KR101249759B1 - 인플루엔자 ａ형 바이러스 및 돼지유래 인플루엔자(신종플루) 바이러스 검출용 프라이머와 이를 이용한 돼지 인플루엔자 검출 및 확진방법 - Google Patents

인플루엔자 ａ형 바이러스 및 돼지유래 인플루엔자(신종플루) 바이러스 검출용 프라이머와 이를 이용한 돼지 인플루엔자 검출 및 확진방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스를 검출하기 위한 인플루엔자 A형 바이러스 공통 PCR 프라이머 및 돼지 유래 인플루엔자(신종플루, A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 검출 특이 PCR 프라이머에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스 및 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스를 동시에 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 정밀 검사방법을 제공한다. 이와 같이, 본 발명에 따른 PCR 프라이머 및 검출 방법은 돼지에서 인플루엔자 A형 바이러스 검출 및 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 조기 진단할 수 있어 백신 및 치료제 처방을 명확하게 할 수 있다.

Description

인플루엔자 Ａ형 바이러스 및 돼지유래 인플루엔자(신종플루) 바이러스 검출용 프라이머와 이를 이용한 돼지 인플루엔자 검출 및 확진방법{PRIMERS FOR DETECTING INFLUENZA A VIRUS AND NEW FLU VIRUS AND METHODS OF TEST AND DIAGNOSIS FOR SWINE INFLUENZA VIRUS USING THE SAME}
본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스와 돼지유래 변종인플루엔자 바이러스(이하 신종플루라 함)의 특정 유전자들을 증폭하기 위한 프라이머(올리고 뉴클레오티드)와 돼지에서 이를 확진 검사하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 돼지에서 유행하는 인플루엔자 A형 바이러스(H1N1, H1N2, H3N2)와 최근 돼지에서 유래되어 사람에게 감염이 되는 것으로 알려진 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 쉽고 빠르게 감별하여 검사하는 방법을 제공한다.
인플루엔자 바이러스는 올소믹소비리데(Orthomyxoviridae)에 속하며 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS의 여덟 개의 네가티브 센스 RNA 단편을 갖고 있는 바이러스이다. 이 중 외피 단백질을 이루고 있는 두개의 단백질 헤마글루티닌(hemagglutinin: 이하 "HA"라 약칭함)과 뉴라미니다아제(neuraminidase: 이하 "NA"라 약칭함)는 면역항체를 유도하는 중요한 면역원이며, 이들은 항원의 대/소변이(antigenic shift and drift) 과정을 통해 변형되는 특징을 갖고 있다.
인플루엔자 바이러스는 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체로서 NP(nuleo-capsid)와 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분되며, 이 중 A형은 다시 HA 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형으로, NA 단백질의 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류된다. 사람에서는 인플루엔자 A, B, C형 바이러스가 모두 감염될 수 있으며, 이 중 A형은 H1N1과 H3N2의 아형이 주로 감염되는 것으로 알려져 있다. 또한 돼지를 포함한 포유류 및 조류는 인플루엔자 A형만이 감염되는 것으로 알려져 있고, 특히 돼지의 경우는 H1N1, H1N2, H3N2의 아형이 주로 감염되는 것으로 보고되어 있다.
최근 사람에서는 발견된 적이 없는 돼지 유래 신종 인플루엔자 A형(H1N1, 신종플루)바이러스가 멕시코를 시작으로 미국, 캐나다를 포함하여 전 세계적으로 발생하였고 돼지 유래 신종 인플루엔자 A형 바이러스의 인체 감염이 전 세계적으로 확대되어 국내에도 많은 사람들이 감염되고 있다. 이에 신종플루 바이러스를 조기 진단하여 해당 백신 및 치료제 처방을 명확히 할 수 있는 진단방법이 요구되고 있다. 또한 2009년 말에는 사람으로부터 돼지로 역 감염된 보고들이 나오고 있다. 이는 돼지 내에서 바이러스가 재조합되어 독성이 강한 바이러스로 변하여 다시 사람으로 감염되는 2차 감염의 위험을 가지게 된다. 따라서 국내 양돈장의 돼지 인플루엔자 A형 바이러스감염실태를 신속히 파악하고 돼지를 통한 인체로의 재 전파 가능성 및 재조합 바이러스 생성을 사전에 차단하기 위해 돈군 개념으로 신속하게 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 및 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 진단할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
현재 신종플루를 검출하는 방법은 WHO에서 권고하는 RT-PCR 및 realtime RT-PCR 방법들을 주로 사용하고 있으며, 국내에서도 이를 기준으로 유전자 검출 키트를 제작하고 상용화하여 사람 감염에 대해 병원이나 연구소 등에서 진단목적으로 사용하고 있다. WHO에서 권고하는 검출 방법은 인플루엔자 A형 바이러스를 이루고 있는 외피 단백질 중 HA 단백질에 해당하는 HA 유전자가 과거 사람에게서는 발견되지 않고 돼지에서 주로 발견되는 유전자 형태이기 때문에 인체 감염 인플루엔자 A형 바이러스 중 돼지유래 HA 유전자가 발견되면 이를 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 감염으로 진단하고 있다.
하지만, 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스가 돼지로 다시 감염되는 경우 돼지에서는 사람과 달리 인플루엔자 A형, 특히 H1N1, H3N2 바이러스에 감염되어 있는 경우가 많아 현재는 돼지에서 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 감별하여 진단할 수 있는 방법은 없다. 따라서 돼지와 돼지 또는 돼지와 사람으로의 역 감염 위험을 막기 위해서는 돼지에서의 인플루엔자 A형 바이러스와 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 정확하게 감별하는 검출방법이 요구되고 있다.
현재 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스와 계절 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 구분을 할 수 있는 연구들이 진행되고 있으며 최근에는 realtime RT-PCR을 이용하여 M 유전자 혹은 NA 유전자의 특이 염기서열을 이용하여 구분할 수 있는 방법등이 문헌으로 보고되고 있다(참고문헌: Michael J Carr et al, J. Clin. Virology 45, pp 196-199, 2009; David M whiley et al, J. Clin. Virology 45, pp 203-204, 2009; Alessio Lorusso et al, J. Virological Method 164, pp 83-87, 2010). 하지만 이 기술들은 realtime이라는 고가의 장비를 사용하여야 하며, 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스와 일반적인 계절 인플루엔자 바이러스의 검출을 위해 각각의 Single RT-PCR을 진행하여야 하므로 편의성 및 경제성이 다소 떨어지는 문제점을 가지고 있다. 따라서 한번의 시험으로 돼지의 일반적인 계절 인플루엔자 A형 바이러스와 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 동시에 검사할 수 있으며, 한 튜브에서 1-step으로 반응하며 특별한 고가의 장비 없이 기존의 유전자증폭 장비를 사용하여 쉽게 검사 할 수 있는 기술이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 상기와 같이 돼지에서 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스와 전통적인 돼지 인플루엔자 A형 바이러스를 감별함에 있어 상존해 있던 종래 문제점 및 요구사항을 해결하기 위한 것으로서, 다음과 같이 신속하고 정확한 감별 검사방법을 제공하여 기술적인 과제들을 해결하는 데에 있다.
1) 계절 인플루엔자를 포함한 돼지에서 유행하는 인플루엔자 A형 바이러스를 모두 검출하는 유전자 프라이머들과 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 유전자에 특이한 프라이머들을 제공한다.
2) 또한 정확한 확진을 위하여 인플루엔자 A형 바이러스의 HA와 NA 유전형 검사를 위한 프라이머들을 제공한다.
3) 양돈장의 조사를 위해서는 신속한 검출방법이 요구되므로 인플루엔자 A형 바이러스 공통 유전자 프라이머, 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스 특이 프라이머를 모두 포함한 복합역전사중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR, "이하 '복합 RT-PCR' 이라함) 검출방법을 제공한다.
4) 아울러, 검출된 바이러스의 최종적인 확진을 위한 HA(H1과 H3), NA(N1과 N2)의 유전자를 각각 동시 증폭하여 확인할 수 있는 복합 RT-PCR 검출방법을 제공한다.
5) 최종적으로 위의 검출방법을 사용하여 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스의 검출과 확진을 위한 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 M(matrix) 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 포함하는 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스의 M(matrix) 유전자 증폭을 위한 특이 프라이머 세트, 서열번호 5, 6 및 7의 염기서열을 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 HA 유전형 구분을 위한 프라이머 세트, 서열번호 8, 9 및 10의 염기서열을 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 NA 유전형 구분을 위한 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명에서, 상기 프라이머는 표 1과 같이 명명된다.
또한, 본 발명은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용한 인플루엔자 바이러스 및 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 검출방법에 있어서, 상기 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR을 수행함에 의해 인플루엔자 바이러스 및 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 구별하여 확인하며, 확진을 위해 HA 유전형과 NA 유전형을 확인하여 바이러스 유형을 정밀검사하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 M 유전자 증폭을 위한 프라이머, M 유전자에서 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스에 특이적인 프라이머를 사용한 복합 RT-PCR, HA 유전자에서 H1와 H3 유전자의 감별이 가능한 프라이머를 사용한 복합 RT-PCR 및 NA 유전자에서 N1과 N2 유전자의 감별이 가능한 프라이머를 이용한 복합 RT-PCR 방법을 사용하였다. 그러나 이들 프라이머는 복합 RT-PCR에서만 사용가능한 것으로 국한되는 것은 아니며 Single RT-PCR에서도 사용가능하다
상술한 바와 같이, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스 및 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 신속하고 정확한 감별 검출방법을 제공함으로써, 돼지에서 전통적인 인플루엔자 A형 바이러스와 최근 문제시 되고 있는 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 동시에 검출하여 감별할 수 있는 새로운 유전자 프라이머와 검출방법을 제공할 수 있게 되었다. 종래 개별 시험에 소요되었던 시간과 비용을 현격하게 줄이게 되어 신속, 정확하게 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 검출할 수 있게 되었다.
또한 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스가 돼지에 감염되는 경우 전통적인 돼지 인플루엔자 바이러스와 감별하는데 있어 시간과 비용을 현격하게 줄일 수 있게 되었다. 이를 통하여 국내 돼지 간 전파 또는 사람으로의 역 감염을 효과적으로 관리할 수 있는 검출방법을 제공하게 되어 공중보건학적으로 크게 기여할 수 있으며, 양돈산업에 미치는 각종 경제적 피해를 최소화하는데 크게 기여하는 효과가 있다.
도 1은 다양한 돼지 감염 인플루엔자 A형 바이러스를 모두 검출해 내는 공통 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR 반응을 시행한 전기영동 사진이다.
도 2는 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스의 M 유전자에서 고안한 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 특이 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR 반응을 시행한 전기영동 사진이다.
도 3은 인플루엔자 A형 바이러스 공통 및 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 특이 프라이머 세트를 혼합한 복합 RT-PCR 반응(SIV M / New Flu MP RT-PCR)을 시행한 전기영동 사진이다.
도 4는 SIV M / New Flu MP RT-PCR에 대한 검출민감도를 확인한 전기영동 사진이다.
도 5는 돼지 감염 병원성 바이러스와 건강한 검체를 대상으로 SIV M / New Flu MP RT-PCR을 수행하여 반응에 대한 특이도를 확인한 전기영동 사진이다.
도 6은 인플루엔자 A형 바이러스에서 HA 유전자의 유전형을 구분하기 위한 복합 RT-PCR 반응(SIV HA MP RT-PCR)을 시행한 전기영동 사진이다.
도 7은 인플루엔자 A형 바이러스에서 NA 유전자의 유전형을 구분하기 위한 복합 RT-PCR 반응(SIV NA MP RT-PCR)을 시행한 전기영동 사진이다.
도 8은 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 감염의 확진을 위한 시험 및 판독 순서도이다.
제 1 단계의 SIV M / New flu MP RT-PCR은 인플루엔자 A형 바이러스와 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 동시에 검출하는 복합 RT-PCR이고, 제 2 단계의 SIV HA MP RT-PCR은 인플루엔자 A형 바이러스의 HA 유전형을 검출하는 복합 RT-PCR, 제 3 단계의 SIV NA MP RT-PCR은 인플루엔자 A형 바이러스의 NA 유전형을 검출하는 복합 RT-PCR이다. 제 1 단계는 1차 검출 단계이다. 제 2 및 3 단계는 1차 검출 결과를 확진하는 확진단계로 그 순서는 바뀌어도 동일한 검출결과를 얻는다.
본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스 및 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 유전자 검사방법은 다음과 같은 실시예를 통하여 구체화될 수 있다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 이하, 첨부된 도면 및 서열목록을 참조하여 본 발명을 설명한다.
[실시예 1] 인플루엔자 A형 바이러스 공통 검출용 프라이머 및 신종플루(A/ Korea /01/2009( H1N1 )) 바이러스 특이 프라이머의 제작
본 발명에서 제작하여 사용하는 고유한 유전자 증폭시약용 프라이머들은 표 1에서 보는 바와 같다. 각 프라이머들은 하기와 같이 본 발명에서 고안되고 제작되었다. 공개된 16 종류의 돼지 감염성 인플루엔자 A형 바이러스의 아형들(NCBI 등록번호, EU798798, EU798800, EU798810, NC002016, CY034045, CY005814, CY014649, DQ107453, L25831, DQ107475, CY005828, DQ067438, CY014672, CY014680, CY021302, CY014695)과 3 종류의 신종플루 바이러스(NCBI 등록번호, GQ131025, FJ969513, GU324342)의 M 유전자 서열을 비교하였고, 이로부터 모든 인플루엔자 A형 바이러스에서 상동성이 높은 M 유전자 부위로부터 공통되는 프라이머 염기서열 M-com-F1과 M-com-R1을 고안하여 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 공통 검사용 프라이머를 제작하였다. 또한 상기한 염기서열 비교 분석결과로부터 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 특이 프라이머 M-NF-F2와 M-NF-R2를 제작하였다. 이외에 확진을 위한 HA 유전형 검사 프라이머 HA-F4, HA1-R4 및 HA3-R5을 유사한 방법으로 고안하여 제작하였고, 또한 NA 유전형 검사 프라이머 NA-F6, NA1-R6 및 NA2-R7를 제작하였다. 표 1은 프라이머들(M-com-F1, M-com-R1, M-NF-F2, M-NF-R2, HA-F4, HA1-R4, HA3-R5, NA-F6, NA1-R6, NA2-R7)에 대한 서열번호(1 내지 10)의 염기서열을 제공한다.
인플루엔자 A형 바이러스 공통, 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 특이, HA 유전형 특이 및 NA 유전형 특이 프라이머의 염기서열
서열번호 명칭 염기서열(5`-3`) 길이
1 M-com-F1 CTTYTAACCGAGGTCGAAACG 21mer
2 M-com-R1 TTGGACAAANCGTCTACGCTGC 22mer
3 M-NF-F2 GGAGGTGTCACTAAGCTATTCA 22mer
4 M-NF-R2 CCCAATGATATTTGCTGCAATG 22mer
5 HA-F4 ATACGACTAGCAAAAGCAGGGG 22mer
6 HA1-R4 CCAGCAATGTTACATTTMCCCA 22mer
7 HA3-R5 CACATCATAAGGGTAACAGTTG 22mer
8 NA-F6 AGCAAAAGCAGGAGTTTAAAATGAAT 26mer
9 NA1-R6 GCACTTGCTGACCAAGCRACTGA 23mer
10 NA2-R7 CATAAGGTTCTCTTGTYACCCA 22mer
[실시예 2] 인플루엔자 A형 바이러스 공통 검출용 프라이머를 이용한 RT - PCR
상기 실시예 1에서 제작된 각 프라이머 중 인플루엔자 A형 바이러스에 대해서는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR 반응을 실시하였다. 인플루엔자 바이러스는 NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control)로부터 분양받은 인플루엔자 A형 바이러스 백신주(A/H1형: A/Brisbane/59/2007, A/H3형: A/Uruguay/716/2007) 및 국립수의과학검역원에 보관중인 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 국내 분리주(신종플루 포함)를 사용하였다. 바이러스 RNA는 RNeasy Mini kit(Qiagen, CA, USA)을 이용하여 추출하였다. 상기 추출된 RNA 5를 상기 프라이머를 포함하여 Qiagen사의 OneStep RT-PCR kit을 사용하여 최종 부피 25가 되도록 조정한 후 RT-PCR을 수행하였다. 역전사(reverse transcription) 반응은 50 30분간 반응한 뒤, 95 15분간 초기 PCR 활성단계(Initial PCR activation step)를 거치고, 94로 20초간 변성(denaturation)하고, 55로 20초간 어닐링(primer annealing)하고, 72로 30초간 확장(extension)과정을 35회 반복하여 DNA를 증폭하였다(도 1 참조). 증폭된 산물 5ul를 취하여 로딩 다이(loading dye)와 섞은 뒤 1.5% 한천 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 1ug/ml 농도의 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide, sigma) 용액에서 15분간 염색한 후 자외선 하에서 DNA 크기를 확인하였다. 도 1은 인플루엔자 A형 바이러스 백신주 및 국내 분리주에 대한 RT-PCR 반응 결과 사진이다. 도 1에서 확인되는 바와 같이 모든 시료에 대해 237bp의 인플루엔자 A형 바이러스에 특이적인 산물을 확인할 수 있으며 비특이 반응은 나타나지 않았다. 도 1에서 M은 100bp DNA 사이즈마커(size marker)이며, lane 1은 백신주 H1N1형(A/Brisbane/59/2007), lane 2는 백신주 H3N2형 (A/Uruguay/716/2007), lane 3, 4 및 5는 각각 돼지에게서 분리한 국내 분리주 H1N1, H1N2 및 H3N2형이고, lane 6은 국내 돼지에서 분리한 신종플루(H1N1)와의 반응결과이며, lane 7 및 8은 각각 H2O를 넣은 Negative control 1 및 2의 반응 결과이다.
[실시예 3] 신종플루 (A/ Korea /01/2009( H1N1 )) 바이러스 M 유전자 특이 프라이머를 이용한 RT - PCR
상기 실시예 1에서 제작된 각 프라이머 중 신종플루 바이러스의 M 유전자에 대해서는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR 반응을 실시하였다. RT-PCR 실험 방법 및 반응 시료는 실시예 2 에서와 같은 방법으로 실험을 진행하여 반응 결과를 확인하였다(도 2 참고). 도 2에서 확인되는 바와 같이 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스에 대해서만 452bp의 특이적인 산물을 확인할 수 있으며 다른 아형과 음성시료에 대해서는 비특이 반응 없이 모두 음성결과를 확인하였다.
[실시예 4] 인플루엔자 A형 바이러스 및 신종플루 (A/ Korea /01/2009( H1N1 )) 바이러스 동시 검출용 복합 RT - PCR
상기 실시예 1에서 제작된 프라이머 인플루엔자 A형 바이러스 공통 프라이머인 서열번호 1 및 2, 그리고 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스 특이 프라이머인 서열번호 3 및 4의 프라이머를 모두 함께 사용한 복합 RT-PCR (이하 SIV M / New Flu MP RT-PCR 이라 함) 시약을 최적하고 반응을 실시하였다.
서열번호 1, 2, 3 및 4의 프라이머를 모두 함께 포함하고 있는 SIV M / New Flu MP RT-PCR은 실시예 2에서와 같은 방법으로 반응을 진행한 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스에 대해서만 452bp의 특이적인 산물을 확인할 수 있으며 다른 아형을 포함하여 인플루엔자 양성이면 237bp의 산물을 모두 확인할 수 있었다. 또한 음성시료에 대해서는 비특이 반응은 없었으며 모두 음성으로 판정되었다.
[실시예 5] SIV M / New Flu MP RT - PCR 의 검출한계 측정
상기 실시예 4에서 제작된 SIV M/New Flu MP RT-PCR의 검출한계를 확인하기 위하여 표준 RNA 시료를 제작하였다. 표준 RNA 시료는 국내 돼지 분리주(신종플루, A/Korea/01/2009(H1N1))의 M 유전자의 full gene을 WHO 권고 시퀀싱 프라이머를 이용해 RT-PCR 하여 얻은 1,063bp 크기의 결과물을 Promega사 pGEM-T vector에 넣어 클로닝하고, 클로닝된 vector와 Promega사 Ribomax large scale RNA production system-T7 kit를 이용해 신종플루 M 유전자 영역의 RNA를 합성한 후 spectrophotometer를 이용해 정량한 뒤 copy수로 환산하여 표준 RNA 시료를 완성하였다. 표준 RNA 시료는 1/10씩 계단 희석하여 108 ~ 100 개수의 RNA 시료를 제조한 뒤 각각을 SIV M / New Flu MP RT-PCR 반응하여 결과를 확인하였다(도 4). 도 4는 실시예 4에서 제작된 SIV M / New Flu MP RT-PCR에 대해 표준 RNA 시료를 이용해 검출한계를 확인한 결과이다. Lane 1 내지 9까지는 각각에 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스 M 유전자에 대한 합성 RNA 시료를 108 내지 100 개수로 희석하여 각각의 시료로 사용한 것이고, lane 10은 음성시료로 H2O를 넣고 반응하여 얻은 결과이다.
검사 결과 lane 7 (102copy) 까지 양성을 확인할 수 있었고, 인플루엔자 A형 바이러스 모두에서 공통의 237bp 밴드와 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스에서는 공통밴드와 452bp의 특이밴드를 모두를 확인할 수 있었으며, 음성시료에 대해서는 반응하지 않음을 확인하였다. 이를 통해 검출 민감도가 100 copy수 까지 확인 가능한 민감도가 우수한 복합 RT-PCR임을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] SIV M / New Flu MP RT - PCR 의 특이도검사
상기 실시예 4에서 제작된 SIV M / New Flu MP RT-PCR의 특이도를 확인하기 위해 돼지 호흡기 질병을 포함한 주요 질병 원인체 바이러스 및 돼지 음성조직을 이용하여 특이도를 확인하였다(도 5 참고). 도 5는 실시예 4에서 제작된 검사시약이 다른 유사 질병 원인체 PRRSV, EMCV, JEV, CSFV, BVDV, ADV, PPV, PCV2와 정상 정액, 혈액, 폐조직을 포함한 돼지유래 정상시료에서 SIV M / New Flu MP RT-PCR 반응을 실시한 검출결과이다. 모두 비특이 반응 없이 음성으로 판정되어 특이도가 우수함을 확인할 수 있었다.
[실시예 7]인플루엔자 HA 유전형 검사용 복합 RT - PCR
상기 실시예 1에서 제작된 HA 유전형 구분용 프라이머 서열번호 5, 6 및 7의 프라이머를 사용하여 HA1 및 HA3 형에 대한 복합 RT-PCR (이하 SIV HA MP RT-PCR 이라 함) 시약을 최적화하여 사용하였다.
실시예 2에서와 같은 방법으로 SIV HA MP RT-PCR 반응을 실시하여 그 결과를 확인하였다(도 6 참고). 도 6에서 확인되는 바와 같이 백신주, 국내분리주, 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스에 대해 HA1 유전형인 Lane 1, 3, 4, 6은 266bp의 특이적인 산물을 확인할 수 있으며 HA3 유전형인 Lane 2, 5는 391bp의 특이적인 산물을 확인할 수 있었고, 음성시료에 대해서는 반응 없이 음성결과를 확인하였다.
[실시예 8] 인플루엔자 NA 유전형 검사용 복합 RT - PCR
상기 실시예 1에서 제작된 NA 유전형 구분용 프라이머 서열번호 8, 9 및 10의 프라이머를 사용하여 NA1과 NA2 형에 대한 복합 RT-PCR(이하 SIV NA MP RT-PCR 이라 함) 시약을 최적화하였다.
실시예 2에서와 같은 방법으로 SIV NA MP RT-PCR 반응을 실시하여 그 결과를 확인하였다(도 7 참고). 도 7에서 확인되는 바와 같이 백신주, 국내분리주, 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스에 대해 NA1 유전형인 Lane 1, 3, 6은 564bp의 특이적인 산물을 확인할 수 있으며 NA2 유전형인 Lane 2, 4, 5는 384bp의 특이적인 산물을 확인할 수 있었고, 음성시료에 대해서는 반응 없이 음성결과를 확인하였다.
[실시예 9] 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 및 신종플루(A/ Korea /01/ 2009(H1N1)) 바이러스 감염 확진을 위한 검출방법 개발
상기 실시예 1에서 제작된 프라이머를 사용하여 실시예 4, 7 및 8로부터 돼지 인플루엔자 A형 바이러스 및 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 감염 여부를 확진하는 검출방법을 개발하였다(도 8 참고). 실시예 1에서 제작된 프라이머들을 사용하여 실시예 4, 7, 및 8에 서와 같은 각각의 검출시약을 제조한다. 제 1 단계는 1차 screen 단계로서 돼지 시료를 대상으로 실시예 4에서 제조된 SIV M / New Flu MP RT-PCR을 사용하여 도 8과 같이 돼지 인플루엔자 A형 바이러스의 M 유전자와 이중 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스의 M 유전자를 지닌 시료들을 모두 검출할 수 있다. 제 2 차 screen 단계는 확진하는 단계로 제 2 단계 및 제 3 단계로 이루어 진다. 제 2 단계에서는 인플루엔자 A형 바이러스를 지닌 시료들로부터 HA의 유전자형을 H1, H3 및 그외 형으로 구분하여 검출하는 단계로 실시예 7과 같이 SIV HA MP RT-PCR 반응을 실시하여 도 8과 같이 HA 유전자가 H1형인 인플루엔자 A형 바이러스와 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 지닌 시료를 검출해 낼 수 있다. 제 3 단계에서는 NA 유전자의 유전자형 중에 N1과 N2 및 그외 형으로 구분하는 단계로 실시예 8과 같이 SIV NA MP RT-PCR을 사용하여 제 2 단계에서 검출된 시료로부터 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 지닌 시료를 검출할 수 있게 된다. 요약하면, M 유전자를 사용하여 실시예 4에 따라 인플루엔자 및 신종플루 바이러스를 동시검사를 통하여 확인하고, 실시예 7 및 8에서와 같이 HA 및 NA 유전형을 검사하여 최종 확진할 수 있도록 하였다. 계절인플루엔자(H1N1, H1N2, H3N2), 신종플루(H1N1) 및 기타 변이 바이러스도 검출이 가능함을 알 수 있었다(도 8 참고). 또한 상기한 제 2 및 3단계는 그 순서를 바꾸어도 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 지닌 시료를 검출하는 동일한 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 1 내지 10의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A형 바이러스 및 돼지 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 검출용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항의 프라이머 세트 중에서 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 사용하고 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하는 것을 특징으로 하는 돼지 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 검출방법.
  5. 제 1 항의 프라이머 세트 중에서 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 사용하고 역전사 중합효소연쇄반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A형 바이러스 및 돼지 신종플루(A/Korea/01/ 2009(H1N1)) 바이러스 동시 검출방법.
  6. 제 1 항의 프라이머 세트 중에서 서열번호 5, 6 및 7의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 사용하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A형 바이러스 HA 유전자의 H1과 H3 유전형 감별방법.
  7. 삭제
  8. 제 1 항의 프라이머 세트를 사용하여 돼지 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 검출하여 확진하는 방법에 있어서,
    인플루엔자 M 유전자를 사용하여 제 5 항에 의하여 인플루엔자 A형 바이러스 및 돼지 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스를 동시에 검출하는 제 1 단계;
    상기 제 1 단계에서 인플루엔자 A형 바이러스가 검출된 것을 제 6 항에 의하여 HA 유전자의 유전형이 H1 또는 H3 인지 검출하는 제 2 단계; 및
    상기 제 2 단계에서 HA 유전자의 유전형이 H1으로 검출된 것을 제 1 항의 프라이머 세트 중에서 서열번호 8, 9 및 10의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 사용하여 NA 유전자의 유전형이 N1 또는 N2 인지 검출하는 제 3 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 돼지 신종플루(A/Korea/01/2009(H1N1)) 바이러스 확진방법.
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