no qual o volume de enchimento é aumentado. A gama alvo de enchimento pode ser levada dentro do IPC/ALOR e especificações do produto mas a tolerância a falhas pode permanecer inadequada. A gama de pesos de enchimento sobre a gama permissível da concentração a granel formulada tem tolerância a falhas insuficiente.

[0050] Se o resultado a granel formulado for usado para depois ajustar o peso de enchimento da proteína terapêutica, a gama de operação pode ser mudada o suficiente para permitir uma formulação que seja tanto viável como suficientemente tolerante a falhas. Como mostrado na Figura 5, a gama de operação modificada (IPC/ALOR) permite que a gama alvo de enchimento esperada esteja bem dentro das especificações de concentração e osmolalidade. Deste modo, a gama alvo de enchimento pode ser proporcionada dentro das especificações de concentração e outras com tolerância a falhas suficiente.

[0051] Até à data, esta técnica tem sido usada para uma unidade de manutenção do estoque (SKU) de baixa dose para SKU de baixa dose de romiplostim (Nplate®), blinatumomab (Blincyto®), infliximab e trastuzumab. Detalhes sobre o uso desta técnica aparecem nos Exemplos de Trabalho doravante.

Excipientes em geral

[0052] Um desafio nas formulações é estabilização do produto contra os estresses de fabricação, envio e armazenamento, o que pode ser alcançado por certos excipientes de formulação. Em geral, os excipientes podem ser classificados com base nos mecanismos pelos quais estabilizam proteínas contra vários estresses químicos e físicos. Alguns excipientes aliviam os efeitos de um estresse específico ou regulam uma suscetibilidade particular de uma proteína específica. Outros excipientes afetam mais geralmente as estabilidades físicas e covalentes de proteínas.

[0053] Excipientes comuns de formulações de proteínas líquidas e liofilizadas aparecem na Tabela 2 (ver Kamerzell et al. (2011), Advanced Drug Delivery Rev. 63 (13): 1118- 59).

[0054] Tabela 2: Componentes de excipientes de formulações de proteínas Componente de Função Exemplos excipiente o Manutenção do pH da o Citrato solução o Succinato o Interações o Acetato específicas tampão-íon o Glutamato Tampões com proteína o Aspartato o Histidina o Fosfato o Tris o Glicina o Proteína o Sacarose estabilizante o Trealose o Agentes tonificantes o Sorbitol o Transportador para o Manitol Açúcares e fármacos inalados o Glucose carboidratos (lactose) o Lactose o Soluções de dextrose o Derivados de durante administração ciclodextrina

IV o Intensificação da o Manitol elegância do produto o Glicina Estabilizantes e prevenção da e agentes de rutura volume o Proporcionar de força estrutural a um bolo de lio o Estabilização contra o Sacarose estresse ambiental o Trealose (temperatura, o Sorbitol desidratação) o Glicina Osmólitos o Prolina o Glutamato o Glicerol o Ureia o Interações o Histidina Aminoácidos específicas com o Arginina proteína o Glicina o Antioxidante (His, o Prolina Met) o Lisina o Tamponação, o Metionina tonificação o Misturas de aa (por exemplo, glu/arg) o Inibidores o HSA competitivos da o PVA adsorção de proteínas o PVP o Agentes de volume o PLGA para liofilização o PEG Proteínas e o Veículos de o Gelatina polímeros administração de o Dextrana fármaco o Amido de hidroxietila o HEC o CMC o Prevenção de danos o Agentes oxidativos a redutores proteínas o Removedores de o Aglutinantes de oxigênio íons de metal (se o Removedores de Antioxidantes um metal for radicais livres incluído como um o Agentes cofator ou for quelantes requerido para o (por atividade de exemplo, EDTA, protease) EGTA, DTPA)

o Removedores de o Etanol radicais livres o Cofatores de o Magnésio proteína o Zinco Íons de metal o Complexos de coordenação (suspensões) o Estabilizantes da o Metais conformação nativa o Ligantes contra o desdobramento o Aminoácidos Ligantes induzido por estresse o Poliânions específicos o Proporcionar de flexibilidade da conformação o Inibidor competitivo o Polissorbato da adsorção de 20 proteínas o Polissorbato o Inibidor competitivo 80 da desnaturação da o Poloxâmero 188 superfície de proteínas o Tensoativos o Lipossomos como aniônicos (por Tensoativos veículos de exemplo, administração de sulfonatos e fármaco sulfossuccinatos) o Inibidor da o Tensoativos agregação durante a catiônicos liofilização o Tensoativos zwitteriônicos o Redutor dos tempos de reconstituição de produto liofilizados o agentes tonificantes o NaCl o agentes o KCl estabilizantes e o NaSO4 Sais desestabilizantes para proteínas, especialmente ânions o Álcool de o Proteção contra benzila Conservantes crescimento microbiano o M-cresol em formulação o Fenol

[0055] Outros excipientes são conhecidos na técnica e podem ser encontrados em Powell et al. (1998), “Compendium of Excipients for Parenteral Formulations”, PDA J. Pharm. Sci. Tech., 52: 238-311, que é deste modo incorporado por referência.

[0056] Dados os ensinamentos e orientação proporcionados aqui, os peritos na técnica saberão que quantidade ou gama de excipiente pode ser incluída em qualquer formulação particular para se alcançar uma formulação biofarmacêutica da invenção. Por exemplo, a quantidade e tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção podem ser selecionados com base na osmolalidade desejada (i.e., isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução final bem como nas quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem incluídos na formulação. Similarmente,

por exemplificação com referência ao tipo de poliol ou açúcar incluído em uma formulação, a quantidade de um tal excipiente dependerá da sua osmolalidade.

[0057] Os peritos na técnica podem determinar qual a quantidade ou gama de excipiente pode ser incluída em qualquer formulação particular para se alcançar uma formulação biofarmacêutica da invenção que promove a retenção na estabilidade do biofarmacêutico. Por exemplo, a quantidade e tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção podem ser selecionados com base na à osmolalidade desejada (i.e., isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução final bem como nas quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem incluídos na formulação. Similarmente, por exemplificação com referência ao tipo de poliol ou açúcar incluído em uma formulação, a quantidade de um tal excipiente dependerá da sua osmolalidade.

[0058] Cerca de 5% (peso/volume) de sorbitol, por exemplo, pode alcançar isotonicidade enquanto cerca de 9% (peso/volume) de um excipiente de sacarose é necessário para se alcançar isotonicidade. A seleção da quantidade ou gama de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos em uma formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificada acima por referência a sais, polióis e açúcares. No entanto, os peritos na técnica entenderão que as considerações descritas aqui e adicionalmente exemplificadas por referência a excipientes específicos são igualmente aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes incluindo, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de tonicidade, tensoativos, estabilizantes, agentes de volume, crioprotetores, lioprotetores, antioxidantes, íons de metal, agentes quelantes e/ou conservantes.

[0059] Adicionalmente, onde um excipiente particular é relatado em uma formulação por, por exemplo, por cento (%) p/v, os peritos na técnica reconhecerão que a concentração molar equivalente desse excipiente é também contemplada.

[0060] Os peritos na técnica reconheceriam que as concentrações dos excipientes acima mencionados partilham uma interdependência dentro de uma formulação particular. A título de exemplo, a concentração de um agente de volume pode ser reduzida onde, por exemplo, existe uma elevada concentração de proteína/peptídeo ou uma elevada concentração de agente estabilizante. Adicionalmente, um perito na técnica reconheceria que, de modo a se manter a isotonicidade de uma formulação particular na qual não existe agente de volume, a concentração de um agente estabilizante seria ajustada conformemente (i.e., uma quantidade “tonificante” de estabilizante seria usada). Tampões

[0061] O pH da solução afeta a integridade química dos resíduos de aminoácidos de uma proteína (por exemplo, desamidação de Asn e oxidação de Met) e manutenção da sua estrutura de ordem mais elevada. Os peritos na técnica usam assim agentes de tamponação para controlar o pH da solução e otimizar a estabilidade da proteína. A estabilidade máxima de um fármaco de proteína é usualmente dentro de uma gama de pH estreita. Várias abordagens (por exemplo, estudos de estabilidade acelerada e estudos de rastreamento calorimétrico) são úteis para este propósito (Remmele et al. (1999), Biochemistry, 38 (16): 5241-7). Logo que uma formulação seja finalizada, o produto de fármaco tem de ser fabricado e mantido dentro de uma especificação pré-definida ao longo da sua vida de prateleira. Consequentemente, agentes de tamponação são quase sempre empregues para controlar o pH na formulação.

[0062] Ácidos orgânicos, fosfatos e Tris têm sido empregues rotineiramente como tampões em formulações de proteína (ver Tabela 3). A capacidade de tampão das espécies de tamponação é máxima a um pH igual ao pKa e diminui à medida que o pH aumenta ou diminui para longe deste valor. Noventa por cento da capacidade de tamponação existe dentro de uma unidade de pH do seu pKa. A capacidade de tampão aumenta também proporcionalmente com concentração de tampão crescente.

[0063] Tabela 3: Agentes de tamponação comumente usados e seus valores de pKa Produto de fármaco Tampão pKa exemplificativo Acetato 4,8 Neupogen®, Neulasta® pKa1 = 4,8, Succinato Actimmune® pKa2 = 5,5 pKa1 = 3,1, Citrato Humira® pKa2 = 4,8,

pKa3 = 6,4 Histidina 6,0 Xolair® (imidazol) pKa1 = 2,15, Enbrel® (formulação fosfato pKa2 = 7,2, líquida) pKa3 = 12,3 Tris 8,1 Leukine®

[0064] Adicionalmente aos anteriores, algumas proteínas terapêuticas podem ser autotamponantes a uma concentração farmaceuticamente relevante. As formulações de tais proteínas poderiam não necessitar de incluir um tampão convencional de todo. Ver pedido de patente dos EUA 2012/0028877, que é deste modo incorporado por referência. Açúcares e carboidratos

[0065] Os açúcares são frequentemente usados para estabilizar proteínas em formulações tanto líquidas como liofilizadas. Se pensa que dissacarídeos tais como sacarose e trealose estabilizam proteínas por hidratação preferencial a elevadas concentrações no estado líquido e por interações específicas com proteínas e formação de matrizes vítreas viscosas no estado sólido. As moléculas de açúcar podem aumentar a viscosidade de soluções de anticorpos monoclonais, presumivelmente devido a um mecanismo de hidratação preferencial. Os álcoois de açúcar tais como sorbitol podem estabilizar proteínas em solução e no estado liofilizado. O manitol é frequentemente usado como um agente de volume em formulações liofilizadas. A lactose é usada como uma molécula transportadora para formulações inaladas de proteínas. Os derivados da ciclodextrina podem estabilizar proteínas em formulações líquidas de anticorpos, antígenos de vacina e tais proteínas mais pequenas como fatores de crescimento, interleucina-2 e insulina. Estabilizantes e agentes de volume

[0066] Os agentes de volume são tipicamente usados em formulações liofilizadas para intensificar a elegância do produto e para prevenir rutura. As condições na formulação são geralmente desenhadas tal que o agente de volume cristalize para fora da fase amorfa congelada (durante o congelamento ou emparelhamento acima da Tg') dando a estrutura e volume do bolo. Manitol e glicina são exemplos de agentes de volume comumente usados.

[0067] Os estabilizantes incluem uma classe de compostos que podem servir como crioprotetores, lioprotetores e agentes de formação de vidro. Os crioprotetores atuam para estabilizar proteínas durante o congelamento ou no estado congelado a baixas temperaturas (P. Cameron, ed., Good Pharmaceutical Freeze-Drying Practice, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, (1997)). Os lioprotetores estabilizam proteínas na forma de dosagem sólida criodessecada por preservação das propriedades conformacionais tipo nativas da proteína durante as etapas de desidratação de criodessecação. As propriedades de estado vítreo têm sido classificadas como “fortes” ou “frágeis” dependendo das suas propriedades de relaxamento em função da temperatura. É importante que os crioprotetores, lioprotetores e agentes de formação de vidro permaneçam na mesma fase com a proteína de modo a fornecer estabilidade. Açúcares, polímeros e polióis residem em esta categoria e podem por vezes servir todos os três papéis.

[0068] Os polióis englobam uma classe de excipientes que inclui açúcares (por exemplo, manitol, sacarose, sorbitol) e outros álcoois poli-hídricos (por exemplo, glicerol e propilenoglicol). O polímero polietilenoglicol (PEG) é incluído em esta categoria. Os polióis são comumente usados como excipientes estabilizantes e/ou agentes de isotonicidade em formulações de proteínas parenterais tanto líquidas como liofilizadas. No que diz respeito à série de Hofmeister, os polióis são cosmotrópicos e são preferencialmente excluídos da superfície da proteína. Os polióis podem proteger as proteínas de vias de degradação tanto física como química. Os cossolventes preferencialmente excluídos aumentam a tensão superficial efetiva do solvente na interface da proteína por meio do que as conformações de proteína o mais energeticamente favoráveis são aquelas com as áreas de superfície mais pequenas.

[0069] O manitol é um agente de volume popular em formulações liofilizadas porque cristaliza para fora da fase de proteína amorfa durante a criodessecação emprestando estabilidade estrutural ao bolo (por exemplo, Leukine®, Enbrel® – Lyo, Betaseron®). É geralmente usado em combinação com um crio e/ou lioprotetor como sacarose. Devido à propensão do manitol a cristalizar sob condições congeladas, sorbitol e sacarose são os agentes de tonicidade/estabilizantes preferenciais em formulações líquidas para proteger o produto contra estresses de congelamento-descongelamento encontrados durante o transporte ou quando se congela a granel antes da fabricação. O sorbitol e a sacarose são de longe mais resistentes à cristalização e portanto é menos provável que se separem em termos de fase da proteína. É interessante notar que embora o manitol tenha sido usado em quantidades tonificantes em várias formulações líquidas comercializadas tais como Actimmune®, Forteo® e Rebif®, os rótulos de produto destes fármacos têm um aviso “Não Congelar”. O uso de açúcares redutores (contendo grupos aldeído ou cetona livres) tais como glucose e lactose deve ser evitado porque podem reagir e glicar resíduos de lisina e arginina superficiais de proteínas através da reação de Maillard de aldeídos e aminas primárias (Chevalier F, et al., Nahrung, 46 (2): 58-63 (2002); Humeny A, et al., J Agric Food Chem. 50 (7): 2153- 60 (2002)). A sacarose pode hidrolisar em frutose e glucose sob condições ácidas (Kautz C. F. e Robinson A. L., JACS, 50 (4) 1022-30 (1928)) e, consequentemente, pode causar glicação.

[0070] Em modalidades particulares das presentes composições, um estabilizante (ou uma combinação de estabilizantes) é adicionado a uma formulação de liofilização para prevenir ou reduzir a agregação e degradação química induzidas por liofilização ou induzidas pelo armazenamento. Uma solução nublada ou túrbida após reconstituição indica que a proteína precipitou. O termo “estabilizante” significa um excipiente capaz de prevenir a agregação ou outra degradação física, bem como degradação química (por exemplo, autólise, desamidação, oxidação, etc.) em um estado aquoso e sólido. Estabilizantes convencionalmente empregues em composições farmacêuticas incluem, mas não estão limitados a, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glucose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glucosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCl, compostos de poli- hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrana, amido, amido de hidroxietila, ciclodextrinas, pirrolidina de N-metila, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio, Carpenter et al. (1991), Develop. Biol. Standard 74: 225. Osmólitos

[0071] Os osmólitos correntemente usados como excipientes de formulação de proteínas são listados na Tabela 2. Outros osmólitos comumente encontrados na natureza que podem ser úteis como excipientes incluem taurina, betaína, N-óxido de trimetilamina (TMAO), colina-O-sulfato e sarcosina. Proteínas e polímeros

[0072] Os excipientes à base de proteína adicionam complexidade à formulação, especialmente no desenvolvimento de métodos analíticos para se monitorizar a estabilidade do fármaco ou vacina à base de proteína na presença de um excipiente à base de proteína. Os polímeros têm sido avaliados como excipientes (por exemplo, como agentes de volume) em formulações de proteína liofilizadas. Estando sendo estudadas formulações de liberação controlada de fármacos e vacinas de proteína nas quais as proteínas são formuladas com polímeros tais como poli(ácido láctico-co- glicólico) (PLGA) e polietilenoglicol (PEG). Muitos polímeros solúveis em água adicionais (por exemplo, celulose de hidroxietila (HEC), celulose de carboximetila (CMC)) têm sido utilizados para formulações tópicas de fármacos de proteína.

[0073] O PEG pode estabilizar proteínas por dois mecanismos dependentes da temperatura diferentes. A temperaturas mais baixas é preferencialmente excluído da superfície da proteína mas foi mostrado que interage com a forma desdobrada da proteína a temperatura mais elevada dada a sua natureza anfipática (Lee e Lee (1987), Biochemistry, 26 (24): 7813-9). Pode proteger proteínas através de exclusão preferencial a temperaturas mais baixas mas possivelmente por redução do número de colisões produtivas entre moléculas desdobradas a temperaturas mais elevadas. O PEG é também um crioprotetor e tem sido empregue em Recombinate®, uma formulação liofilizada do Fator Anti-hemofílico recombinante. Antioxidantes

[0074] Muitas fontes diferentes podem oxidar resíduos de proteína. Os danos oxidativos às proteínas podem ser minimizados por controle cuidadoso do processo de fabricação e armazenamento do produto, incluindo tais fatores como oxigênio atmosférico, temperatura, exposição à luz e contaminação química. Onde tais controles são inadequados, excipientes antioxidantes podem ser incluídos na formulação.

[0075] Os excipientes antioxidantes farmacêuticos o mais comumente usados são agentes redutores, removedores de oxigênio/radicais livres ou agentes quelantes. Os antioxidantes em formulações de proteínas terapêuticas têm de ser solúveis em água e permanecer ativos ao longo da vida de prateleira do produto. Os agentes redutores e removedores de oxigênio/radicais livres funcionam por ablação de espécies de oxigênio ativo em solução. Os agentes quelantes (por exemplo, EDTA) podem ser eficazes por ligação de contaminantes de metais vestigiais que promovem a formação de radicais livres. Na formulação líquida de fator de crescimento de fibroblastos ácido, por exemplo, o EDTA inibe a oxidação catalisada por íons de metal de resíduos de cisteína. O EDTA tem sido usado em produtos comercializados como Kineret® e Ontak®. Íons de metal

[0076] Em geral, os íons de metais de transição são indesejados em formulações de proteína porque podem catalisar reações de degradação física e química em proteínas. Íons de metais específicos são incluídos em formulações, no entanto, quando atuam como cofatores para proteínas. Os íons de metal podem ser também usados em formulações em suspensão de proteínas onde formam complexos de coordenação (por exemplo, suspensão em zinco de insulina). Foi proposto que o uso de íons de magnésio (10–120 mM) inibe a isomerização de ácido aspártico em ácido isoaspártico (WO 2004/039337).

[0077] Foi descoberto que os íons de metal conferem estabilidade e/ou atividade aumentada em uma formulação de desoxirriribonuclease (rhDNase, Pulmozyme®). Os íons de Ca+2 (até 100 mM) aumentaram a estabilidade da enzima através de um local de ligação específico (Chen et al. (1999), J Pharm Sci. 88 (4): 477-82). De fato, a remoção de íons de cálcio da solução com EGTA causou um aumento na desamidação e agregação. No entanto, este efeito foi observado somente com íons de Ca+2; foi observado que outros cátions divalentes – Mg+2, Mn+2 e Zn+2 – desestabilizam rhDNase.

[0078] Foram observados efeitos similares na formulação do Fator VIII. Os íons de Ca+2 e Sr+2 estabilizaram a proteína enquanto outros como Mg+2, Mn+2 e Zn+2, Cu+2 e Fe+2 a desestabilizaram (Fatouros, et al. (1997), Int. J. Pharm., 155, 121–131). Em um estudo separado com o Fator VIII foi observado um aumento significativo na taxa de agregação na presença de íons de Al+3 (Derrick et al. (2004), J. Pharm. Sci., 93 (10): 2549-57). Os autores notam que outros excipientes como sais de tampão são frequentemente contaminados com íons de Al+3 e ilustram a necessidade de usar excipientes de qualidade apropriada em produtos formulados. As vacinas contendo picornavírus atenuados vivos ou mortos, tais como Hepatite A e polio, são conformacionalmente estabilizadas por magnésio. Os íons de metal tais como cálcio, magnésio e zinco melhoram a estabilidade da oxitocina em uma solução aquosa. A insulina pode se ligar ao zinco, levando à formação de dímeros e hexâmeros em uma forma cristalina, o que permite a preparação de diferentes formulações com diferentes perfis de liberação in vivo. A estabilidade química e térmica da formulação de insulina em hexâmero varia na presença de diferentes níveis de zinco e fenol. Ligantes específicos

[0079] Uma abordagem para se melhorar a estabilidade conformacional de fármacos terapêuticos de proteína é tirar vantagem dos locais de ligação a ligantes inerentes da proteína. Por exemplo, Pulmozyme® não só requer íons de metal bivalentes para sua atividade enzimática, tem estabilidade conformacional melhorada na presença de íons de cálcio. Ambos os fatores de crescimento de fibroblastos ácidos e básicos (aFGF e bFGF) foram avaliados clinicamente quanto à sua capacidade de promoverem a cura de feridas, e ambas as proteínas se ligam naturalmente às proteoglicanas altamente negativamente carregadas em superfícies das células. Uma variedade de outros compostos altamente negativamente carregados se liga também a e estabiliza dramaticamente aFGF por interação com o local de ligação a poliânions da proteína. Tensoativos

[0080] As moléculas de proteína têm uma elevada propensão a interagirem com superfícies, as tornando suscetíveis à adsorção e desnaturação nas interfaces ar-líquido, frasco- líquido e líquido-líquido (óleo de silicone). Esta via de degradação é inversamente dependente da concentração de proteínas e resulta em agregados de proteínas solúveis ou insolúveis ou na perda de proteína a partir de solução através da adsorção a superfícies. Adicionalmente à adsorção à superfície do recipiente, a degradação induzida pela superfície é exacerbada com agitação física, como seria experienciado durante o transporte e manuseamento.

[0081] Os tensoativos são comumente usados em formulações de proteína para prevenir degradação induzida pela superfície. Os tensoativos são moléculas anfipáticas com a capacidade de superarem as proteínas quanto às posições interfaciais. As porções hidrofóbicas das moléculas de tensoativo ocupam posições interfaciais (por exemplo, ar/líquido), enquanto as porções hidrofílicas das moléculas permanecem orientadas na direção do solvente a granel. A concentrações suficientes (tipicamente em torno da concentração micelar crítica do detergente), uma camada superficial de moléculas de tensoativo serve para prevenir a adsorção de moléculas de proteína na interface. Deste modo, a degradação induzida pela superfície é minimizada.

[0082] Os tensoativos o mais comumente usados são os ésteres de ácidos graxos não iônicos de polietoxilatos de sorbitana--i.e., polissorbato 20 e polissorbato 80 (por exemplo, nos produtos de fármaco Avonex®, Neupogen®, Neulasta®). Os dois diferem somente no comprimento da cadeia alifática que fornece caráter hidrofóbico às moléculas, C- 12 e C-18, respectivamente. O polissorbato 80 é mais ativo à superfície e tem uma concentração micelar crítica mais baixa do que o polissorbato 20. Foi mostrado que ambos os polissorbato 20 e polissorbato 80 protegem contra a agregação induzida por agitação. Os polissorbatos 20 e 80 também protegem contra estresse induzido por congelamento, liofilização e reconstituição. Ambos os polissorbatos 20 e 80 podem conter peróxidos que podem oxidar proteínas e eles próprios podem se degradar por oxidação ou hidrólise com efeitos variáveis na estabilidade da proteína. Pode ser também difícil controlar o nível de polissorbato 20 ou 80 em formulações devido ao seu comportamento complexo durante a filtração por membranas (especialmente a concentrações nas quais os polissorbatos formam micélios em solução). O poloxâmero tensoativo 188 tem sido também usado em vários produtos líquidos comercializados, tais como Gonal-F®, Norditropin® e Ovidrel®. Se acredita geralmente que os tensoativos não iônicos estabilizam as proteínas maioritariamente por superação de moléculas de proteína para superfícies hidrofóbicas (por exemplo, interfaces ar-água), prevenindo deste modo que as proteínas se desdobrem em estas interfaces hidrofóbicas. Os tensoativos não iônicos podem também bloquear as moléculas de proteína de se adsorverem a outras superfícies hidrofóbicas presentes durante o processamento. Adicionalmente, os tensoativos não iônicos podem diretamente interagir com regiões hidrofóbicas em moléculas de proteína. Os anticorpos monoclonais podem afetar a concentração micelar crítica de polissorbato 20 em comparação com tampão sozinho.

[0083] Os detergentes podem também afetar a estabilidade conformacional termodinâmica de proteínas. Aqui novamente, os efeitos de um dado excipiente serão específicos de proteínas. Por exemplo foi mostrado que os polissorbatos reduzem a estabilidade de algumas proteínas e aumentam a estabilidade de outros. A desestabilização de proteínas por detergentes pode ser racionalizada em termos das caudas hidrofóbicas das moléculas de detergente que podem se envolver em ligação específica com estados de proteína parcialmente ou totalmente desdobrados. Estes tipos de interações poderiam causar um desvio no equilíbrio conformacional na direção dos estados de proteína mais expandidos (i.e., aumento da exposição de porções hidrofóbicas da molécula de proteína em complemento ao polissorbato de ligação). Alternativamente, se o estado nativo da proteína exibir algumas superfícies hidrofóbicas, a ligação do detergente ao estado nativo pode estabilizar essa conformação.

[0084] Outro aspecto de polissorbatos é que são inerentemente suscetíveis à degradação oxidativa. Frequentemente, como matérias-primas, contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar oxidação de cadeias laterais de resíduos de proteína, especialmente metionina. O potencial de danos oxidativos tendo origem na adição de estabilizante enfatiza o ponto de que a concentração efetiva mais baixa de excipientes deve ser usada em formulações. Para tensoativos, a concentração efetiva para uma dada proteína dependerá do mecanismo de estabilização. Foi postulado que, se o mecanismo de estabilização do tensoativo estiver relacionado com a prevenção da desnaturação da superfície, então a concentração efetiva será em torno da concentração micelar crítica do detergente. Reciprocamente,

se o mecanismo de estabilização estiver associado a interações proteína-detergente específicas, a concentração efetiva do tensoativo estará relacionada com a concentração de proteína e com a estequiometria da interação (Randolph et al. (2002), Pharm Biotechnol., 13: 159-75).

[0085] Os tensoativos podem ser também adicionados em quantidades apropriadas para prevenir a agregação relacionada com a superfície durante o congelamento e secagem (Chang (1996), J. Pharm. Sci. 85: 1325). Tensoativos exemplificativos incluem tensoativos aniônicos, catiônicos, não iônicos, zwitteriônicos e anfotéricos, incluindo tensoativos derivados de aminoácidos ocorrendo naturalmente. Os tensoativos aniônicos incluem, mas não estão limitados a, lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio, ácido quenodesoxicólico, sal de sódio de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal de sódio do ácido 1-octanossulfônico, hidrato de colato de sódio, desoxicolato de sódio e sal de sódio do ácido glicodesoxicólico. Os tensoativos catiônicos incluem, mas não estão limitados a, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio mono-hidratado e brometo de hexadeciltrimetilamônio. Os tensoativos zwitteriônicos incluem, mas não estão limitados a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 e SB3-12. Os tensoativos não iônicos incluem, mas não estão limitados a, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20 e TWEEN-80. Em outra modalidade, os tensoativos incluem lauromacrogol 400, estearato de polioxila 40, óleo de rícino hidrogenado com polioxietileno

10, 40, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja e outros fosfolipídeos tais como DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácidos graxos de sacarose, celulose de metila e celulose de carboximetila. Sais

[0086] Os sais são frequentemente adicionados para aumentar a força iônica da formulação, o que pode ser importante para a solubilidade, estabilidade física e isotonicidade das proteínas. Os sais podem afetar a estabilidade física de proteínas em uma variedade de modos. Os íons podem estabilizar o estado nativo de proteínas por ligação a resíduos carregados na superfície da proteína. Alternativamente podem estabilizar o estado desnaturado por ligação aos grupos de peptídeo ao longo do esqueleto da proteína (-CONH-). Os sais podem também estabilizar a conformação nativa da proteína por proteção de interações eletrostáticas repulsivas entre resíduos dentro de uma molécula de proteína. Os eletrólitos em formulações de proteínas podem também proteger interações eletrostáticas atraentes entre moléculas de proteínas que podem levar à agregação e insolubilidade de proteínas.

[0087] O efeito do sal na estabilidade e solubilidade das proteínas varia significativamente com as características das espécies iônicas. A série de Hofmeister teve origem nos 1880s como um modo de ordenar os eletrólitos com base na sua capacidade de precipitar as proteínas (Cacace et al. (1997), Quarterly Reviews of Biophysics, 30 (3): 241-277). Em este relatório, a série de Hofmeister é usada para ilustrar uma escala de efeitos de estabilização de proteínas por cossolutos iônicos e não iônicos. Na Tabela C, os cossolutos são ordenados no que diz respeito aos seus efeitos gerais nas proteínas do estado da solução, de estabilizantes (cosmotrópicos) a desestabilizantes (caotrópicos). Em geral, as diferenças nos efeitos entre os ânions são muito maiores do que aquelas observadas para os cátions e, para ambos os tipos, os efeitos são o mais aparentes a concentrações mais elevadas do que são aceitáveis em formulações parenterais. Elevadas concentrações de cosmotrópos (por exemplo, > 1 molar de sulfato de amônio) são comumente usadas para precipitar proteínas a partir da solução por um processo chamado “precipitação por salificação” onde o cosmotrópo é preferencialmente excluído da superfície da proteína reduzindo a solubilidade da proteína em sua conformação nativa (dobrada). A remoção ou diluição do sal devolverá a proteína à solução. O termo “precipitação por salificação” se refere ao uso de íons desestabilizantes (por exemplo, como guanidina e cloreto) que aumentam a solubilidade de proteínas por solvatação das ligações de peptídeo do esqueleto da proteína. Concentrações crescentes do caotrópo favorecerão a conformação do estado desnaturado (desdobrado) da proteína à medida que a solubilidade da cadeia de peptídeo aumenta. A eficácia relativa dos íons para “precipitação por salificação” e “solubilização por salificação” define sua posição na série de Hofmeister.

[0088] Tabela 4: A série de Hofmeister de sais

Cossoluto Escalas de estabilização Ânion Cátion Outros Glicerol/ Estabilizante F- (CH3)4N+ Sorbitol (precipitação por Cosmotrópico salificação) (CH3)2NH Sacarose/ PO4- + Trealose SO4- NH4+ TMAO

CHCO K+ O- Cl- Na+ Br- Cs+ I- Li+ Mg2+ Guanidina Ca2+ Arginina Desestabilizante Caotrópico Ba2+ Ureia (solubilização por salificação)

[0089] De modo a se manter a isotonicidade em uma formulação parenteral, as concentrações de sal estão geralmente limitadas a menos do que 150 mM para combinações de íons monovalentes. Em esta gama de concentrações, o mecanismo de estabilização de sal é provavelmente devido ao rastreamento de forças intramoleculares repulsivas eletrostáticas ou forças intermoleculares atrativas

(rastreamento de Debye-Huckel). Interessantemente foi mostrado que os sais caotrópicos são mais eficazes na estabilização da estrutura da proteína do que concentrações similares de cosmotrópos por este mecanismo. Se acredita que os ânions caotrópicos se ligam mais fortemente do que os íons cosmotrópicos. No que diz respeito à degradação de proteínas covalentes, efeitos diferenciais de força iônica em este mecanismo são esperados através da teoria de Debye- Huckel. Conformemente, relatórios publicados de estabilização de proteínas por cloreto de sódio são acompanhados por aqueles onde o cloreto de sódio acelerou a degradação covalente. Os mecanismos pelos quais os sais afetam a estabilidade de proteínas são específicos de proteínas e podem variar significativamente em função do pH da solução. Um exemplo onde um excipiente pode ser útil na permissão da administração de um fármaco de proteína é aquele de algumas formulações de anticorpo de elevada concentração. Ao longo dos últimos anos foi mostrado que os sais são eficazes na redução da viscosidade de tais formulações (Liu et al. (2005, 2006), J. Pharm Sci., 94 (9): 1928-40, erratum em J Pharm Sci., 95 (1): 234-5. Conservantes

[0090] Os conservantes são necessários quando se desenvolvem formulações parenterais de múltiplas doses que envolvem mais do que uma extração a partir do mesmo recipiente. A sua função primária é inibir o crescimento microbiano e assegurar esterilidade do produtor ao longo da vida de prateleira ou prazo de uso do produto de fármaco.

Conservantes comumente usados incluem álcool de benzila, fenol e m-cresol. Embora os conservantes tenham um longo historial de uso, o desenvolvimento de formulações de proteína que incluem conservantes pode ser desafiante. Os conservantes têm quase sempre um efeito desestabilizante (agregação) nas proteínas, e isto se tornou um grande fator na limitação do seu uso em formulações de proteína de múltiplas doses (Roy et al. (2005), J. Pharm. Sci., 94 (2): 382-96). Foi também mostrado que o álcool de benzila afeta a estrutura e estabilidade de proteínas de uma maneira dependente da concentração, temperatura e tempo. Devido a estes efeitos desestabilizantes, muitas formulações de proteína liofilizadas são reconstituídas com diluente contendo álcool de benzila para minimizar o tempo de contato com a proteína antes da administração.

[0091] A maioria dos fármacos de proteína foi formulada somente para uso único. No entanto, quando formulações de múltiplas doses são possíveis, têm a vantagem adicional de permitirem conveniência ao paciente e comercialização aumentada. Um bom exemplo é aquele do hormônio do crescimento humano (hGH) onde o desenvolvimento de formulações conservadas levou à comercialização de apresentações em caneta de injeção de múltiplas doses, mais convenientes. Pelo menos quatro destes tais dispositivos de caneta contendo formulações conservadas de hGH estão correntemente disponíveis. Norditropin® (líquido), Nutropin AQ® (líquido) & Genotropina (liofilizada – cartucho de câmara dual) contêm fenol enquanto Somatrope® é formulado com m-cresol.

[0092] Vários aspectos necessitam de ser considerados durante o desenvolvimento de formulação de formas de dosagem conservadas. A concentração de conservante eficaz no produto de fármaco tem de ser otimizada. Isto requer teste de um dado conservante na forma de dosagem com gamas de concentração que conferem eficácia antimicrobiana sem comprometer a estabilidade da proteína. Por exemplo, três conservantes foram rastreados com sucesso no desenvolvimento de uma formulação líquida para o receptor de interleucina-1 (Tipo I), usando calorimetria diferencial de varrimento (DSC). Os conservantes foram ordenados com base no seu impacto na estabilidade a concentrações comumente usadas em produtos comercializados (Remmele et al. (1998), Pharm. Res., 15 (2): 200-8).

[0093] Como poderia ser esperado, o desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes é mais desafiante do que formulações liofilizadas. Os produtos criodessecados podem ser liofilizados sem o conservante e reconstituídos com um diluente contendo conservante aquando do uso. Isto encurta o tempo durante o qual que um conservante está em contato com a proteína, minimizando assim significativamente os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, a eficácia e estabilidade do conservante têm de ser mantidas ao longo da vida de prateleira inteira do produto (usualmente cerca de 18-24 meses). Um ponto importante de se notar é que a eficácia do conservante tem de ser demonstrada na formulação final contendo o fármaco ativo e todos os componentes de excipiente.

[0094] Alguns conservantes podem causar reações no local de injeção, que é outro fator que necessita de consideração quando se escolhe um conservante. Em ensaios clínicos que se focaram na avaliação de conservantes e tampões em Norditropin® foi observada que a percepção de dor foi mais pequena em formulações contendo fenol e álcool de benzila em comparação com uma formulação contendo m-cresol (Kappelgaard (2004), Horm. Res. 62 Supl 3: 98-103). Interessantemente, entre o conservante comumente usado, o álcool de benzila possui propriedades anestésicas (Minogue e Sun (2005), Anesth. Analg. 100 (3): 683-6).

EXEMPLOS DE TRABALHO

[0095] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente discutidos e citados aqui são deste modo incorporados por referência nas suas totalidades. É entendido que a invenção divulgada não está limitada à metodologia, protocolos e materiais descritos particulares pois estes podem variar. É também entendido que a terminologia usada aqui é somente para os propósitos de descrição de modalidades particulares e não se destina a limitar o escopo das reivindicações anexas.

[0096] Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descritas aqui. Tais equivalentes se destinam a estar englobados pelas reivindicações que se seguem.

EXEMPLO 1

[0097] Esta experiência demonstra que, por ajuste dos alvos de peso de enchimento, a concentração de proteína pode ser precisamente visada para o respectivo produto de fármaco reconstituído. Materiais • Tampão contendo: Manitol, Sacarose, L-Histidina, Polissorbato 20 a pH 5 • Frasco Recipiente, 3 cc, Contrassopro, Vidro Tipo I, Não tratado, Acabamento de 13 mm com Tampa, 13 mm, 4432/50 V-50, • romiplostim Filtrada Purificada a Granel Método

1. Diluir fármaco até formulação de produto alvo (0,5 mg/mL) utilizando quantidade requerida do tampão de diluição.

2. Filtrar solução formulada usando um filtro de Difluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm.

3. Assegurar que fracos e tampa: frascos de 3 cc foram lavados e despirogenados.

4. Encher quantidade suficiente de frascos para respectivos alvos de peso de enchimento: 0,307, 0,322, 0,342, 0,357, 0,373 g.

5. Tapar parcialmente frascos e colocar em liofilizador.

6. Operar ciclo de liofilização requerido com congelamento adequado, vácuo, com secagem primária e secundária, seguido por retirada da tampa e descarga do produto liofilizado em frascos selados.

7. Reconstituir produto com volume de reconstituição definido de 0,32 mL de água para injeção.

8. Medir concentração de proteína resultante em frascos utilizando absorção de ultravioleta (UV). A absorvância é definida como a quantidade de luz de um comprimento de onda específico que é absorvida à medida que passa através de um analito. A Unidade de Absorvância é uma função da absorvância intrínseca da molécula, sua concentração e do comprimento de caminho do analito. Os aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano em moléculas de proteína absorvem luz na gama de UV de 260–290 nm. A absorção de UV em esta gama é usada rotineiramente para se medir a presença de proteína em uma solução.

9. Medir a osmolalidade do produto utilizando depressão do ponto de congelamento.

10. Realizar análise para se determinar o efeito de alvos de peso de enchimento ajustados para tanto proteína como osmolalidade.

[0098] Tabela 5: Sumário de pesos de enchimento e concentração de proteína Parâmetros Condições

A B C D E experimentais Concentração a granel 0,528 0,528 0,528 0,528 0,528 formulada (mg/mL) Entrada Peso de enchimento 0,307 0,322 0,342 0,357 0,373 médio (g)

Concentração de Saída proteína média pós- 0,459 0,484 0,518 0,546 0,565 reconstituição (mg/mL)

[0099] Foi observada uma relação linear forte entre concentração de proteína reconstituída e volume de enchimento como evidenciado pelo R2 de 0,9964 como mostrado na Figura 6. Esta relação linear pode ser explicada teoricamente com base no equilíbrio de massa de proteína, como mostrado em baixo: [Equação 1] [Equação 2]

[00100] Onde Creconstituição é a concentração de proteína pós- reconstituição, Vreconstituição é o volume de produto pós- reconstituição, Cformulada é a concentração de proteína a granel formulada, Cperda é a perda de proteína devido à ligação ao filtro e recipientes e Venchimento é o volume de enchimento em cada frasco. Uma vez que a concentração a granel formulada, a perda de ligação da proteína e o volume de reconstituição são constantes em uma dada operação, a concentração de proteína pós-reconstituição é proporcional ao volume de enchimento como indicado na Equação 2.

[00101] Na experiência à escala piloto, a variabilidade da concentração final de proteína do produto de fármaco (DP) reconstituído foi determinada usando 10 réplicas em cada condição de enchimento, como mostrado na Tabela 6. Portanto, a variabilidade observada representa a variabilidade tanto do processo como analítica, incluindo a variabilidade associada à reconstituição do produto.

[00102] Tabela 6: Variabilidade da concentração de proteína (reconstituída) sob cada condição de enchimento

A B C D E (-10%) (-5%) (Alvo) (+5%) (+10%) Número de réplicas 10 10 10 10 10 Média (mg/mL) 0,459 0,484 0,518 0,546 0,565 Desvio médio (SD, mg/mL) 0,0084 0,0133 0,0082 0,0052 0,0069 SD relativo (%) 1,83 2,76 1,58 0,94 1,23 Impacto do peso de enchimento na osmolalidade (DP Reconstituído)

[00103] A osmolalidade final do produto de fármaco após reconstituição foi testada quanto à osmolalidade, para frascos cheios a cinco alvos de peso de enchimento. Os resultados de osmolalidade antes do enchimento e pós- reconstituição são resumidos na Tabela 7. A osmolalidade não muda pós-enchimento e reconstituição com base nos resultados ao peso de enchimento alvo de 0,341 gramas, indicando que os excipientes não foram perdidos em quantidades apreciáveis. A osmolalidade aumenta ligeiramente a volumes de enchimento mais elevados e diminui ligeiramente a volumes de enchimento mais baixos quando o volume de reconstituição é mantido constante.

[00104] Tabela 7: Sumário de Pesos de enchimento e Osmolalidade Parâmetros A B C D E Osmolalidade a granel formulada 312,4 312,4 312,4 312,4 312,4 (mOsm/kg)* Peso de enchimento 0,307 0,322 0,342 0,357 0,373 Entrada médio (g) Volume de enchimento 0,301 0,316 0,336 0,350 0,366 médio (mL) Volume normalizado 89,9% 94,3% 100,2% 104,6% 109,3% (%) Volume efetivo pós- 0,335 0,335 0,335 0,335 0,335 reconstituição (mL) Osmolalidade média Saída pós-reconstituição 280 294 313 327 342 (mOsm/kg) Osmolalidade 89,6% 94,0% 100,0% 104,6% 109,3% normalizada (%)

[00105] Foi descoberta uma relação linear se o peso/volume de enchimento (normalizado com base no alvo de 0,341 g) for representado graficamente versus a osmolalidade do produto (normalizada com base na osmolalidade alvo de 313 mOsm/kg ao peso de enchimento alvo), como mostrado na Figura 7. Esta relação linear pode ser explicada pela definição de osmolalidade e sua relação com concentração de componente de tampão.

[00106] A osmolalidade é uma medida da concentração de soluto, definida como o número de osmoles (Osm) de soluto por quilograma de solvente (osmol/kg ou Osm/kg). Distinta de molaridade (mole/L), a osmolalidade mede moles de partículas de soluto (tal como íon dissociado) ao invés de moles de soluto. A osmolalidade de uma solução pode ser calculada a partir da seguinte expressão: [Equação 3] Onde φ é o coeficiente osmótico, n é o número de partículas (por exemplo, íons) nas quais uma molécula se dissocia e C é a concentração molar (mole/L) do soluto.

[00107] No caso quando o peso (ou volume) de enchimento é 10% mais elevado do que o volume alvo, a concentração de cada espécie de excipiente na formulação é aumentada em 10% após reconstituição até volume constante. Uma vez que φi e ni são constantes em uma formulação conhecida, aumento de 10% na concentração de cada espécie resulta em aumento de 10% na osmolalidade como mostrado na Equação 3. Similarmente, diminuição de 10% do volume de enchimento resulta em diminuição de 10% na concentração de excipiente e, consequentemente, diminuição de 10% na osmolalidade. EXEMPLO 2

[00108] A proteína blinatumomab tem 55 μg/mL formulados até 200 mM de L-lisina-HCl, 25 mM de ácido cítrico, 15% (p/v) de trealose di-hidratada, 0,1% (p/v) de polissorbato 80, pH 7,0. A gama permissível de proteína formulada é medida na etapa a granel filtrada. São usadas concentrações a granel variando de 48,0 μg/mL a 65,0 μg/mL. Os pesos de enchimento alvo são calculados com base na concentração de proteína medida para visar um produto de fármaco reconstituído de 12,5 mcg/mL quando reconstituído com 3 mL de água.

Onde

[00109] Depois, o conteúdo de proteína Alvo pode ser depois multiplicado pela densidade do produto e dividido pela concentração de fármaco medida (ajustada quanto à perda devido à ligação se necessário) para se determinar o peso de enchimento Alvo.

[00110] O peso de enchimento alvo é calculado de acordo com a seguinte fórmula, com uma gama de pesos de enchimento correspondente de 0,634 a 0,858 gm.

em que DS é geralmente entendido pelos peritos na técnica como se referindo à substância de fármaco. Afirmado mais geralmente, (dose fixa alvo da proteína terapêutica) x (densidade) peso de enchimento ajustado = ---------------------------------------- concentração de proteína terapêutica em formulação a granel. EXEMPLO 3

[00111] O produto de fármaco infliximab tem 20 ± 1,5 mg/mL de infliximab, formulado com 10 mM de fosfato de sódio, 10% (p/v) de sacarose, 0,01% (p/v) de polissorbato 80, pH 7,2 pós-reconstituição com 10 mL de Água para Injeção.

[00112] O peso de enchimento alvo é calculado de acordo com a seguinte fórmula, com uma gama de pesos de enchimento correspondente de 4,85 a 5,63 gm. Cálculo de peso de enchimento alvo EXEMPLO 4

[00113] O trastuzumab tem 21 mg/mL formulados com L- Histidina a 0,303 mg/mL, Hidrocloreto de L-Histidina Mono- hidratado a 0,470 mg/mL, α,α-Trealose Di-hidratada a 19,1 mg/mL, Polissorbato 20 a 0,0840 mg/mL, a pH 6,1. O peso de enchimento alvo é calculado de acordo com a fórmula em baixo, com gamas de pesos de enchimento variáveis baseadas nos requisitos de administração de produto. Os alvos de peso de enchimento variam de 3,1 a 21,2 gm (dependendo da respectiva apresentação). Este produto tem múltiplas apresentações com uma concentração de substância de fármaco agrupada de 21 mg/mL.

[00114] O peso de enchimento alvo para cada lote de produto de fármaco para este Exemplo 4 e os exemplos subsequentes é calculado usando a seguinte informação:

[00115] Como um exemplo, o peso de enchimento alvo para uma apresentação de 150 mg [g]

[00116] Como outro exemplo, o peso de enchimento alvo para uma apresentação de 420 mg [g]

[00117] Como um exemplo adicional, o peso de enchimento alvo para uma apresentação de 60 mg [g] EXEMPLO 5

[00118] O AMG 701 é um construto de anticorpo anti- BCMA/anti-CD3 Envolvedor de células T Biespecífico (BiTE®) de domínio variável, cadeia única (ver NCI Drug Dictionary e outras referências). O AMG 701 com concentração de proteína a 1 mg/mL foi formulado com 10 mM, de ácido L-glutâmico, 9,0% (p/v) de sacarose, 0,010% (p/v) de polissorbato 80, a pH 4,2. O peso de enchimento alvo é calculado de acordo com a fórmula em baixo, com gamas de pesos de enchimento variáveis baseadas nos requisitos de administração de produto. O AMG 701 tem três apresentações, com os alvos de peso de enchimento variando para a primeira apresentação de 0,47 a 0,57 gm, a segunda apresentação de 1,60 a 1,96 gm e a terceira apresentação de 3,28 a 4,01 gm.

[00119] Para a primeira apresentação:

[00120] Para a segunda apresentação:

[00121] Para a terceira apresentação: EXEMPLO 6

[00122] O AMG 330 é um Envolvedor de células T Biespecífico (BiTE®) de domínio variável, cadeia única anti-CD33/anti-CD3 (ver NCI Drug Dictionary e outras referências). O AMG 300 com concentração de proteína a 0,5 mg/mL foi formulado com 10 mM de fosfato de potássio, 8,0% (p/v) de sacarose, 1,0% (p/v) de betaciclodextrina de sulfobutiléter (SBE-CD), 0,010% (p/v) de polissorbato 80 a pH 6,1. O peso de enchimento alvo é calculado de acordo com a fórmula em baixo, com gamas de pesos de enchimento variáveis baseadas nos requisitos de administração de produto. Os alvos de peso de enchimento variam de 1,2 a 1,5 gm. O peso de enchimento alvo é calculado como se segue:

[00123] Em geral, a metodologia pode ser usada no caso onde uma quantidade alvo de produto é requerida no recipiente para assegura que o produto pós-reconstituição esteja à concentração necessária. Este resultado é alcançado por determinação da quantidade de volume do produto reconstituído; por exemplo, volume de 1 mL com uma concentração desejada de 1 mg/mL de proteína terapêutica, levando a uma quantidade total de conteúdo de proteína requerido de 1 mg.

Conteúdo de proteína alvo [mg] = (Concentração de proteína [mg/mL] x Volume reconstituído [mL])

[00124] O conteúdo de proteína alvo é depois usado para se calcular o peso de enchimento alvo baseado na fórmula em baixo. A concentração de fármaco no processo ou medida é tipicamente medida como parte do processo de formulação para compensar quanto a qualquer variabilidade do processo. Em alguns casos é feito um ajuste ao conteúdo de proteína alvo para compensar quanto à perda de produto devido à ligação. É requerida confiança na concentração de fármaco medida para assegurar direcionamento preciso dos pesos de enchimento.

[00125] Este é um exemplo específico pois o produto terapêutico tanto para a concentração no processo como para o produto reconstituído pode variar de microgramas (mcg ou µg) por mililitro (mL) a miligramas (mg) por mililitro (mL).

[00126] É requerida verificação da osmolalidade, como discutido acima (com base em descobertas experimentais). São estabelecidas limitações na concentração de fármaco medida permitida em combinação com os alvos de peso de enchimento para se alcançar a quantidade requerida de fármaco ativo cheio no recipiente para proporcionar garantia de que o produto reconstituído cumpra tanto a concentração de produto (fármaco ou proteína ativo) bem como os limites de especificação de osmolalidade.

[00127] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente discutidos e citados aqui são deste modo incorporados por referência nas suas totalidades. É entendido que a invenção divulgada não está limitada à metodologia, protocolos e materiais descritos particulares pois estes podem variar. É também entendido que a terminologia usada aqui é somente para os propósitos de descrição de modalidades particulares e não se destina a limitar o escopo das reivindicações anexas.

[00128] Os peritos na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descritas aqui. Tais equivalentes se destinam a estar englobados pelas reivindicações que se seguem.

Claims

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Processo para preparação de uma formulação farmacêutica liofilizada de uma proteína terapêutica, caracterizado pelo fato de que compreende: a. proporcionar uma formulação de uma quantidade a granel da proteína terapêutica, b. medição da concentração da proteína terapêutica na referida formulação a granel, c. ajuste do peso de enchimento da proteína na referida formulação a granel para se alcançar uma dose fixa da proteína e d. liofilização da formulação ajustada quanto ao peso de enchimento da proteína para se alcançar uma formulação final em um recipiente em que a concentração de produto pós-reconstituição com um volume fixo está dentro de uma gama de aceitação predeterminada e em que o peso de enchimento ajustado da proteína é calculado de acordo com a fórmula (dose fixa alvo da proteína terapêutica) x (densidade) peso de enchimento ajustado = ----------------------------------------- concentração de proteína terapêutica em formulação a granel.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de proteína na formulação final é menor ou igual a cerca de 20 mg/mL.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é selecionada de romiplostim, blinatumomab, infliximab, trastuzumab, AMG 701 e AMG 330.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é romiplostim e a concentração de proteína terapêutica na formulação final é cerca de 0,5 mg/mL.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação final compreende cerca de 0,5 mg/mL de romiplostim em cerca de 10 mM de histidina, cerca de 4% p/v de manitol, cerca de 2% p/v de sacarose e cerca de 0,004% de polissorbato 20 a cerca de pH 5,0.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é blinatumomab e a concentração de proteína terapêutica na formulação final é cerca de 55 μg/mL.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende cerca de 55 μg/mL de blinatumomab em cerca de 25 mM de ácido cítrico mono- hidratado, cerca de 15% (p/v) de trealose, cerca de 200 mM de hidrocloreto de L-lisina e cerca de 0,1% (p/v) de polissorbato 80 a cerca de pH 7,0.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é infliximab e a concentração de proteína terapêutica na formulação final é cerca de 20 ± 1,5 mg/mL.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação final compreende cerca de 20 ± 1,5 mg/mL de infliximab, cerca de 10 mM de fosfato de sódio, cerca de 10% (p/v) de sacarose e cerca de 0,01% (p/v) de polissorbato 80 a cerca de pH 7,2.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é trastuzumab e a concentração de proteína terapêutica na formulação final é cerca de 21 mg/mL.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação final compreende cerca de 21 mg/mL de trastuzumab, cerca de 0,303 mg/mL de L-histidina, cerca de 0,470 mg/mL de hidrocloreto de L-histidina mono-hidratado, cerca de 19,1 mg/mL de α,α-trealose di-hidratada e cerca de 0,0840 mg/mL de polissorbato 20 a cerca de pH 6,1.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é AMG 701 e a concentração de proteína terapêutica na formulação final é cerca de 1 mg/mL.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação final compreende cerca de 1 mg/mL de AMG 701, cerca de 10 mM de ácido L-glutâmico, cerca de 9,0% (p/v) de sacarose e cerca de 0,010% (p/v) de polissorbato 80 a cerca de pH 4,2.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é AMG 330 e a concentração de proteína terapêutica na formulação final é cerca de 0,5 mg/mL.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação final compreende cerca de 0,5 mg/mL de AMG 330, cerca de 10 mM de fosfato de potássio, cerca de 8,0% (p/v) de sacarose, cerca de 1,0% (p/v) de betaciclodextrina de sulfobutiléter (SBE-CD) e cerca de 0,010% (p/v) de polissorbato 80 a cerca de pH 6,1.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de proteína na formulação final é menor ou igual a cerca de 25 mg/mL.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é um construto de anticorpo de cadeia única biespecífico.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é selecionada de AMG 701 e AMG 330.