TW202332462A - Il-15突變體融合蛋白藥物組合物 - Google Patents

Il-15突變體融合蛋白藥物組合物 Download PDF

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Abstract

本發明關於一種IL-15突變體融合蛋白製劑。具體地，本發明提供一種IL-15突變體融合蛋白藥物組合物，所述的組合物包括IL-15突變體融合蛋白、緩衝液、蛋白穩定劑和表面活性劑。本發明所述的藥物組合物能夠在產品長期貯存和運輸過程中維持IL-15突變體融合蛋白的穩定性，進而保證藥品的穩定性、安全性和有效性。

Description

IL-15突變體融合蛋白藥物組合物
本發明關於藥物製劑領域，具體而言，關於一種包含IL-15突變體融合蛋白的藥物組合物。
大分子蛋白類藥物（如抗體等）的製劑通常為注射劑，適合於非經腸道給藥，其給藥方式通常包括皮下、靜脈、肌內等。由於蛋白質在溶液中較不穩定，非常容易形成顆粒和聚集等，穩定性成為大分子蛋白類藥物開發的一個難題。因此，開發大分子蛋白類藥物（如抗體等）的製劑首先需要解決蛋白的穩定性問題。
本發明提供IL-15突變體融合蛋白的液體製劑和凍乾製劑，本發明所述製劑可以在產品長期貯存和運輸過程中維持IL-15突變體融合蛋白的穩定性，進而保證藥品的穩定性、安全性和有效性。
在第一個態樣，本發明揭示提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含IL-15突變體融合蛋白、緩衝液、蛋白穩定劑和表面活性劑。
在一個實施方案中，IL-15突變體融合蛋白包含IL-15突變體、與IL-15突變體融合的免疫球蛋白分子或其部分，和/或IL-15Rα。
在一個實施方案中，IL-15突變體包含對應於野生型IL-15的Asp8、Ile6、Val3和His105的一個或複數個胺基酸殘基處的突變。
在一個實施方案中，所述突變是替換、插入或缺失。
在一個具體實施方案中，所述突變選自以下群組的胺基酸替換：Asp8Ser（D8S）、Asp8Gly（D8G）、Asp8 Glu（D8E）、Val3Leu（V3L）、Ile6Asp（I6D）、和/或His105Lys（H105K）。
在一個具體實施方案中，所述IL-15突變體包含下述突變或突變組合：（1）Asp8Ser；（2）Asp8Gly；（3）His105 Lys；（4）Asp8Glu和Val3Leu；（5）Val3Leu和Ile6Asp；或，（6）Asp8Ser和His105Lys。
在一個具體實施方案中，所述IL-15突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示；所述野生型IL-15的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在另一個實施方案中，所述的IL-15突變體融合蛋白中的各結構域的連接順序自N端至C端為： （1）免疫球蛋白分子或其部分、IL-15Rα、IL-15突變體；（2）免疫球蛋白分子或其部分、IL-15突變體、IL-15Rα；（3）IL-15突變體、IL-15Rα、免疫球蛋白分子或其部分；（4）IL-15Rα、IL-15突變體、免疫球蛋白分子或其部分；（5）IL-15突變體、免疫球蛋白分子或其部分；（6）免疫球蛋白分子或其部分、IL-15 Rα；（7）IL-15Rα、免疫球蛋白分子或其部分；（8）IL-15突變體、IL-15Rα；或，（9）IL-15Rα、IL-15突變體； 較佳的，當IL-15Rα或IL-15突變體與免疫球蛋白分子融合時，融合於免疫球蛋白分子重鏈可變區的N端或免疫球蛋白Fc區的C端；當IL-15Rα或IL-15突變體與免疫球蛋白Fc區融合時，融合於免疫球蛋白Fc區的N端或C端。
在另一個實施方案中，所述的IL-15突變體透過或不透過連接胜肽與免疫球蛋白分子或其部分融合，或IL-15突變體透過或不透過連接胜肽與IL-15Rα融合；較佳使用連接胜肽；較佳使用SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.14 、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示連接胜肽； 較佳的，IL-15突變體透過或不透過連接胜肽與IL-15Rα融合，再與免疫球蛋白分子或其部分融合；較佳使用連接胜肽；較佳使用SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示連接胜肽。
在一個具體實施方案中，所述免疫球蛋白分子為抗PD-L1的抗體或抗原結合片段；所述免疫球蛋白分子部分為免疫球蛋白Fc區； 較佳的，所述抗PD-L1的抗體或抗原結合片段選自Tecentriq、KN-035或794-h1-71； 較佳的，所述抗PD-L1抗體重鏈具有SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20所示序列，所述輕鏈具有SEQ ID NO: 21所示序列； 較佳的，所述免疫球蛋白Fc區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一的Fc區；較佳包含人或鼠抗體IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區的序列；較佳的，所述免疫球蛋白Fc區的胺基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一個具體實施方案中，所述的IL-15突變體融合蛋白包含： （1）包含所述抗PD-L1抗體的重鏈的，分別具有如SEQ ID NO：22、23、24、25或26所示序列的單體一；具有如SEQ ID NO：21所示序列的抗PD-L1抗體的輕鏈； （2）與上述（1） 所示序列具有至少 90%同一性的胺基酸序列，較佳為至少 91%、 92%、93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%同一性。
在另一個實施方案中，所述IL-15突變體融合蛋白的濃度為1 mg/ml至100 mg/ml，較佳為25-95 mg/mL，更佳為50 mg/mL或25 mg/mL。
在另一個實施方案中，所述的緩衝液選自醋酸-醋酸鈉緩衝液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，較佳為醋酸-醋酸鈉緩衝液或組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液。
在一個具體的實施方案中，所述的緩衝液濃度為10-100 mM，較佳為15-30 mM，更佳為20 mM。
在另一個實施方案中，所述的蛋白穩定劑選自氯化鈉、甘胺酸、鹽酸精胺酸、蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇，較佳為蔗糖和海藻糖。
在一個具體的實施方案中，所述的蛋白穩定劑的濃度為1-10%(w/v)，較佳為2%(w/v)、4.5%(w/v)或8%(w/v)，更佳為8%(w/v)。
在另一個實施方案中，所述的表面活性劑選自聚山梨酯、泊洛沙姆、甘油脂肪酸酯，較佳為聚山梨酯80或泊洛沙姆188。
在一個具體的實施方案中，所述的表面活性劑的濃度為0.01~0.1 %(w/v)，較佳為0.02%(w/v)、0.04%(w/v)、0.06%(w/v)或0.08 %(w/v)。
在另一個實施方案中，所述的藥物組合物的pH約為4.5-7.5，較佳為4.5-6.5，更佳為4.5、5、6。
在第二個態樣，本發明揭示提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含： a)濃度為1 mg/ml至100 mg/ml 的IL-15突變體融合蛋白，b)濃度為10-100 mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH為4.5-7.5，c)濃度為1-10%(w/v)的海藻糖，和d)濃度為0.01~0.1%(w/v)的泊洛沙姆； 較佳的，所述的藥物組合物包含：a)濃度為25 mg/ml至95 mg/ml的IL-15突變體融合蛋白，b)濃度為15-30 mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH為5.5-6.5，c)濃度為2-8%(w/v)的海藻糖，和d)濃度為0.04 %(w/v)的泊洛沙姆188； 較佳的，所述藥物組合物為液體形式或凍乾粉製劑。
在第三個態樣，本發明揭示提供了一種製備藥物組合物的方法，包括將IL-15突變體融合蛋白溶液經過緩衝液置換的步驟，所述的緩衝液較佳為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，所述緩衝液濃度較佳為20 mM，所述緩衝液的pH較佳為6； 較佳的，製備方法進一步包括冷凍乾燥的步驟； 更佳的，冷凍乾燥步驟包括：（1）將真空冷凍乾燥機的乾燥箱降溫到-45℃，保持3~5小時；（2）將乾燥箱溫度上升至-5℃，保持3~5小時；（3）將乾燥箱溫度降溫至-45℃，保持3~5小時；在步驟（1）-（3）預凍過程中，保持升溫降溫速率為0.5℃~1℃/分鐘；（4）一次乾燥真空度為0.1 mBar，溫度保持在-30~-20℃，該步驟總體時間應大於30小時；（5）一次乾燥後以0.1~0.3℃/分鐘的升溫速率升溫到25℃開始解析乾燥，保持真空度0.1 mBar，保持1~2小時，然後極限真空，保持溫度不變，保持時間大於15小時。
在第四個態樣，本發明揭示提供了一種含IL-15突變體融合蛋白的藥物組合物，所述藥物組合物透過第三個態樣所述的方法製備獲得。
在第五個態樣，本發明揭示提供了一種含IL-15突變體融合蛋白的凍乾製劑，所述製劑透過將第一至第二個態樣所述的藥物組合物經冷凍乾燥獲得。
在第六個態樣，本發明揭示提供了一種含IL-15突變體融合蛋白的複溶溶液，所述複溶溶液是透過將第五個態樣所述的凍乾製劑經複溶製備獲得。
在第七個態樣，本發明揭示提供了前述第一至第二個態樣所述的藥物組合物，第三個態樣所述方法製備的產品，第四個態樣所述的藥物組合物，第五個態樣所述的凍乾製劑，或第六個態樣所述的複溶溶液在製備預防和/或治療個體中的疾病的藥物中的用途；所述疾病較佳為腫瘤或發炎疾病；較佳的，所述腫瘤選自膠質母細胞瘤，前列腺癌，血液癌，B細胞腫瘤，多發性骨髓瘤，B細胞淋巴瘤，B細胞非何杰金淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病，急性骨髓性白血病，皮膚T細胞淋巴瘤，T細胞淋巴瘤，實體瘤，尿路上皮/膀胱癌，黑色素瘤，肺癌，腎細胞癌，乳腺癌，胃癌和食道癌，前列腺癌，胰腺癌，結腸直腸癌，卵巢癌，非小細胞肺癌和鱗狀細胞頭頸癌。
在第八個態樣，本發明揭示提供了一種預防和/或治療個體中的疾病的方法，包含向有此需要的患者施用前述第一至第二個態樣所述的藥物組合物，第三個態樣所述方法製備的產品，第四個態樣所述的藥物組合物，第五個態樣所述的凍乾製劑，或第六個態樣所述的複溶溶液；所述疾病較佳為腫瘤或發炎疾病；較佳的，所述腫瘤選自膠質母細胞瘤，前列腺癌，血液癌，B細胞腫瘤，多發性骨髓瘤，B細胞淋巴瘤，B細胞非何杰金淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病，急性骨髓性白血病，皮膚T細胞淋巴瘤，T細胞淋巴瘤，實體瘤，尿路上皮/膀胱癌，黑色素瘤，肺癌，腎細胞癌，乳腺癌，胃癌和食道癌，前列腺癌，胰腺癌，結腸直腸癌，卵巢癌，非小細胞肺癌和鱗狀細胞頭頸癌。
相關申請案的交叉引用： 本申請案請求以下2件中國發明專利申請的權益和優先權，在此將它們的全部內容以援引的方式整體併入本文中：2021年11月18日向中國國家知識產權局提交的第202111375146.0號專利申請案；以及2021年11月22日向中國國家知識產權局提交的第202111384988.2號專利申請案。
術語定義和說明
除非另外說明，本文所用術語具有所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。對於本文中明確定義的術語，則該術語的含義以所述定義為準。
如本文所用，術語「抗體」（Ab）是指與目標抗原特異性結合或具有免疫反應性的免疫球蛋白分子，包括抗體的多株、單株、基因工程化和其他修飾形式（包括但不限於嵌合抗體，人源化抗體，全人源抗體，異源耦合抗體（例如雙特異性、三特異性和四特異性抗體，雙抗體，三抗體和四抗體），抗體共軛物）以及抗體的抗原結合片段（包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段）。此外，除非另有說明，否則術語「單株抗體」（mAb）意指包括能夠特異性結合標靶蛋白的完整抗體分子以及不完整的抗體片段（例如Fab和F(ab’)2片段，它們缺少完整抗體的Fc片段（從動物循環中更快地清除），因此缺乏Fc介導的效應功能（effector function）（參見Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316,1983；其內容援引加入本文）。
如本文所用，術語「IL-15」或「IL15」，白細胞介素15（interleukin-15，IL-15）是一種多效性細胞激素，具有活化T細胞、B細胞和NK細胞，並可介導這些細胞的增殖和存活的功能。此外，IL-15能活化、維持和擴增CD8 +記憶性T細胞。本發明所述的「IL-15」或「IL-15胜肽段」 或「IL-15多胜肽」可以是任何IL-15(白介素15)或其突變體，如人IL-15或非人哺乳動物IL-15或非哺乳動物IL-15。示例性非人哺乳動物如豬、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳動物如雞等。較佳地，人的白介素15成熟分子，見資料庫UniProtKB，登錄號P40933，49-162aa。
如本文所用，術語「IL-15野生型」或「野生型IL-15」是指，天然來源的人IL-15或非人哺乳動物IL-15或非哺乳動物IL-15；也可以代表本領域已經通用的IL-15多胜肽，野生型也可表示為WT或wt，較佳地，「IL-15野生型」或「野生型IL-15」其胺基酸序列為(SEQ ID NO.1) NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
如本文所用，術語「IL-15突變體」是指，透過一個或複數個胺基酸替換、增加或者缺失突變獲得的對IL-15與其受體間親合力提高或者降低，或其刺激特定細胞株，T細胞或者NK細胞增殖活性、細胞激素釋放的活性增加或者降低的突變體分子；
在本揭示內容中，在其中一個較佳實施例中「IL-15突變體」分別具有如下所示的胺基酸序列： IL-15突變體#1(D8S)胺基酸序列(SEQ ID NO.2)：NWVNVISSLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS； IL-15突變體#2(H105K)胺基酸序列(SEQ ID NO.3)：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVKIVQMFINTS； IL-15突變體#3(D8G)胺基酸序列(SEQ ID NO.4)：NWVNVISGLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS； IL-15突變體#6(D8S/H105K)胺基酸序列(SEQ ID NO.5)：NWVNVISSLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVKIVQMFINTS； IL-15突變體#7（D8E/V3L）胺基酸序列(SEQ ID NO.6)： NWLNVISELKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS； IL-15突變體#8(V3L/I6D)胺基酸序列(SEQ ID NO.7)： NWLNVDSDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
如本文所用，術語「IL-15Rα」可以是任何物種的IL-15Rα或者其功能性片段，如人IL-15Rα或非人哺乳動物IL-15Rα或非哺乳動物IL-15Rα。示例性非人哺乳動物如豬、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳動物如雞等。較佳為人的IL-15Rα；較佳為人的白介素15受體α胞外域片段，簡稱IL-15Rα ECD。
本發明中術語「IL-15Rα變體」指在IL-15Rα上透過一個或者複數個胺基酸缺失、插入或替換突變形成的具有與其配體分子如IL15的結合能力的功能性突變體，較佳為人的IL15Rα分子，更佳為人的IL-15Rα胞外域片段的縮短形式，即從胞外域片段C端開始透過一個或複數個胺基酸缺失突變所得的具有人白介素15受體α活性的分子，較佳為保留65-120個胺基酸的缺失突變形式，更佳為保留65-102個胺基酸的缺失突變縮短形式，比如IL-15Rα-sushi ；較佳為IL-15Rα-sushi，其胺基酸序列分別為： IL-15Rα-sushi-1（SEQ ID NO.8）： CPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP。 IL-15Rα-sushi-2：（SEQ ID NO.9）： CPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR。 IL-15Rα-sushi-3：（SEQ ID NO.10）： ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP。 IL-15Rα-sushi-4：（SEQ ID NO.11）： ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR。
本發明中術語「免疫球蛋白Fc區」是指，免疫球蛋白鏈恆定區，特別是免疫球蛋白重鏈恆定區的羧基端或其中的一部分，無抗原結合活性，是抗體分子與作用分子和細胞相互作用的部位。本發明所述「免疫球蛋白Fc區」可以是任何Fc或其變體，來源於人或非人哺乳動物。例如，免疫球蛋白Fc區可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個或更多結構域與免疫球蛋白鉸鏈區的組合。Fc可以來源於不同的種屬，較佳為人的免疫球蛋白。根據重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類，主要有5類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2。「Fc區」較佳包括至少一個免疫球蛋白絞鏈區，以及IgG的CH2和CH3結構域。更佳包括IgG1的一個CH2結構域，一個CH3結構域和一個免疫球蛋白絞鏈區，鉸鏈區起始胺基酸位置可以變動。
在本揭示內容中，在其中一個較佳實施例中「免疫球蛋白Fc區」具有如下所示胺基酸序列： SEQ ID NO.12： EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
如本文所用，術語「胜肽接頭/連接胜肽(Linker)」是指，在本發明中用於連接IL-15與另一蛋白分子或蛋白片段，以保證蛋白的正確折疊和穩定性的胜肽。所述另一分子包括不限於IL-15Rα、Fc、Fc變體、抗體等。本發明的「連接胜肽」較佳為(GGGGS)n，其中n可以為0、1、2、3、4、5或者更多，較佳n為2-4；或較佳為SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ。如果連接胜肽序列太短，可能影響兩蛋白高級結構的折疊，從而相互干擾；如果連接胜肽序列太長，又涉及免疫原性的問題，因為連接胜肽序列本身就是新的抗原；
在本揭示內容中，在其中一個較佳實施例中「胜肽接頭/連接胜肽(Linker)」其分別具有如下所示胺基酸序列： SEQ ID NO.13：SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ； SEQ ID NO.14：GGGGSGGGGSGGGGS ； SEQ ID NO.15：EF； SEQ ID NO.16：SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ。
在本揭示內容中，在其中較佳實施例中，較佳的抗體重鏈和抗體輕鏈來源於抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體；更佳來源於人源化的抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體；如本文所用，術語「PD-L1」是指程序性死亡配體-1，也稱為 CD279（分化簇 279），是一種重要的免疫抑制分子，所述PD-L1較佳的是人PD-L1；
在本揭示內容中，在其中一個較佳實施例中「抗PD-L1抗體」其分別具有如下所示胺基酸序列： PD-L1-1重鏈 SEQ ID NO.17： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK； PD-L1-1輕鏈 SEQ ID NO.18： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC； PD-L1-2-1重鏈 SEQ ID NO.19： QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRKFPSRGLEYMGYISYSGSTYYNPFLKSRISINRDTSKNQYYLQLNSVTPEDTAVYYCAKMGDWLAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK； PD-L1-2-2重鏈 SEQ ID NO.20： QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRKFPSRGLEYMGYISYSGSTYYNPFLKSRISINRDTSKNQYYLQLNSVTPEDTAVYYCAKMGDWLAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK； PD-L1-2-1或PD-L1-2-2的輕鏈 SEQ ID NO.21： EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCKSSQSLLYSSNQKNSLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYYGYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
如本文所用，術語「融合蛋白」（fusion protein）是指，透過基因重組方法、化學方法或其它適當方法將兩個或多個基因的編碼區連接，在同一調控序列控制下表現基因重組所得的蛋白質產物。本發明的融合蛋白中，兩個或多個基因的編碼區之間可由編碼胜肽接頭或連接胜肽的序列於一個或數個位置融合。胜肽接頭或連接胜肽也可用於構築本發明的融合蛋白。本發明術語「融合蛋白」進一步還包括抗體/ Fc融合蛋白構築體/複合物，或透過非共價方式形成的抗體/ Fc融合蛋白構築體/複合物的組合物，例如，本發明所述的融合蛋白可展示為以下結構： （1）IL-15融合蛋白，其為包含兩條單體的同源二聚體；所述單體包含抗體重鏈、抗體輕鏈、IL-15和IL-15Rα sushi；例如，將抗體重鏈Fc融合IL-15Rα sushi，並與抗體輕鏈、和IL-15-WT（野生型）或IL-15突變體共表現，使IL-15與IL-15Rα sushi形成非共價連接； （2）IL-15融合蛋白，其為包含兩條單體的同源二聚體；所述單體包含抗體重鏈、抗體輕鏈、IL-15和IL-15Rα sushi；例如，透過linker將抗體重鏈Fc與IL-15Rα sushi以及IL-15-WT或IL-15突變體三部分串聯融合表現，並與抗體輕鏈共表現； （3）IL-15融合蛋白，其為包含兩條單體的同源二聚體；所述單體包含Fc、IL-15和IL-15Rα sushi；例如，IL-15-WT或IL-15突變體透過linker和IL15-Rα sushi 相連接，IL15-Rα sushi再透過linker和Fc相連；或， （4）IL-15融合蛋白，其為包含兩條單體的同源二聚體；所述單體包含Fc、IL-15和IL-15Rα sushi；例如，IL15-Rα sushi 透過linker和IL-15-WT或IL-15突變體相連接，IL-15再透過linker和Fc相連。
在本揭示內容中，術語「單體一」是指，透過基因重組方法、化學方法或其它適當方法將如下多個基因的編碼區連接，在同一調控序列控制下表現基因重組所得的蛋白質產物：（1）PD-L1抗體重鏈；（2）連接重鏈Fc和IL-15 Rα sushi 的Linker；（3）IL-15Rα sushi；（4）連接IL-15Rα sushi 和IL-15（WT或突變體）的Linker；（4）IL-15（WT或突變體）。
在本揭示內容中，在其中一個較佳實施例中「IL-15融合蛋白」分別具有如下所示的胺基酸序列： #6-1-1，單體一：SEQ ID NO.22： QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRKFPSRGLEYMGYISYSGSTYYNPFLKSRISINRDTSKNQYYLQLNSVTPEDTAVYYCAKMGDWLAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISSLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVKIVQMFINTS； #6-1-1，輕鏈：SEQ ID NO.21； #6-1-2，單體一，SEQ ID NO.23： QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRKFPSRGLEYMGYISYSGSTYYNPFLKSRISINRDTSKNQYYLQLNSVTPEDTAVYYCAKMGDWLAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISSLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVKIVQMFINTS； #6-1-2，輕鏈：SEQ ID NO.21； #7-1，單體一，SEQ ID NO.24： QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRKFPSRGLEYMGYISYSGSTYYNPFLKSRISINRDTSKNQYYLQLNSVTPEDTAVYYCAKMGDWLAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWLNVISELKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS； #7-1，輕鏈：SEQ ID NO.21； #8-1，單體一，SEQ ID NO.25： QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRKFPSRGLEYMGYISYSGSTYYNPFLKSRISINRDTSKNQYYLQLNSVTPEDTAVYYCAKMGDWLAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWLNVDSDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS； #8-1，輕鏈：SEQ ID NO.21； #9-1，單體一，SEQ ID NO.26： QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSITSGYWNWIRKFPSRGLEYMGYISYSGSTYYNPFLKSRISINRDTSKNQYYLQLNSVTPEDTAVYYCAKMGDWLAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS； #9-1，輕鏈：SEQ ID NO.21。
如本文所用，術語「百分比(％)序列一致性」是指在為達到最大百分比序列一致性而比對序列和引入空位（如果需要）（例如，為了最佳比對，可以在候選和參考比對序列中的一個或兩個中引入空位，並且出於比較的目的，可以忽略非同源序列）之後，候選序列的胺基酸（或核苷酸）殘基與參考比對序列的胺基酸（或核苷酸）殘基相同的百分比。出於確定百分比序列一致性的目的，可以用本發明所屬技術領域中具有通常知識者熟知的多種方式來實現比對，例如使用公眾可得的電腦軟體，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)軟體。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以確定用於測量比對的適當參數，包括需要在被比較序列的全長範圍實現最大比對的任何演算法。例如，用於與候選序列進行比較而比對的參考比對序列可以顯示候選序列在候選序列的全長或候選序列的連續胺基酸（或核苷酸）殘基的選定部分上表現出從50%至100%的序列同一性。出於比較目的而比對的候選序列的長度可以是例如參考比對序列的長度的至少30%（例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%）。當候選序列中的位置被與在參考比對序列中的相應位置相同的胺基酸（或核苷酸）殘基佔據時，則這些分子在那個位置是相同的。
如本文所用，「藥物組合物」表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是保持抗體活性成分的穩定性，促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。本文中，「 藥物組合物」和「 製劑」並不互相排斥。
如本文所用，「凍乾製劑」表示液體或溶液形式的藥物組合物或液體或溶液製劑經真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或藥物組合物。
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以透過市售購買獲得的常規產品。
本發明實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本發明所屬技術領域中具有通常知識者應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
本發明透過下列實施例做更詳細的描述，但本發明的保護範圍不侷限於此。
實施例1  IL-15融合蛋白的設計和表現純化
1.1 IL-15融合蛋白（抗體融合構築體）的結構設計（format）有四種模式： format 1：如圖1中A所示結構，IL-15融合蛋白，其為包含兩條單體的同源二聚體；所述單體包含抗體重鏈、抗體輕鏈、IL-15和IL-15Rα sushi；將抗體重鏈Fc端融合IL-15Rα sushi，並與單株抗體輕鏈、和IL-15-WT（野生型）或IL-15突變體共表現，使IL-15與IL-15Rα sushi形成非共價連接； format 2：如圖1中B所示結構，IL-15融合蛋白，其為包含兩條單體的同源二聚體；所述單體包含抗體重鏈、抗體輕鏈、IL-15和IL-15Rα sushi；透過linker將抗體重鏈Fc端與IL-15Rα sushi以及IL-15-WT或IL-15突變體三部分依序串聯融合表現，並與抗體輕鏈共表現； format 3：如圖1中C所示結構，IL-15融合蛋白，其為包含兩條單體的同源二聚體；所述單體包含Fc、IL-15和IL-15Rα sushi；IL-15-WT或IL-15突變體透過linker和IL15-Rαsushi相連接，IL15-Rαsushi再透過linker和Fc相連；或， format 4：如圖1中D所示結構，IL-15融合蛋白，其為包含兩條單體的同源二聚體；所述單體包含Fc、IL-15和IL-15Rα sushi；IL15-Rαsushi透過linker和IL-15-WT或IL-15突變體相連接，IL-15再透過linker和Fc相連。
各種IL-15融合蛋白設計請詳見表1和表2。
表1. 抗PD-L1- IL-15融合蛋白分子組成
抗PD-L1-IL-15融合蛋白分子各結構域及對應胺基酸序列
融合蛋白編號 PD-L1單株抗體重鏈序列 IL15Rα sushi Linker IL-15蛋白 PD-L1單株抗體輕鏈序列 融合蛋白結構fromat
#1-1 SEQ ID NO.17 SEQ ID NO.8 NA SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.18 format 1
#2-1 SEQ ID NO.17 SEQ ID NO.8 NA SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.18 format 1
#6-1-1 SEQ ID NO.19 SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.21 format 2
#6-1-2 SEQ ID NO.20 SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.21 format 2
#7-1 SEQ ID NO.20 SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.21 format 2
#8-1 SEQ ID NO.20 SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.21 format 2
#9-1 SEQ ID NO.20 SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.21 format 2
表2. IL-15-Fc融合蛋白分子組成
IL-15-Fc融合蛋白分子各結構域及對應胺基酸序列
融合蛋白編號 IL-15蛋白 Linker1 IL15Rα sushi Linker2 Human Fc 融合蛋白結構fromat
#3-1 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.14 SEQ ID NO.12 format 4
#6-2 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.14 SEQ ID NO.12 format 4
#5-1 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.16 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.15 SEQ ID NO.12 format 3
1.2 融合蛋白表現
根據上述4種構築模式，將編碼融合蛋白的核酸序列分別構築至pTT5質體。利用ExpiCHO表現系統進行蛋白瞬間表現。將在ExpiCHOTM Expression Medium（Cat no.A2910001）繼代的宿主細胞ExpiCHO-S（Cat no. A29127）稀釋至合適密度，置於振盪器（100 rpm，37℃，8% CO 2）待轉染。將攜帶編碼融合蛋白核酸序列的載體加入OptiPRO™ SFM（Cat no.12309019）培養基中，使得載體終濃度為0.5~1.0 μg/mL。向含有DNA的OptiPRO™ SFM培養基中加入適量的ExpiFectamine™ CHO Reagent（Cat no.A29129）形成DNA-ExpiFectamine™ CHO Reagent複合物，室溫靜置1~5 分鐘後將複合物緩慢滴入待轉染的細胞懸浮液中。轉染後第1天，補加一定量的 ExpiFectamine™ CHO Enhancer（Cat no.A29129）和ExpiCHO™ Feed（Cat no.A29129）後降溫至32℃培養。轉染後第4~6天，補加一定量的ExpiCHO™ Feed（Cat no.A29129）。轉染後第10~12天，以5000 g離心30 分鐘收穫上清液。
1.3 蛋白純化
採用磁珠法純化突變體融合蛋白，發酵上清液中加入適量磁珠懸浮液（GenScript，Cat.NO.L00695），於旋轉混勻器中孵育2小時以保證IL-15融合蛋白結合到磁珠上，拋棄上清液後用PBS洗滌磁珠3次，最後加入pH 3.0檸檬酸鹽洗脫得到IL-15融合蛋白，以1M Tris-HCl中和樣品後，用NanoDrop One測定蛋白濃度。選擇蛋白純度50 mg/mL的IL-15融合蛋白進行後續的製劑篩選試驗。
實施例2 緩衝體系篩選
2.1緩衝體系篩選方案
篩選實驗涵蓋了4種緩衝鹽（醋酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸鹽和磷酸鹽），12個製劑緩衝體系（pH值從4.5至7.5），各處方中使用IL-15融合蛋白#6-1-2（以下實施例3-7相同），蛋白濃度為50 mg/mL；對蛋白原液進行超濾濃縮換液處理，將原液置換至對應的12個緩衝體系內。透過40℃高溫加速試驗，以外觀、pH值、濃度、純度（粒徑排除層析法（SE-HPLC）、非還原十二烷基硫酸鈉毛細管電泳CE-SDS（NR）、還原十二烷基硫酸鈉毛細管電泳CE-SDS（R））、電荷異構（全管柱毛細管等電點電泳技術（iCIEF））、動態光散射（DLS）為指標，綜合考察比較此蛋白在12種緩衝體系中的穩定性，以篩選出最佳的緩衝體系。具體處方組成和考察方案見下表3。
表3. 製劑緩衝體系篩選實驗方案
編號 緩衝體系，pH T0 40℃
1W 2W 4W
F1 20 mM 醋酸-醋酸鈉 4.5 X X X X
F2 5 X X X X
F3 5.5 X X X X
F4 20 mM 檸檬酸-檸檬酸鈉 5 X X X X
F5 5.5 X X X X
F6 6 X X X X
F7 20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸 5.5 X X X X
F8 6 X X X X
F9 6.5 X X X X
F10 20 mM 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 6.5 X X X X
F11 7 X X X X
F12 7.5 X X X X
備註：X進行下述實驗： iCIEF、SE-HPLC、CE-SDS(NR)、CE-SDS(R)、DLS T0=考察起始點；W=周。
2.2緩衝體系篩選結果
緩衝體系篩選主要結果匯總見下表4-表5。
表4. 製劑緩衝體系篩選40℃加速試驗結果
NO. 條件 DLS SE-HPLC iCIEF
半徑，nm 高分子量峰(%) 主峰(%) 低分子量峰(%) 等電點
F1 T0 4.3 2.2 97.75 ND 7.0-8.8
40℃,1W 3.2 3.7 96.16 0.19 7.0-8.8
40℃,2W 3.3 3.7 95.9 0.3 7.0-8.8
40℃,4W 3.1 6.2 93 0.76 7.0-8.8
F2 T0 4.6 2.3 97.66 ND 7.0-8.8
40℃,1W 4.4 3.1 96.82 0.1 7.0-8.8
40℃,2W 4.5 3.1 96.7 0.3 7.0-8.8
40℃,4W 4.1 5.1 94.44 0.48 7.0-8.8
F3 T0 5.8 2.4 97.57 ND 7.0-8.8
40℃,1W 5.5 3.4 96.48 0.13 7.0-8.8
40℃,2W 5.7 3.3 96.5 0.2 7.0-8.8
40℃,4W 4.9 5.2 94.41 0.42 7.0-8.8
F4 T0 10.5 2.6 97.34 ND 7.0-8.8
40℃,1W 9.8 6.5 93.27 0.23 7.0-8.8
40℃,2W 8.2 7.5 92 0.5 7.0-8.8
40℃,4W 8.6 14.7 84.44 0.86 7.0-8.8
F5 T0 9.1 2.5 97.44 ND 7.0-8.8
40℃,1W 8.8 4.7 95.23 0.13 7.0-8.8
40℃,2W 8.6 5.1 94.6 0.2 7.0-8.8
40℃,4W 7.5 8.3 91.15 0.55 7.0-8.8
F6 T0 7.5 2.7 97.29 ND 7.0-8.8
40℃,1W 9.3 5.1 94.74 0.14 7.0-8.8
40℃,2W 6.7 5.6 94.2 0.2 7.0-8.8
40℃,4W 7.5 8.8 90.82 0.41 7.0-8.8
F7 T0 5.7 2.3 97.66 ND 7.0-8.8
40℃,1W 5.5 3.0 96.86 0.1 7.0-8.8
40℃,2W 5.5 3.1 96.7 0.2 7.0-8.8
40℃,4W 5.3 5.0 94.53 0.52 7.0-8.8
F8 T0 5.9 2.5 97.53 ND 7.0-8.8
40℃,1W 5.7 3.7 96.22 0.08 7.0-8.8
40℃,2W 5.7 3.8 96.1 0.2 7.0-8.8
40℃,4W 5.8 5.5 94.05 0.47 7.0-8.8
F9 T0 6.1 2.7 97.26 ND 7.0-8.8
40℃,1W 6.4 4.8 95.09 0.13 7.0-8.8
40℃,2W 7.3 4.9 94.9 0.2 7.0-8.8
40℃,4W 6.3 6.7 92.89 0.39 7.0-8.8
F10 T0 7.8 3.1 96.91 ND 7.0-8.8
40℃,1W 9.0 6.3 93.58 0.1 7.0-8.8
40℃,2W 9.1 7.7 92.1 0.2 7.0-8.8
40℃,4W 6.7 12.2 87.3 0.55 7.0-8.8
F11 T0 9.7 3.3 96.67 ND 7.0-8.8
40℃,1W 10.4 8.7 91.17 0.14 7.0-8.8
40℃,2W 11.4 11.2 88.5 0.3 7.0-8.8
40℃,4W 11.0 17.0 82.42 0.62 7.0-8.8
F12 T0 9.6 3.6 96.4 ND 7.0-8.8
40℃,1W 9.3 10.0 89.83 0.17 7.0-8.8
40℃,2W 8.8 13.1 86.6 0.3 7.0-8.8
40℃,4W 10.7 20.0 79.12 0.84 7.0-8.8
備註：ND=未檢測到。
表5. 製劑緩衝體系篩選40℃加速試驗結果
NO. 條件 CE-SDS (NR) CE-SDS (R)
降解(%) 主峰(%) 高分子量(%) 輕鏈+重鏈% 非醣基化重鏈%
F1 T0 0.57 99.42 ND 94.99 0.56
40℃,1W 1.98 98.02 ND 94.62 0.61
40℃,2W 1.9 96.16 1.93 94.76 ND
40℃,4W 10.38 88.35 1.27 89.61 0.9
F2 T0 0.53 99.47 ND 94.93 0.54
40℃,1W 1.72 98.26 ND 95.62 0.33
40℃,2W 1.77 96.08 2.14 94.73 ND
40℃,4W 8.98 89.99 1.03 91.61 0.96
F3 T0 0.58 99.42 ND 94.77 0.67
40℃,1W 1.56 98.45 ND 94.83 0.62
40℃,2W 1.75 95.28 2.97 94.56 0.46
40℃,4W 8.56 89.26 2.18 92.47 1.11
F4 T0 0.58 99.43 ND 94.38 0.73
40℃,1W 1.5 98.25 0.25 94.27 0.66
40℃,2W 2.24 94.45 3.31 93.93 0.44
40℃,4W 9.68 85.8 4.52 89.25 1.05
F5 T0 0.67 99.32 ND 94.88 0.71
40℃,1W 1.56 97.99 0.46 94.59 0.68
40℃,2W 2.43 93.59 3.99 94.36 0.39
40℃,4W 11.57 83.58 4.85 91.09 1.09
F6 T0 0.56 99.44 ND 94.72 0.63
40℃,1W 1.55 97.59 0.86 94.74 0.71
40℃,2W 2.4 94.88 2.71 94.37 0.46
40℃,4W 11.04 82.64 6.32 91.04 1.25
F7 T0 0.48 99.51 ND 94.79 0.63
40℃,1W 1.56 98.42 ND 94.92 0.65
40℃,2W 2.92 95.85 1.23 94.01 0.34
40℃,4W 10.71 84.42 4.87 91.55 1
F8 T0 0.48 99.52 ND 94.50 0.81
40℃,1W 1.63 97.93 0.46 94.83 0.71
40℃,2W 1.74 95.93 2.34 94.19 0.47
40℃,4W 11.71 82.81 5.48 92.04 1.02
F9 T0 0.40 99.60 ND 94.38 1.17
40℃,1W 1.96 97.01 1.03 95.06 0.69
40℃,2W 2.7 94.25 3.05 93.97 0.43
40℃,4W 11.14 81.64 7.22 90.83 1.22
F10 T0 0.41 99.58 ND 94.70 0.71
40℃,1W 1.83 96.63 1.54 95.06 0.87
40℃,2W 3.42 92.39 4.19 92.56 0.53
40℃,4W 12.7 77.87 9.43 78.16 1.78
F11 T0 0.50 99.51 ND 94.99 0.60
40℃,1W 2.28 94.69 3.03 94.93 0.71
40℃,2W 3.44 90.18 6.37 89.26 0.6
40℃,4W 12.56 74.89 12.55 75.18 1.99
F12 T0 0.42 99.58 ND 94.83 0.53
40℃,1W 2.79 93.12 4.08 93.46 1.03
40℃,2W 4.25 87.83 7.94 88.55 0.54
40℃,4W 13.21 74.53 12.26 70.43 2.16
備註：ND=未檢測到。
2.3緩衝體系篩選結論
本緩衝體系篩選實驗涵蓋了4種緩衝鹽（醋酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸鹽和磷酸鹽），12個製劑緩衝體系（pH值從4.5至7.5）。進行了40℃高溫加速試驗，綜合考察比較此蛋白在12種緩衝體系中的穩定性。
本研究透過純度（SE-HPLC、CE-SDS（NR）、CE-SDS（R））、電荷異構（iCIEF）、DLS為指標，SE-HPLC：40℃考察4周，SE-HPLC主峰純度和高聚體優劣排序：F2、F3、F7、F8＞F1、F9＞F5、F6＞F10＞F4、F11、F12； CE-SDS(NR)：40℃考察4周，CE(NR)主峰純度F1、F2、F3＞F4、F5、F7＞F6、F8＞F9＞F10、F11、F12；降解峰優劣：F2、F3＞F1、F4＞F5、F6、F7、F8、F9＞F10、F11、F12； CE-SDS(R) ：40℃考察4周，輕鏈和重鏈含量優劣排序：F3、F8＞F2、F5、F6、F7、F9＞F1、F4＞F10、F11、F12； DLS：40℃考察4周，粒徑優劣排序：F1、F2、F3＞F7、F8＞ F9＞F4、F5、F6＞F10、F11、F12； 綜上所述，經過緩衝體系篩選，各個處方優劣排序如下：F2、F3＞F1、F8＞F7＞F5、F6、F9＞F4、F10、F11、F12；F1、F2、F3、F8處方在本次40℃加速實驗考察中的純度、降解、聚集、電荷異質體等方面綜合優於其他處方，表現出良好的穩定性（其中F2、F3略優於F1、F8）。但是由於40℃考察4周時，各個處方CE-SDS（NR）純度均下降劇烈（＞10%），其他檢測項目也有不同程度變化，因此後續將進行凍乾製劑的開發。醋酸緩衝體系（F1~F3）中由於醋酸易揮發，無法進行凍乾，因此選擇F8（20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，pH6.0）進行下一步開發。
實施例3輔料篩選
3.1輔料篩選方案
結合緩衝體系篩選結果以及開發凍乾製劑的目標，向最佳緩衝體系中加入相應輔料，包括甘胺酸、蔗糖、海藻糖、甘露醇共計4個處方，蛋白濃度為50 mg/mL。採用真空冷凍乾燥機對樣品進行凍乾，凍乾步驟如下：（1）預凍：將真空冷凍乾燥機的乾燥箱以極限降溫方式降溫到-45℃，保持3~5小時；（2）一次乾燥：一次乾燥真空度為0.1 mBar，溫度保持在-30~0℃，該步驟總體時間應大於30小時；（3）解析乾燥：一次乾燥後以0.1~0.3℃/分鐘的升溫速率升溫到25℃開始解析乾燥，保持真空度0.1 mBar，保持12~14小時，然後極限真空，保持溫度不變，保持時間大於1小時。
凍乾樣品進行40℃高溫加速試驗，以純度（SE-HPLC、CE-SDS（NR）、CE-SDS（R））、電荷異構（iCIEF）、DLS為指標考察各處方的穩定性，篩選出1個最佳製劑處方進行下一輪的表面活性劑篩選。具體處方組成和考察方案見下表6。
表6 輔料篩選方案
處方 處方組成 類型 T0 40℃
2W 4W
F8-1 20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，pH 6.0 2% 甘胺酸，0.04% 聚山梨酯80 凍乾粉 X X X
F8-2 4.5% 甘露醇，0.04% 聚山梨酯80 X X X
F8-3 8% 蔗糖，0.04% 聚山梨酯80 X X X
F8-4 8% 海藻糖，0.04% 聚山梨酯80 X X X
備註：X進行下述實驗： iCIEF、SE-HPLC、CE-SDS(NR)、CE-SDS(R)、DLS、不溶性微粒、水分（T0） T0=考察起始點；W=周
3.2輔料篩選結果
輔料篩選主要結果匯總見下表7-表8。
表7.輔料篩選40℃加速試驗結果
NO. 條件 SE-HPLC CE-SDS (NR) CE-SDS (R)
高分子量峰(%) 主峰(%) 低分子量峰(%) 降解(%) 主峰(%) 高分子量(%) 輕鏈+重鏈% 其他%
F8-1 (2%甘胺酸, 0.04%聚山梨酯80) T0 4.60 95.40 ND 2.11 97.89 ND 91.05 8.96
40℃,2W 8.40 91.60 ND 1.64 98.37 ND 90.87 9.14
40℃,4W 10.60 86.90 2.50 0.82 95.97 3.22 91.11 8.90
F8-2 (4.5%甘露醇, 0.04%聚山梨酯80) T0 5.30 94.70 ND 0.70 99.31 ND 90.73 9.28
40℃,2W 8.30 91.70 ND 1.46 98.53 ND 89.38 10.63
40℃,4W 9.00 89.00 2.00 0.80 96.38 2.83 90.88 9.12
F8-3 (8%蔗糖, 0.04%聚山梨酯80) T0 3.10 96.90 ND 1.08 98.93 ND 91.15 8.86
40℃,2W 4.00 96.00 ND 1.50 98.49 ND 90.14 9.87
40℃,4W 3.90 94.00 2.20 2.24 96.45 1.32 91.29 8.70
F8-4 (8%海藻糖, 0.04%聚山梨酯80) T0 3.00 97.00 ND 0.89 99.11 ND 90.96 9.03
40℃,2W 4.30 95.70 ND 1.72 98.27 ND 90.18 9.81
40℃,4W 4.20 93.20 2.60 1.63 97.19 1.17 90.97 9.02
備註：ND=未檢測到。
表8.輔料篩選40℃加速試驗結果
NO. 條件 DLS iCIEF 不溶性微粒（個顆粒/mL) 水分（%）
直徑 (nm) 多分散係數 等電點 ≥10µm ≥25µm
F8-1 (2%甘胺酸, 0.04%聚山梨酯80) T0 12.39 0.21 7.256~9.306 818.70 4.87 0.80
40℃,2W 14.55 0.22 7.269~9.233 40.61 0.00 NA
40℃,4W 16.44 0.22 7.242~9.285 30.86 0.00 NA
F8-2 (4.5%甘露醇, 0.04%聚山梨酯80) T0 10.68 0.24 7.191~9.225 769.96 1.62 0.88
40℃,2W 11.24 0.24 7.200~9.225 24.37 4.87 NA
40℃,4W 12.56 0.21 7.174~9.278 1728.36 92.59 NA
F8-3 (8%蔗糖, 0.04%聚山梨酯80) T0 10.75 0.18 7.19~9.221 583.16 19.49 0.66
40℃,2W 10.65 0.18 7.195~9.228 25.99 4.87 NA
40℃,4W 10.87 0.19 7.170~9.282 71.47 11.37 NA
F8-4 (8%海藻糖, 0.04%聚山梨酯80) T0 9.94 0.16 7.2~9.221 186.94 1.62 0.58
40℃,2W 10.45 0.20 7.208~9.221 34.11 4.87 NA
40℃,4W 10.95 0.19 7.180~9.294 55.23 4.87 NA
備註：NA=不適用。
3.3輔料篩選結論
樣品濃度為50 mg/mL，以凍乾粉形式在40℃下進行4周的輔料篩選。40℃考察4周，以純度（SE-HPLC）、CE-SDS（NR）、CE-SDS（R）、電荷異構（iCIEF）、DLS為指標，不溶性微粒方面F8-2 處方明顯高於其他處方；SE-HPLC純度方面，F8-1、F8-2主峰下降明顯，低分子量峰增加明顯；DLS檢測方面F8-1、F8-2直徑增加明顯；CE-SDS(NR)檢測主峰 F8-3, F8-4 ＞ F8-1, F8-2；綜合比較，F8-3、F8-4處方在本次40℃加速實驗考察中的純度、降解、聚集、電荷異質體等方面綜合優於其他處方，表現出良好的穩定性。因此，初步選定F8-3、F8-4處方（分別含8%蔗糖(W/V)和8%海藻糖(W/V)）進行下一步的表面活性劑篩選研究。
實施例4 第1輪表面活性劑篩選
4.1表面活性劑篩選方案
向已篩選的緩衝體系、輔料中加入不同濃度的表面活性劑，包括0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的聚山梨酯80共計8個處方，蛋白濃度為50 mg/mL，透過40℃加速試驗，以純度（SE-HPLC）、CE-SDS（NR）、CE-SDS（R）、電荷異構（iCIEF）、DLS、不溶性微粒為指標考察各處方的穩定性，篩選出最佳製劑處方進行處方確認穩定性實驗，對最終的處方進行了確認。具體處方組成和考察方案見下表9。
表9 第1輪表面活性劑篩選方案
處方 處方組成 T0 40℃
1W 2W 4W
F8-3-1 20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，8%蔗糖， pH 6.0 0.02%聚山梨酯80 X X X X
F8-3-2 0.04%聚山梨酯80 X X X X
F8-3-3 0.06%聚山梨酯80 X X X X
F8-3-4 0.08%聚山梨酯80 X X X X
F8-4-5 20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，8%海藻糖， pH 6.0 0.02%聚山梨酯80 X X X X
F8-4-6 0.04%聚山梨酯80 X X X X
F8-4-7 0.06%聚山梨酯80 X X X X
F8-4-8 0.08%聚山梨酯80 X X X X
備註：X進行下述實驗： iCIEF、SE-HPLC、CE-SDS(NR)、CE-SDS（R）、DLS、不溶性微粒（T0和考察終點） T0=考察起始點；W=周
4.2表面活性劑篩選結果
表面活性劑篩選主要結果匯總見下表10-表11。
表10 第1輪表面活性劑篩選40℃加速試驗結果
NO. 條件 DLS SE-HPLC CE-SDS (NR)
直徑 (nm) 多分散係數 高分子量峰(%) 主峰(%) 低分子量峰(%) 降解(%) 主峰(%) 高分子量(%)
F8-3-1 T0 24.32 0.26 0.8 99.2 ND 1.93 98.07 ND
40℃,1W 18.86 0.26 1.7 98.2 0.2 3.04 96.96 ND
40℃,2W 20.30 0.28 2.7 96.9 0.3 4.92 95.07 ND
40℃,4W 20.95 0.29 3.2 96.3 0.5 4.59 95.4 ND
F8-3-2 T0 22.84 0.26 1.3 98.7 ND 1.77 98.22 ND
40℃,1W 19.84 0.26 1.8 98.0 0.2 3.33 96.67 ND
40℃,2W 21.20 0.29 3.6 96.0 0.4 6.10 93.90 ND
40℃,4W 23.97 0.31 4.3 95.2 0.5 5.96 94.04 ND
F8-3-3 T0 22.17 0.26 1.4 98.6 ND 2.45 97.54 ND
40℃,1W 19.18 0.26 2.3 97.5 0.2 2.73 97.27 ND
40℃,2W 20.38 0.28 4.0 95.7 0.3 6.03 93.97 ND
40℃,4W 25.04 0.32 6.0 93.5 0.5 6.01 92.55 1.43
F8-3-4 T0 21.55 0.26 1.8 98.2 ND 2.39 97.61 ND
40℃,1W 18.33 0.27 2.8 97.0 0.2 3.44 96.55 ND
40℃,2W 19.88 0.28 4.3 95.4 0.3 6.26 93.74 ND
40℃,4W 26.80 0.31 8.0 91.5 0.5 8.83 89.49 1.68
F8-4-5 T0 24.02 0.27 0.8 99.2 ND 2.42 97.58 ND
40℃,1W 19.00 0.26 1.7 98.1 0.2 4.28 95.70 ND
40℃,2W 20.83 0.28 2.8 96.9 0.3 6.54 93.46 ND
40℃,4W 22.52 0.30 3.5 96.1 0.4 6.36 91.88 1.74
F8-4-6 T0 24.60 0.26 1.1 98.9 ND 2.53 97.48 ND
40℃,1W 20.45 0.26 2.0 97.8 0.2 4.37 95.63 ND
40℃,2W 21.29 0.29 3.6 96.0 0.3 7.28 92.73 ND
40℃,4W 23.71 0.31 4.6 95.0 0.5 4.79 93.43 1.79
F8-4-7 T0 24.31 0.26 1.0 99.0 ND 2.57 97.43 ND
40℃,1W 19.99 0.26 2.6 97.2 0.2 3.5 96.49 ND
40℃,2W 20.14 0.28 4.7 95.0 0.3 6.14 93.86 ND
40℃,4W 25.27 0.32 6.2 93.4 0.5 5.52 92.13 2.36
F8-4-8 T0 23.81 0.27 1.3 98.7 ND 2.82 97.2 ND
40℃,1W 19.66 0.26 3.8 96.0 0.2 4.31 95.69 ND
40℃,2W 19.70 0.29 5.7 93.9 0.3 6.73 93.26 ND
40℃,4W 24.26 0.32 7.7 91.9 0.5 5.05 92.83 2.13
備註：ND=未檢測到。
表11 第1輪表面活性劑篩選40℃加速試驗結果
NO. 條件 CE-SDS（R） iCIEF 不溶性微粒（個顆粒/mL)
輕鏈+重鏈% 其他% 等電點 ≥10 µm ≥25 µm
F8-3-1 T0 97.35 2.65 7.219~8.477 2.27 0.00
40℃,1W 96.81 3.20 7.183~8.450 NA NA
40℃,2W 96.51 3.49 7.182~8.459 NA NA
40℃,4W 94.73 5.26 7.095~8.458 15.88 0.00
F8-3-2 T0 97.72 2.27 7.216~8.454 11.35 0.00
40℃,1W 96.74 3.25 7.181~8.440 NA NA
40℃,2W 93.82 6.17 7.195~8.490 NA NA
40℃,4W 94.11 5.91 7.102~8.458 6.81 4.54
F8-3-3 T0 97.78 2.23 7.221~8.488 120.26 22.69
40℃,1W 96.81 3.21 7.188~8.471 NA NA
40℃,2W 94.36 5.64 7.171~8.453 NA NA
40℃,4W 92.62 7.38 7.071~8.465 4.54 0.00
F8-3-4 T0 97.44 2.56 7.220~8.494 9.08 2.27
40℃,1W 96.84 3.15 7.180~8.467 NA NA
40℃,2W 94.06 5.93 7.203~8.463 NA NA
40℃,4W 92.34 7.68 7.064~8.441 15.88 2.27
F8-4-5 T0 97.58 2.42 7.219~8.485 4.54 0.00
40℃,1W 96.92 3.07 7.174~8.468 NA NA
40℃,2W 93.96 6.03 7.205~8.457 NA NA
40℃,4W 95.41 4.59 7.094~8.451 11.35 0.00
F8-4-6 T0 97.77 2.24 7.220~8.540 31.77 0.00
40℃,1W 97.44 2.56 7.185~8.431 NA NA
40℃,2W 93.02 6.97 7.206~8.493 NA NA
40℃,4W 94.07 5.92 7.092~8.455 31.77 2.27
F8-4-7 T0 97.23 2.77 7.216~8.499 9.08 0.00
40℃,1W 97.23 2.77 7.191~8.482 NA NA
40℃,2W 92.42 7.59 7.204~8.476 NA NA
40℃,4W 92.89 7.08 7.084~8.448 4.54 2.27
F8-4-8 T0 97.51 2.49 7.196~8.456 2.27 2.27
40℃,1W 95.90 4.10 7.184~8.471 NA NA
40℃,2W 92.99 7.00 7.201~8.465 NA NA
40℃,4W 92.43 7.55 7.090~8.459 11.35 0.00
備註：NA=不適用。
4.3表面活性劑篩選結論
40℃考察4周，以純度（SE-HPLC）、CE-SDS（NR）、CE-SDS（R）、電荷異構（iCIEF）、DLS、不溶性微粒為指標，SE-HPLC檢測，主峰含量F8-3-1、F8-4-5處方優於其他處方；CE-SDS（NR）檢測，F8-3-1處方優於其他處方；CE-SDS（R）檢測，F8-4-5處方優於其他處方；其他檢測項目均無明顯差異；綜合比較，F8-3-1、F8-4-5處方在本次40℃加速實驗考察中優於其他處方，表現出良好的穩定性。本輪篩選中，SE-HPLC的高分子量峰隨聚山梨酯80濃度增加而增加。因此使用另一類型的表面活性劑泊洛沙姆188進行第2輪表面活性劑篩選。
實施例5 第2輪表面活性劑篩選
根據臨床需求情況，同時避免高濃度下由於蛋白分子的聚集等情況導致的不穩定，以下實施例在前述製劑處方篩選的基礎上，對高蛋白濃度所篩選的處方結果，降低蛋白濃度進行，具體處方如下， 檢測25 mg/mL蛋白，20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，8%蔗糖(W/V)，0.04%泊洛沙姆188(W/V) ，pH 6.0和25 mg/mL蛋白，20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，8%海藻糖(W/V)，0.04%泊洛沙姆188(W/V)， pH 6.0兩個處方凍乾粉的玻璃化轉變溫度分別為74.06℃和115.44℃，由於含海藻糖處方凍乾粉玻璃化轉變溫度遠高於含蔗糖處方，因此第2輪表面活性劑篩選使用海藻糖進行考察。
5.1表面活性劑篩選方案
向已篩選確定的緩衝體系、輔料中加入不同濃度的表面活性劑，包括0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的泊洛沙姆188(W/V)共計5個處方，透過40℃加速試驗，以純度（SE-HPLC）、CE-SDS（NR）、CE-SDS（R）、電荷異構（iCIEF）、DLS、不溶性微粒為指標考察各處方的穩定性，篩選出最佳製劑處方進行處方確認穩定性實驗，對最終的處方進行了確認。具體處方組成和考察方案見下表12。
表12第2輪表面活性劑篩選方案
處方 處方組成 T0 40℃
1W 2W 4W
F8-4-S1 20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，8%海藻糖， pH 6.0 0.01% 泊洛沙姆188 X X X X
 F8-4-S2 0.02%泊洛沙姆188 X X X X
 F8-4-S3 0.04%泊洛沙姆188 X X X X
 F8-4-S4 0.06%泊洛沙姆188 X X X X
 F8-4-S5 0.08%泊洛沙姆188 X X X X
備註：X進行下述實驗： iCIEF、SE-HPLC、CE-SDS(NR)、CE-SDS (R)、DLS、不溶性微粒（T0和考察終點） T0=考察起始點；W=周
5.2表面活性劑篩選結果
表面活性劑篩選主要結果匯總見下表13-表14。
表13 第2輪表面活性劑篩選40℃加速試驗結果
NO. 條件 DLS SE-HPLC CE-SDS (NR)
直徑(nm) 多分散係數 高分子量峰(%) 主峰(%) 低分子量峰(%) 降解(%) 主峰(%) 高分子量(%)
 F8-4-S1 T0 16.37 0.25 1.1 98.9 ND 1.54 98.45 ND
40℃,1W 14.97 0.26 1.3 98.6 0.1 2.78 96.99 0.24
40℃,2W 15.99 0.26 1.3 98.4 0.2 2.73 97.29 ND
40℃,4W 16.11 0.25 2.6 97 0.4 3.69 96.3 ND
 F8-4-S2 T0 16.88 0.24 1 99 ND 1.23 98.77 ND
40℃,1W 14.73 0.26 1.3 98.5 0.1 3.12 96.88 ND
40℃,2W 15.81 0.26 1.3 98.5 0.2 2.62 97.4 ND
40℃,4W 14.55 0.25 2.4 97.2 0.4 3.57 96.43 ND
 F8-4-S3 T0 20.32 0.24 0.9 99.1 ND 1.56 98.44 ND
40℃,1W 15.67 0.26 1.4 98.5 0.1 3.05 96.95 ND
40℃,2W 16.51 0.26 1.3 98.5 0.2 2.06 97.95 ND
40℃,4W 15.32 0.26 2.3 97.3 0.4 3.39 96.6 ND
 F8-4-S4 T0 18.24 0.24 1 99 ND 1.45 98.56 ND
40℃,1W 16.32 0.25 1.2 98.7 0.1 2.09 97.82 0.08
40℃,2W 16.02 0.26 1.3 98.5 0.2 2.54 97.46 ND
40℃,4W 15.04 0.24 2.3 97.3 0.4 3.62 96.39 ND
 F8-4-S5 T0 18.83 0.24 0.9 99.1 ND 1.82 98.18 ND
40℃,1W 16.24 0.25 1.3 98.6 0.1 1.59 98.38 ND
40℃,2W 14.81 0.25 1.3 98.4 0.2 2.78 97.22 ND
40℃,4W 15.13 0.25 2.2 97.4 0.4 3.76 96.24 ND
備註：ND=未檢測到
表14 第2輪表面活性劑篩選40℃加速試驗結果
NO. 條件 CE-SDS (R) iCIEF 不溶性微粒（ particles/mL)
輕鏈+重鏈% 非醣基化重鏈% 碎片% 等電點 ≥10 µm ≥25 µm
 F8-4-S1 T0 98.63 0.54 0.66 7.014~8.536 27.23 0.00
40℃,1W 97.91 0.53 0.71 7.025~8.477 NA NA
40℃,2W 97.26 0.93 1.46 7.012~8.521 NA NA
40℃,4W 95.84 1.14 1.65 7.72~8.257 20.42 0
 F8-4-S2 T0 98.45 0.58 0.7 7.023~8.543 18.15 0.00
40℃,1W 97.2 0.47 0.76 7.027~8.480 NA NA
40℃,2W 97.87 0.75 1.11 7.016~8.516 NA NA
40℃,4W 96.23 1.07 1.66 7.722~8.26 6.81 0
 F8-4-S3 T0 98.78 0.45 0.42 7.012~8.512 13.61 4.54
40℃,1W 97.77 0.5 0.69 7.029~8.463 NA NA
40℃,2W 97.78 0.98 1.07 7.012~8.525 NA NA
40℃,4W 96.21 1.08 1.75 7.713~8.26 6.81 0
 F8-4-S4 T0 98.7 0.51 0.55 7.017~8.526 22.69 6.81
40℃,1W 97.59 0.54 0.8 7.016~8.478 NA NA
40℃,2W 97.99 0.83 0.99 7.018~8.519 NA NA
40℃,4W 95.87 1.04 1.81 7.72~8.254 11.35 0
 F8-4-S5 T0 98.47 0.56 0.62 7.012~8.543 15.88 2.27
40℃,1W 98.39 0.43 0.73 7.022~8.459 NA NA
40℃,2W 97.78 0.88 1.06 7.022~8.521 NA NA
40℃,4W 95.41 1.32 2.33 7.718~8.26 47.65 2.27
備註： NA=不適用。
5.3表面活性劑篩選結論
40℃考察4周，以純度（SE-HPLC）、CE-SDS（NR）、CE-SDS（R）、電荷異構（iCIEF）、DLS、不溶性微粒為指標，CE-SDS（R）檢測，F8-4-S5處方較其他處方碎片峰略高，輕鏈加重鏈比例略低；其他檢測項目均無明顯差異；綜合比較， F8-4-S1、F8-4-S2、F8-4-S3、F8-4-S4處方在本次40℃加速實驗考察中優於其他處方，表現出良好的穩定性，考慮到生產的可操作空間，選擇 F8-4-S3處方作為最終處方（20mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，8%海藻糖(W/V)，0.04%泊洛沙姆188(W/V)， pH6.0）。
實施例6 最終配方的IL-15突變體融合蛋白凍乾製劑製備方法
將最終配方25 mg/mL蛋白濃度的IL-15突變體融合蛋白溶液無菌分裝到西林瓶(penicillin bottle)中，半加塞後進行冷凍乾燥，獲得IL-15突變體融合蛋白凍乾製劑。本實施例採用真空冷凍乾燥機對IL-15突變體融合蛋白溶液進行冷凍乾燥，冷凍乾燥步驟包括：（1）將真空冷凍乾燥機的乾燥箱降溫到-45℃，保持3~5小時；（2）將乾燥箱溫度上升至-5℃，保持3~5小時；（3）將乾燥箱溫度降溫至-45℃，保持3~5小時。在預凍過程中，保持升溫降溫速率為0.5℃~1℃/分鐘；（4）一次乾燥真空度為0.1 mBar，溫度保持在-30~-20℃，該步驟總體時間應大於30小時；（5）一次乾燥後以0.1~0.3℃/分鐘的升溫速率升溫到25℃開始解析乾燥，保持真空度0.1 mBar，保持1~2小時，然後極限真空，保持溫度不變，保持時間大於15小時。其中（1）~（3）步驟為預凍；（4）為一次乾燥；（5）為解析乾燥。
實施例7 穩定性試驗
使用實施例6的製備方法製備IL-15突變體融合蛋白凍乾製劑，並進行40℃加速穩定性考察。主要包括水分、複溶後純度、電荷異構、不溶性微粒、活性等指標。基於緩衝體系、輔料和表面活性劑篩選的結果，確定1個處方：25 mg/mL IL-15突變體融合蛋白，20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，8%海藻糖(W/V)，0.04%泊洛沙姆188(W/V)，pH 6.0，分裝至西林瓶中，凍乾，使用膠塞和鋁塑蓋組成密閉的包裝系統，進行了14天的40℃穩定性試驗。
結果如下表15-表16及圖2-圖5。
表15穩定性試驗結果
條件 SE-HPLC CE-SDS (NR) CE-SDS (R)
高分子量峰(%) 主峰(%) 低分子量峰(%) 降解(%) 主峰(%) 高分子量(%) 輕鏈+重鏈% 非醣基化重鏈% 碎片%
T0 0.30 99.70 ND 1.36 98.64 ND 95.69 0.6 1.44
40℃，7天 0.37 99.63 ND 0.43 99.57 ND 98.06 0.49 0.61
40℃，14天 0.64 99.36 ND 0.77 99.23 ND 98.78 0.51 0.26
備註：T0=考察起始點；ND=未檢測到。
表16穩定性試驗結果
條件 iCIEF 不溶性微粒（個顆粒/mL) 活性 水分（%）
酸性峰區% 主峰區% 鹼性峰區% ≥10 µm ≥25 µm 酵素免疫吸附分析%
T0 30.3 69.7 0.1 24.37 0.00 119.32 0.75
40℃，7天 29.1 70.5 0.5 16.24 1.62 99.59 0.86
40℃，14天 27.3 72.2 0.6 13.00 1.62 105.63 1.03
備註：T0=考察起始點
40℃加速穩定性考察14天，複溶後純度（SE-HPLC）有輕微下降，CE-SDS（NR）、CE-SDS（R）、電荷異構、不溶性微粒、活性無明顯變化。說明本處方中蛋白具有較好的穩定性，達到了本發明的目的。
實施例8 混合淋巴細胞反應（MLR）檢測受試藥物對T細胞增殖和IFN-γ分泌的影響
實施例8-11中，「#6-1」對應「術語定義和說明」以及「表1」中的#6-1-2；「aPDL1」對應PD-L1-2-2；「aHeL-IL15」為同型對照融合蛋白，結構與#6-1相同，僅抗體可變區部分替換為抗雞蛋白溶菌酶抗體的可變區，其餘部分序列相同。
透過混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction，MLR）來測定融合蛋白增強T細胞活性的能力。從健康人供體1的周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中分離CD14 +單核細胞，應用重組人顆粒球巨噬細胞株刺激因子（GM-CSF，Peprotech，Cat.300-03）和重組人白介素4（rhIL-4, Peprotech，Cat.200-04）進行體外誘導分化為樹突狀細胞（dendritic cell, DC），於培養第6天加入LPS(Sigma，Cat：L4516)刺激成熟DC。第7天將供體1的DC細胞與從健康供體2的PBMC中富集的螢光標記（Celltrace Violet Cell Proliferation Kit，Invitrogen，Cat. C34557）的CD4 +T細胞混合共培養，DC:CD4 +T細胞數比例為1:10，加入終濃度2.8 nM的待測藥物，共培養4天。4天後收集細胞，用流式細胞儀檢測CD4 +T細胞的增殖比例，同時收集細胞培養上清液，用ELISA方法檢測上清液中IFN-γ的含量。如圖6顯示(one-way ANOVA，*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.005, ****p＜0.0005)，與各對照組相比，#6-1融合蛋白組有更高的CD4 +T細胞的增殖以及IFN-γ的分泌。其中#6-1與同型對照分子aHel-IL15相比，可以顯著增強MLR實驗中CD4 +T細胞的增殖，並顯著增強IFN-γ的分泌。結果表明#6-1融合蛋白可以在混合淋巴反應中，增強T細胞的功能。
實施例9 受試藥物對人髓系來源抑制性細胞增殖的影響
凍存的商品化人 PBMC（軒鋒，貨號XFB-HP050B）經復甦離心後，用RPMI 1640完全培養基（配方為：89% RPMI 1640 培養基（Gibco，貨號72400047）+ 10%胎牛血清FBS（Gibco，貨號10099-141C）+ 1%青鏈黴素雙株抗體（Gibco，貨號15070063））重新懸浮得到細胞懸浮液並計數，將細胞密度調整為6×10 6/ml，鋪96孔U底盤，每孔100 μL。然後每孔加入100 μL 2×濃度序列稀釋的待測藥物#6-1，#9-1（結構序列參見表1），aPDL1，體系中融合蛋白的終濃度分別為500000 pM，100000 pM，20000 pM，4000 pM，800 pM，160 pM，32 pM，6.4 pM，1.28 pM，0.32 pM。同時設置陰性對照孔No treatment，即補充100 μL完全培養基。體系總體積為200 μL/孔，設置複孔。用多通道移液槍輕輕吹打將細胞與待測融合蛋白充分混勻，混勻後，將孔盤置於5%CO 2培養箱37℃培養3天。培養結束後，取出孔盤，用多通道移液槍將細胞吹打後轉移至新的96孔V底盤中，用DPBS溶液洗滌孔盤一次，並將洗盤的溶液也轉移至相應的96孔中，然後加入100 μL/孔Accutase溶液（Sigma，貨號A6964）放於37℃培養箱消化貼壁細胞10分鐘，用多通道移液槍將消化下來的貼壁細胞吹打後轉移至上述的96孔V底盤中，350×g離心4分鐘，拋棄上清液。每孔加入100 μL 稀釋好的LIVE/DEAD Aqua 染劑（Invitrogen，貨號L34966，1：500用DPBS稀釋），4℃染色20分鐘。用染色緩衝液 (含2%FBS的DPBS溶液)洗滌兩遍。離心350 g，4分鐘，拋棄上清液。加入50 μL/孔稀釋好的Human TruStain FcX (Biolegend， 貨號422302，2μL/test) ，室溫染色10分鐘。然後直接加入50 μL/孔配製好的表面抗體混合物，表面抗體包括Alexa Fluor® 700 anti-human CD3 Antibody（Biolegend， 貨號300424，1 μL/test），PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human HLA-DR（BD，貨號560652， 1 μL/test），PE-Cyanine7 anti-human CD33（eBioscience，貨號25-0338-42， 2 μL/test），BV421 Mouse Anti-Human CD11b（BD，貨號562632， 1 μL/test），FITC anti-human CD14 Antibody（Biolegend，貨號301804， 1 μL/test）。4℃染色30分鐘。用染色緩衝液洗滌兩遍。離心350 g，4分鐘，拋棄上清液。每孔加入100 μL稀釋好的Foxp3/轉錄因子染色緩衝液套組（eBioscience，貨號00-5523-00）中的固定液，於4℃固定60分鐘，用套組中的1*Permeabilization 溶液洗滌兩遍。離心速度提高至400 g，4分鐘，拋棄上清液。然後緩慢加入100 μL/孔配製好的胞內抗體APC anti-human Ki-67 Antibody（Biolegend，貨號350514，1 μL/test），於4℃反應40分鐘，並準備同等品質濃度的APC-Mouse IgG1，kappa同型對照抗體（eBioscience，貨號17-4714-82）。用1*Permeabilization溶液將細胞洗滌兩遍。每孔加入150 μl染色緩衝液重新懸浮細胞，流式上機檢測信號（Thermo Attune NxT）。
圖7中A圖顯示了分析人髓源抑制性細胞（MDSC）增殖的圈選策略，分析人MDSC（HLADR lowCD33 +CD11b +）細胞中Ki-67的比例。圖中展示的為最高濃度#9-1處理的樣品，可以看到MDSC細胞中有比較明顯的Ki-67陽性細胞群。B圖和C圖為三個待測藥物對MDSC細胞增殖的影響曲線，B圖顯示了Ki-67百分比，C圖為MDSC細胞的絕對細胞計數，結果顯示#9-1可促進人CD33 +MDSCs細胞的增殖；而#6-1幾乎無作用，#6-1分子不活化免疫抑制性細胞。
實施例10 受試藥物在小鼠體內藥效優勢評估
接種人黑色素瘤細胞A375細胞(購自北納生物，貨號：BNCC100266 )5×10 6個/100 μl於NPG小鼠（購自北京維通達生物技術有限公司）右後背部皮下，接種A375後次日復甦凍存的PBMC（購自上海儒百生物科技有限公司，貨號：PBMNC100C），以5×10 6細胞/200 μl的量以尾靜脈注射到NPG小鼠體內。PBMC接種6天後採血40 μl檢測hCD45 +細胞比例，待腫瘤長至約63 mm 3後，去除體重、hCD45 +細胞比例、腫瘤體積過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為PBS組，Tecentriq組（10 mg/kg），Tecentriq+aHel-IL15組（3.4 mg/kg+4.5 mg/kg），aHel-IL15組（3 mg/kg）和#6-1組（3 mg/kg）共5組，每組8隻，共40隻。給藥方式為腹腔給藥，按照分組Tecentriq+aHel-IL15組（3.4 mg/kg+4.5 mg/kg），aHel-IL15組（3 mg/kg）和#6-1組（3 mg/kg）分組當天進行給藥，共給藥1次；PBS組和Tecentriq組（10mg/kg）每週兩次進行給藥，共給藥4次。每週測量3次腫瘤體積，記錄數據。計算腫瘤體積（長徑×短徑 2/2）和生長抑制率（TGI TV(%)=[1-(治療組在給藥第i天的腫瘤體積均值-治療組在給藥第0天的腫瘤體積均值)/(溶劑對照組在給藥第i天的腫瘤體積均值-溶劑對照組在給藥第0天的腫瘤體積均值)]×100%），在分組給藥第15天，給藥組在腫瘤體積上均有顯著的抑制效果，具有統計學差異（P＜0.05）。
表17. 受試藥物對免疫重建NPG小鼠A375腫瘤體積的影響
組別 受試藥 腫瘤體積 （mm 3） a P b P c P d
第0天 第15天 TGI TV(%)
G1 PBS 63±4 834±76 - - ＜0.0001 ＜0.0001
G2 Tecentriq 63±3 621±116 27.6 ＜0.0001 - 0.9999
G3 Tecentriq+ aHel-IL15 64±3 272±52 73.0 ＜0.0001 0.0001 0.0002
G4 aHel-IL15 64±4 571±84 34.1 ＜0.0001 0.9999 -
G5 #6-1 64±4 358±85 61.9 ＜0.0001 0.0051 0.0068
注： a：平均數±標準誤差；b：給藥組腫瘤體積與PBS對照組腫瘤體積在分組給藥第15天進行統計學比較，Two-way ANOVA分析，*P＜0.05, **P＜0.01，***P＜0.001,****P＜0.0001。1；c：給藥組腫瘤體積與陽性藥Tecentriq組腫瘤體積在分組給藥第15天進行統計學比較，Two-way ANOVA分析。d：給藥組腫瘤體積與陽性藥aHel-IL15組腫瘤體積在分組給藥第15天進行統計學比較，Two-way ANOVA分析。
體重監測及觀察結果表明aHel-IL15（3 mg/kg）組和#6-1（3 mg/kg）組實驗動物在給藥期間活動和進食狀態良好，體重有下降趨勢；Tecentriq+ aHel-IL15（3.4 mg/kg+4.5 mg/kg ）組給藥15天時出現動物死亡，小鼠的死亡可能與IL15引起的淋巴因子風暴有關，見圖9、表18。
表18 受試藥物對免疫重建的A375荷瘤NPG小鼠體重的影響
組別 受試藥 體重（g） a 體重改變（%） 死亡統計
第0天 第15天 P b
G1 PBS 23.0±0.5 24.1±0.5 - 1.1 0
G2 Tecentriq 22.2±0.6 22.8±0.6 0.0018 0.6 0
G3 Tecentriq+ aHel-IL15 23.4±0.6 20.8±1.0 0.0102 -2.6 1
G4 aHel-IL15 23.0±0.6 21.8±0.9 0.1625 -1.2 0
G5 #6-1 23.3±0.5 22.1±1.1 0.5937 -1.2 0
注：a：平均數±標準誤差；b：給藥組體重與PBS對照組體重在分組給藥第15天進行統計學比較，Two-way ANOVA分析。
腫瘤監測結果表明抗PD-L1-IL15融合蛋白#6-1對A375腫瘤皮下移植瘤生長具有顯著抑制作用（表17，圖8）；#6-1（3 mg/kg）組與Tecentriq（10 mg/kg）組和aHel-IL15（3 mg/kg）組相比在腫瘤抑制效果上顯著更強，體現出融合蛋白藥效優勢；#6-1（3 mg/kg）組與Tecentriq+aHel-IL15（3.4 mg/kg+4.5 mg/kg）聯用組相比在腫瘤體積上抑制效果相當，但安全性更好（表18，圖9）。
實施例11 酵素免疫吸附分析（ELISA）檢測腫瘤組織內受試藥物含量
接種人結腸癌細胞RKO細胞（ATCC,CRL-2577）7×10 6個/100 μl於NPG小鼠（購自北京維通達生物技術有限公司）右前靠近腋下皮下，接種RKO後，待腫瘤長至300-500 mm 3，去除體重、腫瘤過大和過小的個體，按腫瘤體積將小鼠隨機分為4組，每組20隻，共80隻，詳細分組、給藥、取樣實驗方案見下表19。按照表19方案完成分組給藥後，在計劃的時間對小鼠進行取血並安樂死處理，取完整腫瘤，PBS清洗乾淨後十字切開，取其中一份腫瘤組織，加裂解液（T-PERTMTissue Protein Extraction Reagent：thermo，78510加蛋白酶抑制劑混合物：碧雲天，P1046加核酸酶：millipore，E1014）進行勻漿並裂解，獲得組織裂解液用於ELISA定量分析。再取另一份組織，先用手術剪剪碎，加組織消化酶（美天旎，130-095-929）振盪孵育30分鐘，消化結束後，加入終止液(98% PBS（Hyclone，SH30256）和2%FBS（Gibco，10099-141C）)，過細胞篩（thermo，70um\352350\ Falcon）收集單細胞懸浮液，取0.5×10 6個單細胞用於流式分析。
ELISA分析方法及結果：透過酵素免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測不同時間點腫瘤裂解液中的藥物濃度，以比較受試分子不同劑量下在腫瘤組織內部的富集程度及趨勢。以抗人Fc抗體（Jackson Immuno，#109-006-098）捕獲受試分子的Fc區，加入標準品和腫瘤裂解液待測物後，透過酵素標記抗人F(ab) 2抗體（Jackson Immuno，#109-035-097）連接受試分子的Fab區測定腫瘤裂解液中人源化抗體的濃度，並以下述公式計算每個個體動物腫瘤組織中受試藥物的含量：個體腫瘤中受試藥物的含量（ng）= 腫瘤裂解液中受試藥物濃度（ng/mL）×裂解液體積（mL）/裂解部分的瘤重（mg）×個體總瘤重（mg）。
如圖10中A和B結果顯示，相較aHel-IL15同型對照，#6-1融合蛋白能特異標靶到腫瘤組織內部PD-L1 +腫瘤細胞上，並透過aPD-L1端標靶作用在腫瘤組織內部產生藥物濃度優勢，濃度隨劑量的增加而上升且在6-72小時呈現持續富集趨勢。(T檢驗，*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.005, ****P＜0.0005)
流式檢測方法和結果：將單細胞懸浮液離心後，用PBS重新懸浮後加入死活染劑（biolegend，423114）染色20分鐘，結束後用染色緩衝液清洗兩次，加入阻斷抗體（BD，55314）15分鐘，然後加入染色抗體CD47（biolegend，323124）和PE anti-human IgG Fc（biolegend，410708）(注：CD47用於標記RKO細胞，抗人源Fc螢光抗體可以特異結合藥物的Fc）。染色結束後用於流式檢測，結果顯示為RKO細胞（CD47 +細胞群）中PE anti-human IgG Fc的陽性率。
如圖11，流式檢測結果表明，相較於aHel-IL15，#6-1融合蛋白可特異性結合在腫瘤細胞上，高低劑量均呈現良好劑量關係，且在6-72小時內呈現步驟富集趨勢。達到融合蛋白的設計目標。
採用融合蛋白#6-1-1進行實施例6-11實驗，驗證取得的結果與#6-1-2（即實施例8-11中所述#6-1）趨勢完全相同，相似的圖表不重複展示。
表19 組織分佈實驗方案
組別 受試藥 劑量（mg/kg） 取樣時間點 給藥 途徑 頻次
1 aHel-IL15 1 6h、24h、48h、72h 尾靜脈 單次給藥
2 aHel-IL15 3 6h、24h、48h、72h
3 #6-1 1 6h、24h、48h、72h
4 #6-1 3 6h、24h、48h、72h
綜上所述，蛋白的PKa、醣基化情況、（由序列及高級結構決定的）親疏水性質、等電點等各種基本理化參數，會影響不同製劑處方的穩定性情況。
本申請案經過篩選，針對突變後的IL-15融合蛋白，篩選出了穩定的製劑處方，在考察期間內的各種條件的加速實驗下，iCIEF、SE-HPLC、CE-SDS(NR)、CE-SDS (R)、DLS、不溶性微粒等參數的考察結果，未發生明顯變化。
無
圖1.為IL-15融合蛋白結構示意圖。 圖2.為穩定性試驗中樣品放置40℃考察SE-HPLC結果匯總的趨勢圖。 圖3.為穩定性試驗中樣品放置40℃考察CE-SDS(NR)結果匯總的趨勢圖。 圖4.為穩定性試驗中樣品放置40℃考察CE-SDS(R)結果匯總的趨勢圖。 圖5.為穩定性試驗中樣品放置40℃考察iCIEF結果匯總的趨勢圖。 圖6.為混合淋巴細胞反應（MLR）檢測受試藥物對T細胞增殖和IFN-γ分泌的影響。 圖7.A為人髓源抑制性細胞（MDSC）增殖的FACS圖；B為FACS檢測受試藥物對人髓系來源抑制性細胞增殖的影響；C為MDSC細胞的絕對細胞計數結果圖。 圖8.A為NPG小鼠腫瘤生長曲線；B為Tecentriq組與#6-1組單隻小鼠生長曲線對比； C為aHel-IL15組與#6-1組單隻小鼠生長曲線對比。 圖9.為NPG小鼠體重生長曲線。 圖10.為Elisa檢測NPG小鼠腫瘤內部血藥濃度結果。 圖11.為FACS檢測受試藥物對於腫瘤組織細胞的結合結果。
無
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Claims (26)

  1. 一種藥物組合物，其特徵在於，所述的藥物組合物包含IL-15突變體融合蛋白、緩衝液、蛋白穩定劑和表面活性劑。
  2. 如請求項1所述的藥物組合物，其中，所述的IL-15突變體融合蛋白包含如下結構域： （1）IL-15突變體； （2）與IL-15突變體融合的免疫球蛋白分子或其部分； （3）IL-15Rα。
  3. 如請求項2所述的藥物組合物，其中，所述的IL-15突變體包含對應於野生型IL-15的Asp8、Ile6、Val3和His105的一個或複數個胺基酸殘基處的突變。
  4. 如請求項3所述的藥物組合物，其中，所述突變選自以下群組的胺基酸替換：Asp8Ser（D8S）、Asp8Gly（D8G）、Asp8 Glu（D8E）、Val3Leu（V3L）、Ile6Asp（I6D）、和/或His105Lys（H105K）。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的藥物組合物，其中，所述IL-15突變體包含下述突變或突變組合：（1）Asp8Ser；（2）Asp8Gly；（3）His105 Lys；（4）Asp8Glu和Val3Leu；（5）Val3Leu和Ile6Asp；或（6）Asp8Ser 和His105Lys；較佳為Asp8Ser 和His105Lys。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的藥物組合物，其中，所述IL-15突變體的胺基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示； 較佳的，所述野生型IL-15的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的藥物組合物，其中，所述的IL-15突變體融合蛋白中的各結構域的連接順序自N端至C端為： （1）免疫球蛋白分子或其部分、IL-15Rα、IL-15突變體； （2）免疫球蛋白分子或其部分、IL-15突變體、IL-15Rα； （3）IL-15突變體、IL-15Rα、免疫球蛋白分子或其部分； （4）IL-15Rα、IL-15突變體、免疫球蛋白分子或其部分； 較佳的，當IL-15Rα或IL-15突變體與免疫球蛋白分子融合時，融合於免疫球蛋白分子重鏈可變區的N端或免疫球蛋白Fc區的C端；當IL-15Rα或IL-15突變體與免疫球蛋白Fc區融合時，融合於免疫球蛋白Fc區的N端或C端。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的藥物組合物，其中，所述的IL-15突變體透過或不透過連接胜肽與免疫球蛋白分子或其部分融合，或IL-15突變體透過或不透過連接胜肽與IL-15Rα融合；較佳使用連接胜肽；較佳使用SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.14 、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示連接胜肽； 較佳的，IL-15突變體透過或不透過連接胜肽與IL-15Rα融合，再與免疫球蛋白分子或其部分融合；較佳使用連接胜肽；較佳使用SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示連接胜肽。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的藥物組合物，其中，所述免疫球蛋白分子為抗PD-L1的抗體或抗原結合片段； 較佳的，所述抗PD-L1的抗體或抗原結合片段選自Tecentriq、KN-035或794-h1-71；更佳的，所述抗PD-L1抗體的重鏈具有SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20所示序列，所述抗PD-L1抗體的輕鏈具有SEQ ID NO: 21所示序列。
  10. 如請求項1-8中任一項所述的藥物組合物，其中，所述免疫球蛋白分子部分為免疫球蛋白Fc區； 較佳的，所述免疫球蛋白Fc區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一的Fc區；較佳包含人或鼠抗體IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區的序列； 更佳的，所述免疫球蛋白Fc區的胺基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
  11. 如請求項1-10中任一項所述的藥物組合物，其中，所述的IL-15突變體融合蛋白包含： （1）包含所述抗PD-L1抗體的重鏈的，分別具有如SEQ ID NO：22、23、24、25或26所示序列的單體一；具有如SEQ ID NO：21所示序列的抗PD-L1抗體的輕鏈； （2）與上述（1） 所示序列具有至少 90%同一性的胺基酸序列，較佳為至少 91%、 92%、93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%同一性。
  12. 如請求項1-11中任一項所述的藥物組合物，其中，所述IL-15突變體融合蛋白的濃度為1 mg/ml至100 mg/ml，較佳為25-95 mg/mL，更佳為50 mg/mL 或25 mg/mL。
  13. 如請求項1-12中任一項所述的藥物組合物，其中，所述的緩衝液選自醋酸-醋酸鈉緩衝液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，較佳為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液。
  14. 如請求項13所述的藥物組合物，其中，所述的緩衝液濃度為10-100 mM，較佳為15-30 mM，更佳為20mM。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的藥物組合物，其中，所述的蛋白穩定劑選自氯化鈉、甘胺酸、鹽酸精胺酸、蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇，較佳為蔗糖、海藻糖。
  16. 如請求項15所述的藥物組合物，其中，所述的蛋白穩定劑的濃度為1-10%(w/v)，較佳為2%(w/v)、4.5%(w/v)或8%(w/v)，更佳為8%(w/v)。
  17. 如請求項1-16中任一項所述的藥物組合物，其中，所述的表面活性劑選自聚山梨酯、泊洛沙姆或甘油脂肪酸酯，較佳為泊洛沙姆188。
  18. 如請求項17所述的藥物組合物，其中，所述的表面活性劑的濃度為0.01~0.1 %(w/v)，較佳為0.02%(w/v)、0.04%(w/v)、0.06%(w/v)或0.08 %(w/v)。
  19. 如請求項1-18中任一項所述的藥物組合物，其中，所述的藥物組合物的pH約為4.5-7.5，較佳為4.5-6.5，更佳為6。
  20. 如請求項1-19中任一項所述的藥物組合物，其中包含： a)濃度為1 mg/ml至100 mg/ml 的IL-15突變體融合蛋白， b)濃度為10-100 mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH為4.5-7.5， c)濃度為1-10%(w/v)的海藻糖，和 d)濃度為0.01~0.1%(w/v)的泊洛沙姆； 較佳的，所述的藥物組合物包含： a)濃度為25mg/ml至95mg/ml的IL-15突變體融合蛋白， b)濃度為15-30mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，pH為5.5-6.5， c)濃度為2-8%(w/v)的海藻糖，和 d)濃度為0.04 %(w/v)的泊洛沙姆188； 較佳的，所述藥物組合物為液體形式或凍乾粉製劑。
  21. 一種製備如請求項1-20中任一項所述的藥物組合物的方法，包括將IL-15突變體融合蛋白溶液經過緩衝液置換的步驟，所述的緩衝液較佳為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，所述緩衝液濃度較佳為20 mM，所述緩衝液的pH較佳為6； 較佳的，製備方法進一步包括冷凍乾燥的步驟； 更佳的，冷凍乾燥步驟包括：（1）將真空冷凍乾燥機的乾燥箱降溫到-45℃，保持3~5小時；（2）將乾燥箱溫度上升至-5℃，保持3~5小時；（3）將乾燥箱溫度降溫至-45℃，保持3~5小時；在步驟（1）-（3）預凍過程中，保持升溫降溫速率為0.5℃~1℃/分鐘；（4）一次乾燥真空度為0.1 mBar，溫度保持在-30~-20℃，該步驟總體時間應大於30小時；（5）一次乾燥後以0.1~0.3℃/分鐘的升溫速率升溫到25℃開始解析乾燥，保持真空度0.1 mBar，保持1~2小時，然後極限真空，保持溫度不變，保持時間大於15小時。
  22. 一種含IL-15突變體融合蛋白的藥物組合物，其中，所述藥物組合物透過如請求項21所述方法製備獲得。
  23. 一種含IL-15突變體融合蛋白的凍乾製劑，其中，所述製劑透過將如請求項1至20中任一項所述的藥物組合物經冷凍乾燥獲得。
  24. 一種含IL-15突變體融合蛋白的複溶溶液，其中，所述複溶溶液是透過將如請求項23所述的凍乾製劑經複溶製備獲得。
  25. 一種如請求項1-20中任一項所述的藥物組合物、如請求項21所述的方法製備的產品、如請求項22所述的藥物組合物、如請求項23所述的凍乾製劑、或如請求項24所述的複溶溶液，在製備預防和/或治療個體中的疾病的藥物中的用途；所述疾病較佳為腫瘤或發炎疾病； 較佳的，所述腫瘤選自膠質母細胞瘤，前列腺癌，血液癌，B細胞腫瘤，多發性骨髓瘤，B細胞淋巴瘤，B細胞非何杰金淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病，急性骨髓性白血病，皮膚T細胞淋巴瘤，T細胞淋巴瘤，實體瘤，尿路上皮/膀胱癌，黑色素瘤，肺癌，腎細胞癌，乳腺癌，胃癌和食道癌，前列腺癌，胰腺癌，結腸直腸癌，卵巢癌，非小細胞肺癌和鱗狀細胞頭頸癌。
  26. 一種預防和/或治療個體中的疾病的方法，包含向有此需要的患者施用如請求項1-20中任一項所述的藥物組合物、如請求項21所述的方法製備的產品、如請求項22所述的藥物組合物、如請求項23所述的凍乾製劑、或如請求項24所述的複溶溶液；所述疾病較佳為腫瘤或發炎疾病； 較佳的，所述腫瘤選自膠質母細胞瘤，前列腺癌，血液癌，B細胞腫瘤，多發性骨髓瘤，B細胞淋巴瘤，B細胞非何杰金淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病，急性骨髓性白血病，皮膚T細胞淋巴瘤，T細胞淋巴瘤，實體瘤，尿路上皮/膀胱癌，黑色素瘤，肺癌，腎細胞癌，乳腺癌，胃癌和食道癌，前列腺癌，胰腺癌，結腸直腸癌，卵巢癌，非小細胞肺癌和鱗狀細胞頭頸癌。
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