KR101924093B1 - E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 구체적으로 E형 간염 바이러스(hepatitis E virus) 유전자형(genotype) 3 및 4에 특이적으로 증폭하는 네스티드 RT-PCR(nested RT-PCR)용 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 돼지 분변 시료 및 사람 혈청 시료에서 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 감별 진단할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트를 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 진단하는 데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법{Primer set for diagnosis of hapatitis E virus genotype 3 and 4 and method for diagnosing the same}
본 발명은 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 E형 간염 바이러스 유전자형(genotype) 3 및 4 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
과거에는 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus: HEV)에 의한 질병이 인도, 중국 및 기타 개발도상국에서만 발생하는 것으로 인식되었다(Velazquez et al., Epidemic transmission of enterically transmitted non-A, non-B hepatitis in Mexico, 1986-1987. JAMA 263:3281, 1990). 그러나 최근 미국, 일본 및 유럽과 같은 선진국에서도 HEV 환자가 증가하고 있는 실정이다. 또한 우리나라의 일반 국민을 대상으로 혈청 내에 존재하는 HEV 항체를 조사하여 본 결과 약 18%에 해당하는 사람들이 HEV 항체를 보유하고 있는 것으로 확인되어 HEV가 우리나라 국민에게도 심각한 수준으로 감염되어 있다는 것이 증명되었다(Choi et al., Identification of swine hepatitis E virus (HEV) and prevalence of anti-HEV antibodies in swine and human populations in Korea. J Clin Microbiol, 41:3602, 2003).
1997년도에 최초로 미국에서 돼지로부터 HEV가 분리되었고, 사람에서 분리된 HEV와 유전적 연관성을 비교해본 결과 두 바이러스가 매우 유사한 핵산 및 아미노산 서열을 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다(Meng et al., A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc Natl Acad Sci USA 94: 9860, 1997).
이러한 자료를 근거로 하여 사람에서 분리된 HEV를 돼지에 감염시키고, 반대로 돼지에서 분리된 HEV를 영장류에 감염시키는 실험을 수행하여 본 결과 종간 교차감염이 발생함이 증명되었다(Meng et al., Genetic and experimental evidence for cross-species infection by swine hepatitis E virus, J Virol 72: 9714, 1998).
또한, 돼지 및 소와 같은 가축과 개 등의 애완동물뿐만 아니라 야생 들쥐 및 집쥐들의 혈청 내에 E형 간염바이러스에 대한 항체가 매우 높게 존재하는 것이 확인되어 대부분의 동물이 이미 HEV에 감염되어 있음이 밝혀짐에 따라 HEV가 동물을 통하여 사람에게 전파될 가능성이 매우 높은 것으로 인식되고 있다(Arankalle et al., Prevalence of anti-hepatitis E virus antibodies in different Indian animal species, J Viral Hepat 8:223, 2001; Vitral et al., Serological evidence of hepatitis E virus infection in different animal species from the Southeast of Brazil, Mem Inst Oswaldo Cruz 100:117, 2005). 동물 중에서도 특히 돼지와의 접촉을 통해서 감염될 확률이 매우 높을 것으로 추정하고 있는데 그 이유는 돼지와 사람의 HEV가 계통분류적으로 가깝고(Meng et al., A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc Natl Acad Sci USA 94: 9860, 1997), 돼지와 자주 접하는 수의사나 돼지 농장의 인부 및 돼지를 판매하는 사람들의 혈청에서 측정된 HEV 항체가 대조군의 사람들보다 유의성 있게 높은 것으로 증명되고 있기 때문이다.
HEV는 돼지에 감염되어 있을 때에는 임상증상이 없지만 사람에 감염되었을 경우에는 급성 간염 증상을 나타내고 특히 임산부에 감염되었을 경우에는 사망에 이르게도 한다(Madan et al., Detection of hepatitis C and E genomes in sera of patients with acute viral hepatitis and fulminant hepatitis by their simultaneous amplication in PVR. J Gastroenterol Hepatol 13: 125, 1998).
돼지의 경우 주로 발견되는 HEV의 유형은 유전자형(genotype) 3 및 4로 확인되고 있으며, 2005년 국내 급성 간염 환자 중 돼지로부터 분리한 swine HEV와 92.9~99.9%의 상동성을 가지는 유전자형 3형의 HEV 검출이 보고되고 있다. 또한, 2007년에는 국내 급성 간염 환자에서 유전자형 4인 HEV가 처음 검출되었다. 따라서, 국내에 발생 중인 HEV 유전자형 4와 식육에 의해 추가적으로 발생할 위험이 높은 HEV 유전자형 3을 유전적으로 동시에 검출하고 감별진단할 수 있는 방법을 확립하는 것이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 돼지 및 사람에서 발생할 수 있는 HEV 유전자형 3 및 4를 동시에 감별진단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, HEV 유전자형 3 및 4에 특이적으로 증폭하는 네스티드 RT-PCR(nested RT-PCR)용 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 돼지 분변 시료 및 사람 혈청 시료에서 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 검출하여, 본 발명의 프라이머 세트를 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 진단하는 데 유용하게 이용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 E형 간염 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 E형 간염 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한 E형 간염 바이러스 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 8로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제1프라이머 세트; 및 서열번호 11 내지 14로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머, 서열번호 15 내지 19로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제2프라이머 세트를 포함하는, E형 간염 바이러스(hepatitis E virus) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 E형 간염 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 E형 간염 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 시료의 RNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 추출한 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 8로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제1프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)을 수행하는 단계;
3) 상기 단계 3)의 반응물을 주형으로 하고, 서열번호 11 내지 14로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머, 서열번호 15 내지 19로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제2프라이머 세트를 이용하여 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, E형 간염 바이러스 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 E형 간염 바이러스(hepatitis E virus) 유전자형(genotype) 3 및 4에 특이적으로 증폭하는 네스티드 RT-PCR(nested RT-PCR)용 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 돼지 분변 시료 및 사람 혈청 시료에서 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 감별 진단할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트를 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 진단하는 데 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 유전자형(genotype) 3 및 4에 특이적으로 증폭하는 네스티드 RT-PCR(nested Reverse Transcription PCR)용 프라이머 제작을 위한 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4 유전자의 aglignmnet를 모식화한 도이다.
도 2는 네스티드 RT-PCR을 통한 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4 검출을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 8로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제1프라이머 세트; 및 서열번호 11 내지 14로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머, 서열번호 15 내지 19로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제2프라이머 세트를 포함하는, E형 간염 바이러스(hepatitis E virus) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 E형 간염 바이러스는 유전자형 3(genotype 3) 및 유전자형 4(genotype 4) 중 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 "유전자형 3" 및 "유전자형 4"는 두 가지 유전자형 사이에는 대략 81.5 내지 84.1% 염기서열 상동성을 보이며 대략 23.9 내지 26.7% 유전적 차이가 있다.
상기 서열번호 15 내지 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머는 E형 간염 바이러스 유전자형 3을 진단하기 위한 역방향 프라이머인 것이 바람직하다.
상기 서열번호 19로 표시되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머는 E형 간염 바이러스 유전자형 4를 진단하기 위한 역방향 프라이머인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머는 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 네스티드 RT-PCR(nested Reverse Transcription PCR)용 프라이머 세트인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "네스티드 RT-PCR" 또는 "nested RT-PCR"은 Two-step nested RT-PCR 또는 One-step nested RT-PCR일 수 있고, 보다 구체적으로 Two-step nested RT-PCR일 수 있다. 상기 네스티드 RT-PCR은 기존에 바이러스 검출법에 사용되어 왔던 Real time RT-PCR, Two-step RT-PCR 및 one step RT-PCR 등의 문제점을 개선한 진단 방법이다. 상기 Real time RT-PCR은 고가의 장비, 시약 및 숙련된 전문 검사인력을 필요로 하기 때문에 일반 실험실에서 일상적으로 이용하기에는 한계가 있다. Two-step RT-PCR 또는 one-step RT-PCR법은 nested PCR을 수행하지 않아, 검출하고자 하는 바이러스에 대한 민감성 및 특이성이 낮은 단점이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 HE-JA04-1911 strain(E형 간염 바이러스 유전자형 3) 및 JYW-Sap02 strain(E형 간염 바이러스 유전자형 4) 유전자를 기준으로 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4에 특이적으로 증폭하는 네스티드 RT-PCR(nested RT-PCR)용 프라이머를 제작하였다:
1차 RT-PCR 분석용 프라이머로 8개의 External 정방향 프라이머(서열번호 1 내지 8) 및 2개의 External 역방향 프라이머(서열번호 9 및 10); 및
2차 네스티드 PCR 분석용 프라이머로 Internal 정방향 프라이머(서열번호 11 내지 14), E형 간염 바이러스 유전자형 3 유전자 증폭을 위한 4개의 Internal 역방향 프라이머(서열번호 15 내지 18) 및 E형 간염 바이러스 유전자형 4 유전자 증폭을 위한 1개의 Internal 역방향 프라이머(서열번호 19).
또한, 상기 1차 RT-PCR 분석용 프라이머 세트 및 2차 네스티드 PCR 분석용 프라이머 세트를 이용하여 돼지 분변 시료 및 사람 혈청 시료에서 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 감별 진단할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트를 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 진단하는 데 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, E형 간염 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 E형 간염 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, E형 간염 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 "키트"는 상기 프라이머 세트 이외에 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 용기, PCR 반응용 버퍼 및 RNA 중합효소 등을 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
1) 시료의 RNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 추출한 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 8로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제1프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)을 수행하는 단계;
3) 상기 단계 3)의 반응물을 주형으로 하고, 서열번호 11 내지 14로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머, 서열번호 15 내지 19로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제2프라이머 세트를 이용하여 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, E형 간염 바이러스 진단 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 분변, 정액 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 단계 4)의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 방법일 수 있으나, 상기 증폭 산물을 검출할 수 있는 것이면 당업계에 공지된 어느 것이나 사용 가능하고, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 E형 간염 바이러스는 유전자형 3 및 유전자형 4 중 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> E형 간염 바이러스(Hepatitis E virus) 유전자형(genotype) 3 및 4에 특이적으로 증폭하는 네스티드 RT- PCR (nested Reverse Transcription PCR )용 프라이머 세트의 설계
E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 동시에 특이적으로 증폭하는 네스티드 RT-PCR용 프라이머 세트를 설계하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이 NCBI Genebank에 등록된 E형 간염 바이러스 유전자형 3 10종 및 유전자형 4 6종 (총 16종)의 유전자 염기서열 정보를 확보한 후, 유전자 염기서열 분석프로그램 Bioedit(version 7.2.5)을 이용하여 alignment하였다. alignment 시 Genebank Accession No. AB248520로 표시되는 E형 간염 바이러스 유전자형 3 유전자의 5003번째 염기서열을 1 bp 기준으로 하여 align 하였다. 그 다음, 총 16종의 보존된 유전자를 기준으로 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 동시에 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트를 선발하였다.
네스티드 RT-PCR을 위하여, 1차 RT-PCR에서 예상되는 증폭산물이 531 bp의 크기가 되도록 External 정방향 프라이머로 External F1(서열번호 1), External F2(서열번호 2), External F3(서열번호 3), External F4(서열번호 4), External F5(서열번호 5), External F6(서열번호 6), External F7(서열번호 7) 및 External F8(서열번호 8) 프라이머를 제작하고, External 역방향 프라이머로 External R1(서열번호 9) 및 External R2(서열번호 10) 프라이머를 제작하였다. 또한, 2차 네스티드 PCR에서 예상되는 증폭산물이 E형 간염 바이러스 유전자형 3의 경우 358 bp가 되고, E형 간염 바이러스 유전자형 4의 경우 152 bp가 되도록 Internal 정방향 프라이머로 Internal F1(서열번호 11), Internal F2(서열번호 12), Internal F3(서열번호 13) 및 Internal F4(서열번호 14) 프라이머를 제작하고, Internal 역방향 프라이머로 Internal R1-G3(서열번호 15), Internal R2-G3(서열번호 16), Internal R3-G3(서열번호 17), Internal R4-G3(서열번호 18), Internal R1-G4(서열번호 19) 프라이머를 제작하였다. 상기 설계한 프라이머를 도 1 및 하기 [표 1]에 나타내었다.
Name seqeunce (5'→3') 서열번호 종류 Size
(bp)		 Genome
position		 reference strain
(Genebank no.)
External F1 ACGAATGTGGCGCAAGTCTG 1 1차 RT-PCR 531 5003-5022






 HE-JA04-1911
(AB248520)
External F2 ACGAATGTGGCGCAGGTCTG 2
External F3 ACGAATGTGGCTCAAGTCTG 3
External F4 ACGAATGTGGCTCAGGTCTG 4
External F5 ACGAATGTTGCGCAAGTCTG 5
External F6 ACGAATGTTGCGCAGGTCTG 6
External F7 ACGAATGTTGCTCAAGTCTG 7
External F8 ACGAATGTTGCTCAGGTCTG 8
External R1 CAGCTGGGGCAGATCGACGAC 9 5509-5529
External R2 CAGCTGGGGTAGATCGACGAC 10
Internal R1-G3 ATTGTGATACGACGTCGGCGGC 15 2차 nested PCR 358 5400-5420
Internal R2-G3 ATTGTGGTACGACGTCGGCGGC 16
Internal R3-G3 GTTGTGATACGACGTCGGCGGC 17
Internal R4-G3 GTTGTGGTACGACGTCGGCGGC 18
Internal F1 TGGTACATAACCTGATTGGGATG 11 152 5064-5087
Internal F2 TGGTACATAACCTGATTGGCATG 12
Internal F3 TGGTACATAACCTTATTGGGATG 13
Internal F4 TGGTACATAACCTTATTGGCATG 14
Internal R1-G4 TGGCATCTCCATGCACAGAGC 19 5140-5160 JYW-Sap02
(AB161719)
< 실시예 2> 네스티드 RT- PCR (nested Reverse Transcription PCR )을 통한 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4 검출 확인
상기 <실시예 1>에서 제작한 각각의 프라이머 세트를 이용하여 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 동시에 검출할 수 있는지 알아보기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제작한 각각의 프라이머 세트를 이용하여 네스티드 RT-PCR를 수행하였다.
구체적으로, 2016년 포천의 돼지농장에서 돼지의 분변 시료를 채취하고, 2004년부터 2006년까지 서울 근교 병원에서 사람의 혈청 시료를 채취한 후, 시판 pathogen spinTM 추출키트(Intron bio, 한국)를 이용하여 모든 분변 및 혈청 시료의 RNA를 추출하였다. 또한, E형 간염 바이러스 유전자형 3의 양성 대조군으로 이용하기 위하여, E형 간염 바이러스 유전자형 3에 감염된 돼지의 분변 시료를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 RNA를 추출하였다. 또한, E형 간염 바이러스 유전자형 4의 양성 대조군으로 이용하기 위하여, E형 간염 바이러스 유전자형 4에 감염된 돼지의 분변 시료를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 RNA를 추출하였다.
그 다음, 상기 추출한 RNA를 주형으로 하여 상기 <실시예 1>에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 네스티드 RT-PCR을 수행하였다. 먼저, 각 External F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7 및 F8 프라이머를 동량으로 혼합하여 External 정방향 프라이머를 제조하였고, 각 External R1 및 R2 프라이머를 동량으로 혼합하여 External 역방향 프라이머를 제조하였다. 그 다음, 1차 RT-PCR을 위하여 반응액은 총 20 ㎕로서, iNtRON's Maxime RT-PCR PreMix (Cat No. 25131), 각 10 pmol의 External 정방향 프라이머 및 External 역방향 프라이머, 상기 추출한 주형 RNA 10 ng을 첨가하여 구성하고, 하기 [표 2]의 조건으로 RT-PCR을 수행하여 증폭된 유전자 산물을 획득하였다.
PCR 단계 온도(℃) 시간 cycles
역전사(Reverse transcript) 45 30분 1
1차 변성(First denaturation) 95 5분
변성(Denaturation) 95 1분
30
어닐링(Annealing) 50 30초
연장(Extension) 72 45초
최종 연장(Final extension) 72 10분 1
그 다음, 각 Internal F1, F2, F3, 및 F4 프라이머를 동량으로 혼합하여 Internal 정방향 프라이머를 제조하였고, 각 Internal R1-G3, R2-G3, R3-G3 및 R4-G3 프라이머를 동량으로 혼합하여 Internal 역방향 프라이머 및 Internal 역방향-G3 프라이머를 제조하였다. 그 후, 2차 네스티드 PCR을 위하여 반응액은 총 20 ㎕로서, iNtRON's MaximeTM PCR PreMix (Cat No. 25131), 각 10 pmol의 Internal 정방향 프라이머, Internal 역방향 프라이머 및 Internal 역방향-G3 프라이머 및 Internal R1-G4 프라이머, 상기 1차 RT-PCR을 수행하여 증폭한 유전자 산물 10 ng을 첨가하여 구성하고, 하기 [표 3]의 조건으로 2차 네스티드 PCR을 수행하여 증폭된 유전자 산물을 획득하였다.
PCR 단계 온도(℃) 시간 cycles
1차 변성(First denaturation) 95 5분 1
변성(Denaturation) 95 1분 30
어닐링(Annealing) 50 30초
연장(Extension) 72 45초
최종 연장(Final Extension) 72 10분 1
그 다음, 상기 2차 네스티드 PCR을 수행하여 증폭된 유전자 산물을 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 수행하여 분리하였고, Neogreen(Neo science, Seoul, Korea)로 DNA의 염색을 실시하였다. PCR 증폭 여부와 증폭산물의 크기는 Nabi system (Neo science, Seoul, Korea)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 1>에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 돼지의 분변 샘플에서 E형 간염 바이러스 유전자형 3 및 4를 검출할 수 있음을 확인하였고, 사람 혈청 샘플에서 E형 간염 바이러스 유전자형 4를 검출할 수 있음을 확인하였다.
<110> Konkuk University-Industry Cooperation Foundation <120> Primer set for diagnosis of hapatitis E virus genotype 3 and 4 and method for diagnosing the same <130> P2017-026 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External F1 primer <400> 1 acgaatgtgg cgcaagtctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External F2 primer <400> 2 acgaatgtgg cgcaggtctg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External F3 primer <400> 3 acgaatgtgg ctcaagtctg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External F4 primer <400> 4 acgaatgtgg ctcaggtctg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External F5 primer <400> 5 acgaatgttg cgcaagtctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External F6 primer <400> 6 acgaatgttg cgcaggtctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External F7 primer <400> 7 acgaatgttg ctcaagtctg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External F8 primer <400> 8 acgaatgttg ctcaggtctg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External R1 primer <400> 9 cagctggggc agatcgacga c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> External R2 primer <400> 10 cagctggggt agatcgacga c 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal F1 primer <400> 11 tggtacataa cctgattggg atg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal F2 primer <400> 12 tggtacataa cctgattggc atg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal F3 primer <400> 13 tggtacataa ccttattggg atg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal F4 primer <400> 14 tggtacataa ccttattggc atg 23 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal R1-G3 primer <400> 15 attgtgatac gacgtcggcg gc 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal R2-G3 primer <400> 16 attgtggtac gacgtcggcg gc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal R3-G3 primer <400> 17 gttgtgatac gacgtcggcg gc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal R4-G3 primer <400> 18 gttgtggtac gacgtcggcg gc 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal R1-G4 primer <400> 19 tggcatctcc atgcacagag c 21

Claims (11)

  1. 서열번호 1 내지 8로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제1프라이머 세트; 및 서열번호 11 내지 14로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머, 서열번호 15 내지 19로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제2프라이머 세트를 포함하는, E형 간염 바이러스(hepatitis E virus) 진단용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 E형 간염 바이러스는 유전자형(genotype) 3 및 유전자형 4 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, E형 간염 바이러스 진단용 프라이머 세트.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 15 내지 18로 표시되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머는 E형 간염 바이러스 유전자형 3을 진단하기 위한 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는, E형 간염 바이러스 진단용 프라이머 세트.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 19로 표시되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머는 E형 간염 바이러스 유전자형 4를 진단하기 위한 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는, E형 간염 바이러스 진단용 프라이머 세트.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 네스티드 RT-PCR(nested Reverse Transcription PCR)용 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, E형 간염 바이러스 진단용 프라이머 세트.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, E형 간염 바이러스 진단용 조성물.
  7. 제 6항의 E형 간염 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, E형 간염 바이러스 진단용 키트.
  8. 1) 시료의 RNA를 추출하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 추출한 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 8로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머 및 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제1프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)을 수행하는 단계;
    3) 상기 단계 3)의 반응물을 주형으로 하고, 서열번호 11 내지 14로 표시되는 염기서열로 구성된 정방향 프라이머, 서열번호 15 내지 19로 표시되는 염기서열로 구성된 역방향 프라이머로 이루어진 제2프라이머 세트를 이용하여 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, E형 간염 바이러스 진단 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 분변, 정액 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, E형 간염 바이러스 진단 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 단계 4)의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, E형 간염 바이러스 진단 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 E형 간염 바이러스는 유전자형 3 및 유전자형 4 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, E형 간염 바이러스 진단 방법.
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KR100927221B1 (ko) 2000-09-30 2009-11-16 베이징 완타이 바이오로지컬 파마시 엔터프라이즈 코포레이션 리미티드 Ｅ형 간염 바이러스의 폴리펩티드 단편, 그를 이용한 백신조성물 및 진단용 키트

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