JP2017537975A - 親和性樹脂を用いるADCs合成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明によれば、生体分子-薬剤-抱合体を合成する方法を提供し、この本発明方法は、
a) 随意的に、生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するステップと、
b)
i) ステップ(a) を実施するとき、前記ステップ(a) の前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップ、又は
ii) ステップ(a) を実施しないとき、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップと、
c) 随意的に、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/又は活性化した生体分子を産生するステップと、
d) 随意的に、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子;ステップ(b)(ii)の前記固定化した生体分子;又はステップ(c) の固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/若しくは活性化した固定化した生体分子を、緩衝剤で洗浄して、余分な若しくは未反応の化学修飾剤、酵素修飾剤、又は余分な若しくは未反応の活性剤を除去する洗浄ステップと、
e) 随意的に、ステップ(c) 及びステップ(d) を繰り返すステップと、
f) 随意的に、薬剤成分を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した薬剤成分を産生するステップと、
g)
i) ステップ(f) を実施するとき、前記固定化した生体分子、若しくは前記固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/若しくは活性化した生体分子を、前記ステップ(f) の前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップ、又は
ii) ステップ(f) を実施しないとき、前記固定化した生体分子、若しくは前記固定化した化学修飾、酵素修飾及び/若しくは活性化した生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップと、
h) 随意的に、ステップ(g) の前記固定化した生体分子-薬剤-抱合体を、緩衝剤で洗浄し、余分な又は未反応の試薬を除去して、精製した固定化した生体分子-薬剤-抱合体を産生するステップと、
i) 前記精製した生体分子-薬剤-抱合体を、前記捕捉樹脂から剥離させるステップと、
を備え、
前記生体分子は、抗体、修飾抗体、又は抗体断片である。
本発明によれば、生体分子-薬剤-抱合体を合成するプロセスを提供する。本発明のプロセスは、以下の表に示す。以下の表の開示は、特許請求の範囲及び本発明の内容を制限するものではなく、本発明を使用するプロセスを説明するための可視的表示として供するものである。
本発明によれば、化学的に若しくは酵素で修飾した、又は活性化した、固定化した生体分子を合成する方法を提供し、前記方法は、
a) 随意的に生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するステップと、
b)
i) ステップ(a) を実施するとき、前記ステップ(a) の化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップ又は
ii) ステップ(a) を実施しないとき、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップと、
c) ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、若しくは活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/又は活性化した生体分子を産生するステップと、
を含み、
前記生体分子は、抗体、修飾抗体、又は抗体断片である、方法。
1. 媒剤に追加される非天然アミノ酸
2. 直交性アミノアシル−tRNA合成酵素(aaRS)
3. 直交性tRNA
である。
ステップ(a) を実施するとき、ステップ(b) は、前記ステップ(a) の前記化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させることを含む。
実施形態において、ステップ(c) を実施する。
実施形態において、ステップ(d)を実施する。
ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子;ステップ(b)(ii)の前記固定化した生体分子;又はステップ(c) の固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/又は活性化した固定化した生体分子を洗浄して、いかなる修飾剤/活性剤をも除去する。
実施形態において、ステップ(c) を、1回、2回又は3回繰り返す。実施形態において、ステップ(c) を1回繰り返す。実施形態において、ステップ(c) を2回繰り返す。実施形態において、ステップ(c) を3回繰り返す。
実施形態において、ステップ(f) を実施する。
ステップ(g)は、前記固定化した生体分子、又は前記固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/又は活性化した生体分子を、前記ステップ(f) (ステップ(f)を実施するとき)の前記化学修飾、酵素修飾、又は活性化した薬剤成分に接触させて、又は前記固定化した生体分子、又は前記固定化した化学修飾、酵素修飾及び/又は活性化した生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成することを含む。
実施形態において、ステップ(h) を実施する。
実施形態において、前記生体分子-薬剤-抱合体を前記捕捉樹脂から剥離させるステップは、
a) 支持体-生体分子化合物を剥離剤に曝すステップ、及び/又は
b) pHを変化させて支持体-生体分子結合を破壊するステップ
を含む。
実施形態において、本発明の中間生成物を洗浄するステップは、捕捉樹脂に結合されていない物質、例えば汚染物を除去するステップを含む。代表的な汚染物としては、固定化済み生体分子を活性化するのに使用された過剰試薬、捕捉樹脂に固定化されなかった生体分子、及び活性化した固定化済み生体分子と反応しなかった薬剤成分、又は余分に残留した溶剤若しくは共溶媒がある。生体分子の活量、完全性若しくは3D構造、又は固定化済み生体分子と捕捉樹脂との間における結合の完全性に影響を与えない任意の媒剤を、中間生成物の洗浄に使用することができる。
本発明によれば、
(i) 抗体、修飾抗体、又は抗体断片の捕捉部分であって、非ペプチドベースのプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤からなるグループから選択した捕捉部分を含む捕捉樹脂と、及び
(ii) 化学修飾剤若しくは活性剤と
を備える混合物を提供する。
本発明によれば、抗体、修飾抗体、又は抗体断片の捕捉部分であって、非ペプチドベースのプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤からなるグループから選択した、該捕捉部分を含む捕捉樹脂を、生体分子-薬剤-抱合体の合成に使用する方法を提供する。
長年にわたって、研究者は、従来型プロテインA、G又はLに親和性を有する精製支持体に対する代替物として、多様な完全長抗体、断片又は融合体に対して親和性を有するリガンドを開発しようと試みてきた。上出来なリガンド発見/開発の主な基準としては、
1. 高い初期精製をもたらす抗体に対する高い選択性
2. 有用な動的結合能力
3. 抗体完全性の保持に適合する溶離条件
4. 多重溶離/清浄化サイクル中における支持体の安定性
5. プロテインA、G又はLの支持体よりも低いコスト
であった。
実施形態において、生体分子は生命有機体内で自然に生ずるものである。代案として、生体分子は、生命有機体内で自然に生ずる化合物の誘導体とすることができる。例えば、生体分子は、生理学的活量に影響を与えないよう化学的又は遺伝的に改変した生体分子であり得る。したがって、実施形態において、生体分子は、組み換え型生体分子、例えば、組み換え技術操作した又は組み換え式に修飾した生体分子である。
本発明によれば、本発明プロセスによって得られる生体分子-薬剤-抱合体を提供する。
サイズ排除クロマトグラフィは、東ソー・バイオサイエンス社製TSK-Gel(登録商標)GW3000SWxlカラムを用いて、pH6.95の0.2Mリン酸カリウムを0.25mMの塩化カリウム及び10%IPAとともに0.5ml/分の流量にして実施した。抱合体の凝集状態は、溶離ピーク領域吸収度を280nmで積分することによって決定した。
疎水性相互作用クロマトグラフィは、東ソー社製TSK-Gel(登録商標)ブチルNPRカラムを用いて、緩衝液AからBに0〜100%にわたる直線形的勾配で12分間にわたり0.8ml/分の流量にして実施した。ここで、緩衝液Aは25mMリン酸ナトリウムを含むpH6.95の1.5M酢酸アンモニウムであり、緩衝液Bは25%IPAを含むpH6.95の25mMリン酸ナトリウムである。抱合体の抗体薬剤比は、溶離ピーク領域吸収度を280nmで積分することによって決定した。
逆相クロマトグラフィ(ポリマー・ラボラトリーズ社PLRP)は、Agilent PLRP-S PL1912-1502カラムを用いて、緩衝液AからBに25〜95%にわたる勾配で31分間にわたり0.25ml/分の流量にして実施した。ここで、緩衝液Aは0.05%TFAを有する水であり、緩衝液Bは0.04%TFAを有するACNである。サンプルは、50mMDTTを含むpH8.4の20mMホウ酸ナトリウムで15分間にわたり37℃にして予注入分を還元した。抱合体の抗体薬剤比は、溶離ピーク領域吸収度を280nmで積分することによって決定した。
UV分析のために、サンプルを、1cmの経路長を有する400μl石英キュベットに添加し、また252nm及び280nmにおける吸収度をサーモ・サイエンティフィック社製Multiskan GOを有する分光光度計で測定した。252nm及び280nmデータを使用し、これらの波長におけるハーセプチン及びDM1の公表されたモル吸光係数に基づいて薬剤抗体比を計算した。
この実施例は、プロセス開発の必要がない一般プロセスにより固定化抗体が規定薬剤装荷(ローディング)に抱合することができることを実証する。この手法は、96ウェルプレートの高いスクリーニング処理能力に適合させるのに適している。
この実施例は、鎖間ジスルフィド結合の部分的還元、それに続くvcMMAEとの抱合によって固定化済み抗体を規定薬剤装荷に抱合できること、及び生成物品質が溶液内で形成される同一抱合体よりも高まることを示す。
この実施例は、固定化済み抗体抱合体が優れた再現性を持ってクロマトグラフのフロープロセスに適合できることを示す。
この実施例は、固定化済み抗体が、SMCCで修飾し、これに続いてのDM1との抱合によって、リジン側鎖に抱合できること、また生成物品質が溶液内で形成される同一抱合体に比べて高まることを示す。
この実施例は、抗体をプロテインA模倣剤樹脂又はプロテインL模倣剤樹脂のいずれかに固定化することに続いて抗体抱合体が得られることを示す。これと並行して、比較目的用に同一条件にして、従来型溶液相方法論を採用した。
フローモード合成は大量生産にとって魅力的である。この実施例は、抱合体の固相合成が拡張可能であり、様々なカラムサイズにわたり生成物品質及び収率に関して一貫性があることを証明する。
表6からの選択した抱合体サンプルは、Ides(FabRICATOR(登録商標)、ジェノビス社製)、RemoveiT(登録商標) Endo S(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)及びDTTでの処理に続くMSにより分析した。重複するイオンのシリーズは、素の及び抱合された(毒素)抗体断片よりなる断片質量を与えるよう解析し、この断片質量から信号強度を用いてMSによるDARを計算した。収集したデータを以下の表に示す。
表6からの選択した抱合体サンプルは、抗原陽性細胞死滅検定で効力を分析した。SK−BR3細胞をトリプシン/EDTAとともに採取し、また次に検定媒剤で洗浄し、この後より多くの検定媒剤で0.9×105/mlまで希釈する。この細胞ストックの100μlを96ウェルプレートの各ウェルに添加し、このプレートを37℃/5%CO2で3時間培養し、細胞を定着させる。サンプル及び基準物は検定媒剤で適正となるよう希釈し、また100μlをウェルに適正に添加する。細胞/サンプルを72時間培養し、この後、%細胞細胞毒性を市販のLDH検定キットを用いて測定した。
この実施例は、固定化済み抗体は、予活性化したDM1-SMCC細胞毒性薬剤リンカーでの修飾によってリジンの側鎖に抱合できることを実証している。この方法論は、抱合体産生のための「1ステップ手法」と称される。活性化したDM1-SMCCは、過剰なDM1-SHをSMCCでインキュベーションし、結合反応を完了まで駆り立てることによって調合し、次にこの生の混合物を抱合用に使用する。
この実施例は、固相抱合技術に関連して化学修飾抗体を用いるADC合成について実証する。抗体は、インキュベーションし、また抱合プロセス後に樹脂に生ずる固相樹脂への結合前に、溶液内で化学的に還元する。
この実施例は、組み換え操作したチオール抗体とともに固相樹脂を用いる抗体薬剤抱合体の合成を例示する。この実施例において、この組み換え操作した抗体は、ThioMab抗体技術(ジェネテック社製)に類似の部位特異的抱合技術を容易にする2つの付加的システイン残基を含む。
この実施例は、「1ステップ手法」による抗体薬剤抱合体の合成を実証している。Herzuma(登録商標)は、トラスツズマブ(ロッシュ社製のハーセプチン)におけるバイオ後続品であるモノクローナル抗体である。本明細書において、本発明者らは、予め適格化かつ活性化したDM1毒素リンカーMCC-DM1の使用を介する固相抱合手法を用いて、抗体薬剤抱合体であるHerzuma(登録商標)-DM1を合成できることを実証する。
表6からの選択した抱合体サンプルは、抗原陽性細胞死滅検定で効力を分析した。SK−BR3細胞をトリプシン/EDTAとともに採取し、また次に検定媒剤で洗浄し、この後より多くの検定媒剤で0.9×10 5 /mlまで希釈する。この細胞ストックの100μlを96ウェルプレートの各ウェルに添加し、このプレートを37℃/5%CO2で3時間培養し、細胞を定着させる。サンプル及び基準物は検定媒剤で適正となるよう希釈し、また100μlをウェルに適正に添加する。細胞/サンプルを72時間培養し、この後、%細胞細胞毒性を市販のLDH検定キットを用いて測定した。
Claims (25)
- 生体分子-薬剤-抱合体を合成する方法であって、
a) 随意的に、生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するステップと、
b)
i) ステップ(a) を実施するとき、前記ステップ(a) の前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップ、又は
ii) ステップ(a) を実施しないとき、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップと、
c) 随意的に、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/又は活性化した生体分子を産生するステップと、
d) 随意的に、ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子;ステップ(b)(ii)の前記固定化した生体分子;又はステップ(c) の固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/若しくは活性化した固定化した生体分子を、緩衝剤で洗浄して、余分な若しくは未反応の化学修飾剤、酵素修飾剤、又は余分な若しくは未反応の活性剤を除去する洗浄ステップと、
e) 随意的に、ステップ(c) 及びステップ(d) を繰り返すステップと、
f) 随意的に、薬剤成分を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した薬剤成分を産生するステップと、
g)
i) ステップ(f) を実施するとき、前記固定化した生体分子、若しくは前記固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/若しくは活性化した生体分子を、前記ステップ(f) の前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップ、又は
ii) ステップ(f) を実施しないとき、前記固定化した生体分子、若しくは前記固定化した化学修飾、酵素修飾及び/若しくは活性化した生体分子を、薬剤成分に接触させて、固定化した生体分子-薬剤-抱合体を形成するステップと、
h) 随意的に、ステップ(g) の前記固定化した生体分子-薬剤-抱合体を、緩衝剤で洗浄し、余分な又は未反応の試薬を除去して、精製した固定化した生体分子-薬剤-抱合体を産生するステップと、
i) 前記精製した生体分子-薬剤-抱合体を、前記捕捉樹脂から剥離させるステップと、
を含み、
前記生体分子は、抗体、修飾抗体、又は抗体断片である、方法。 - 請求項1記載の方法において、前記ステップ(a) を省略する、方法。
- 請求項1記載の方法において、前記ステップ(a) を実施する、方法。
- 請求項3記載の方法において、前記ステップ(a) は前記生体分子を還元するステップを含む、方法。
- 請求項3記載の方法において、前記ステップ(a) は前記生体分子を、架橋剤部分と反応させるステップを含み、随意的に、前記架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤(amine-to-sulfhydryl crosslinker)である、方法。
- 請求項5記載の方法において、前記架橋剤部分は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩(SMCC)である、方法。
- 請求項1〜6のうちいずれか一項に記載の方法において、前記ステップ(b) は前記捕捉樹脂とインキュベーションするステップを含み、随意的に、前記インキュベーションは、約5℃〜約50℃の範囲における温度で実施する、及び/又は、随意的に、前記インキュベーションは、約10分〜約18時間の範囲における期間にわたるものである、方法。
- 請求項1〜7のうちいずれか一項に記載の方法において、前記ステップ(c) を省略する、方法。
- 請求項1〜7のうちいずれか一項に記載の方法において、前記ステップ(c) を実施する、方法。
- 請求項9記載の方法において、前記ステップ(c) は前記生体分子を還元するステップを含む、方法。
- 請求項9記載の方法において、前記ステップ(c) は前記生体分子を架橋剤部分と反応させるステップを含み、随意的に、前記架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤(amine-to-sulfhydryl crosslinker)である、方法。
- 請求項11記載の方法において、前記架橋剤部分は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩(SMCC)である、方法。
- 請求項1〜12のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(d) を省略する、方法。
- 請求項1〜12のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(d) を実施し、随意的に、前記洗浄ステップは、緩衝剤で洗い流すステップを含み、随意的に、前記緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)である、方法。
- 請求項1〜14のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(f) を省略する、方法。
- 請求項1〜14のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(f) を実施する、方法。
- 請求項16記載の方法において、前記薬剤成分を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、修飾した又は活性化した薬剤成分を産生する前記ステップは、前記薬剤成分を、架橋剤部分と反応させるステップを含み、随意的に、前記架橋剤部分は、アミン・トゥ・スルフヒドリル基架橋剤(amine-to-sulfhydryl crosslinker)である、方法。
- 請求項17記載の方法において、前記架橋剤部分は、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩(SMCC)である、方法。
- 請求項1〜18のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(g) は、(1) 前記薬剤成分の化学修飾、酵素修飾、又は活性化の実施、並びに(2) 前記固定化した生体分子、又は化学修飾、酵素修飾、及び/若しくは活性化した、固定化した生体分子に対する接触、を同時に行うステップを含む、方法。
- 請求項1〜19のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(g) は、pHが約5〜約8で前記成分を接触させるステップを含む、方法。
- 請求項1〜20のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(h) を省略する、方法。
- 請求項1〜20のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(h) を実施し、随意的に、前記洗浄ステップは緩衝剤で洗い流すステップを含み、随意的に、前記緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)である、方法。
- 請求項1〜22のうちいずれか一項記載の方法において、前記ステップ(i) は、 a) 支持体-生体分子合成物を剥離剤に曝すステップ;及び/又は b) pHを変化させて前記支持体-生体分子合成物を破壊するステップを含む、方法。
- 請求項1〜23のうちいずれか一項記載の方法において、前記捕捉樹脂は、ファブゾーベント(Fabsorbent(登録商標))F1PHF樹脂又はマブゾーベント (Mabsorbent(登録商標))A1P又はA2P樹脂である、方法。
- 化学的に若しくは酵素で修飾した、又は活性化した、固定化した生体分子を合成する方法であって、
a) 随意的に生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、又は活性剤に接触させて、化学修飾、酵素修飾、又は活性化した生体分子を産生するステップと、
b)
i) ステップ(a) を実施するとき、前記ステップ(a) の化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を固定化する、ひいては固定化した、化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップ又は
ii) ステップ(a) を実施しないとき、生体分子を、非ペプチドをベースとするプロテインA、プロテインG、若しくはプロテインLの模倣剤生体分子捕捉部分を有する捕捉樹脂に、前記生体分子を固定化する、ひいては固定化した生体分子を産生するのに適した条件の下で、接触させる接触ステップと、
c) ステップ(b)(i) の前記固定化した化学修飾、酵素修飾、若しくは活性化した生体分子、又はステップ(b)(ii) の前記固定化した生体分子を、化学修飾剤、酵素修飾剤、若しくは活性剤に接触させて、固定化した化学修飾、酵素修飾、及び/又は活性化した生体分子を産生するステップと、
を含み、
前記生体分子は、抗体、修飾抗体、又は抗体断片である、方法。
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