CN104789534B - 一种杂交瘤、单克隆抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种杂交瘤、单克隆抗体及其用途，该杂交瘤为杂交瘤细胞NC‑4D12 CCTCC No：C2014241，该抗体是由杂交瘤细胞NC‑4D12 CCTCC No：C2014241分泌的单克隆抗体。本发明抗体是将研磨黑尾叶蝉虫体所得的上清作为免疫原，利用单克隆抗体制备技术获得的针对黑尾叶蝉特异的单克隆抗体；该抗体被用于黑尾叶蝉的鉴定、动态监测以及研究捕食性天敌对其的控制作用；本发明通过BaL b/c小鼠腹腔注射单抗细胞株，即可获得大量的该单克隆抗体，与多克隆抗体相比，具有纯度高，专一性强，重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种杂交瘤、单克隆抗体及其用途，具体地说是涉及一种能识别黑尾叶蝉的单克隆抗体。
背景技术
黑尾叶蝉属于同翅目，叶蝉科，是我国和亚洲其它地区的主要水稻害虫之一。黑尾叶蝉取食和产卵时刺伤寄主茎叶，破坏输导组织，受害处呈现棕褐色条斑，可致植株发黄或枯死，一年可发生4～7代，在福建，广东等省冬季无滞育期。在其他地区，多以3～4龄若虫和少数成虫在冬季作物或杂草上过冬。成虫多在叶鞘内产卵，若虫前期喜群集，迁移性不大，常栖息于茎干下部或叶背面。老龄若虫转株为害，受惊动时则迅速横行躲避或跳落水面逃逸。成虫趋光性强，并有趋绿习性，因而在生长旺盛，发棵嫩绿的水稻田块里，成虫迁入量多，危害严重。
本发明公开的单克隆抗体结合酶联免疫吸附试验（ELISA），由于具有灵敏度高、特异性强、适于大量检测田间黑尾叶蝉的特点，为应用该抗体进行黑尾叶蝉的鉴定，田间黑尾叶蝉的发生动态监测及天敌对黑尾叶蝉的捕食作用研究奠定基础。
发明内容
本发明提供了一种杂交瘤细胞NC-4D12，已于2014年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC）（中国武汉市武汉大学），保藏号：CCTCC No：C2014241。
一种杂交瘤，该杂交瘤为杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No：C2014241。
一种单克隆抗体，该抗体是由杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No：C2014241分泌的单克隆抗体。
作为优选，所述杂交瘤细胞NC-4D12由下述方法制备得到：用抗原蛋白免疫BaL b/c小鼠，然后BaL b/c小鼠脾细胞与SP 2/0细胞在50%聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA 检测，筛选出阳性且不与稻田其他昆虫和蜘蛛的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法克隆至能稳定分泌单克隆抗体的细胞株NC-4D12，即获得单克隆抗体杂交瘤细胞；其中，所述抗原蛋白来自研磨黑尾叶蝉虫体所得的上清液。
作为优选，所述抗原蛋白免疫BaL b/c小鼠的具体步骤为：选取10～12周龄的健康BaL b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200μL；3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200μL；再过3周后用不加佐剂的抗原免疫。
作为优选，所述融合具体为：最后一次免疫后3天，收集抗血清，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合；采用聚乙二醇作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP 2/0，整个过程在无菌条件下操作，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心后，吸尽上清液，弹匀细胞；将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，在1min内加入50%PEG 0.7mL，静止1min后，逐渐加入已经预温至37℃的RMPI-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用，离心后弃上清液。
作为优选，所述HAT培养具体为：将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5% CO2温箱中在37℃下培养；3天后换一半HAT培养基，5天后再换一半HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养。
保藏编号CCTCC No：C2014241的杂交瘤细胞分泌得到的单克隆抗体用于识别黑尾叶蝉的应用。
本发明抗体是将研磨黑尾叶蝉虫体所得的上清液作为免疫原，利用单克隆抗体制备技术获得的针对黑尾叶蝉特异的单克隆抗体；该抗体被用于黑尾叶蝉的鉴定、动态监测以及研究捕食性天敌对其的控制作用；本发明通过BaL b/c小鼠腹腔注射单克隆抗体细胞株，即可获得大量的该单克隆抗体，与多克隆抗体相比，具有纯度高，专一性强，重复性好等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
试验动物：8～12周龄BaL b/c小鼠（由浙江中医药大学实验动物中心提供），试剂：福氏完全佐剂和不完全佐剂（购自Sigma 公司）。
实施例1
一种单克隆抗体，该抗体是由杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No：C2014241分泌获得，适于黑尾叶蝉样本检测的单克隆抗体。
杂交瘤细胞的制备，具体包括以下步骤：
（1）抗原的准备：将黑尾叶蝉供水饥饿1d后，置于-20℃冰箱中冰冻致死；取出称重后，加入少量0.01moL/L的PBS，研磨后加入适量的PBS后离心（4500r/min，15min），分离上清液后低温离心（15000r/min，10min），将上清液定容至0.05g/mL后用紫外分光光度仪测定抗原蛋白含量；将抗原液少量分装后-80℃冰冻保存；在临用前取少量于-20℃保存；
（2）选取10～12周龄的健康BaL b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200μL；3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200μL；再过3周后用不加佐剂的抗原免疫；最后一次免疫后3天，收集抗血清（多克隆抗体），在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合；
（3）采用聚乙二醇（PEG-4000）作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP 2/0。整个过程在无菌条件下操作；将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心后（1000r/min，2min），吸尽上清液，以手指弹匀细胞；将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，在1min内缓慢加入细胞融合剂（50%PEG）0.7mL；静止1min后，逐渐加入已经预温至37℃的RMPI-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用；离心后（1000r/min，2min）弃上清液；将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5%CO2温箱中在37℃下培养；3天后换一半HAT培养基，5天后再换一半HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养，此时亲本均已死去，如有细胞生长即为杂交瘤细胞；
（4）当小孔中细胞生长到覆盖孔底四分之一面积时，即可吸取上清液用间接ELISA检测抗体；选出强阳性且不与稻田其他昆虫和蜘蛛的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法进行多次克隆化培养，直至所有孔均为阳性为止，获得分泌单克隆抗体的细胞株NC-4D12，细胞株NC-4D12进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存；
（5）取8周龄左右BaL b/c小鼠，腹腔注射0.3 mL降植烷，7～10天后腹腔注射5～10×105个杂交瘤细胞，注射后7～10天可见小鼠腹腔明显膨胀，取腹水，2000r/min离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水；饱和硫酸铵盐析法纯化单克隆抗体，-80℃保存；NC-4D12细胞株制备得单抗，即为可专一识别黑尾叶蝉的单克隆抗体。
实施例2
该单克隆抗体腹水效价检测实验
采用间接ELISA方法测定抗体的效价。将黑尾叶蝉抗原用包被液稀释1000倍后包被整块酶标板，4℃过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔，PBST洗涤三次后用脱脂奶封闭75min。将单克隆抗体NC-4D12倍比稀释加入包被孔，每孔加100μL，37℃，1h，PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化酶标记兔抗鼠（Sigma公司）100μL孔，37℃ 1h，PBST洗涤后加底物显色，2mol/L的H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD值，以与阴性比值大于2为阳性测定单抗腹水效价。
经检测，确定NC-4D12的效价为稀释1.0×106倍，确定NC-4D12稀释20000倍用于其他检测实验。
实施例3
该单克隆抗体的特异性检测实验
检测对象分别是黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps、褐飞虱NiLaparvata Lugens（BPH）和白背飞虱SogateLLa furvifera Horvath（WBPH）的卵、各龄若虫、雄成虫、雌成虫及稻田其它常见昆虫及天敌：二化螟ChiLo suppressaLis；三化螟Tryporyza incertuLas；电光叶蝉ReciLia dorsaLis；摇蚊Chironomidae；灰橄榄长角跳虫Entomobrya griseooLivata；拟水狼蛛Pirata subpiraticus；食虫瘤胸蛛UmmeLita insecticeps；猫蛛Oxyopidae；锥腹肖蛸Tetragnatha maxiLLosa；鳃哈莫蛛Harmochirus brachiatus；黑肩绿盲蝽Cytorrhinus Lividipennis；蟹蛛Thomisus；八斑鞘腹蛛Theridonn octomacutatum Boes；灰飞虱LaodeLphax striateLLus；拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannuLata等，将上述抗原用包被液稀释至0.05g/L后包被酶标板。以包被液为空白对照，用间接ELISA法检测抗体的特异性，其中抗体的稀释倍数为1：20000，酶标二抗的稀释倍数为1：3000。经上述检测该抗体和上述昆虫及捕食性天敌的抗原不发生交叉反应，但该抗体与黑尾叶蝉抗原反应强烈，可以明显判别是否存在黑尾叶蝉抗原。
实施例4
该单克隆抗体的灵敏度检测实验
采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。将黑尾叶蝉抗原用包被液倍比稀释为1：50×20～1：50×28 ，包被在酶标板上，浓度由左到右从高到低。重复8次，第11列为空白对照，仅用包被液包被。单克隆抗体的稀释倍数为1：20000，酶标二抗的稀释倍数为1：3000。通过检测得黑尾叶蝉抗原的最大稀释倍数为1600倍，即检测灵敏度为0.05g/mL÷1600=31.25μg/mL。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1. 一种单克隆抗体，其特征在于：该抗体是由杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No：
C2014241分泌的单克隆抗体，其用于黑尾叶蝉的鉴定、动态监测以及研究捕食性天敌对黑尾叶蝉的控制作用。
2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述杂交瘤细胞NC-4D12由下述方法制备得到：用抗原蛋白免疫BaL b/c小鼠，然后BaL b/c小鼠脾细胞与SP 2/0细胞在50%聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性且不与稻田其他昆虫和蜘蛛的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法克隆至能稳定分泌单克隆抗体的细胞株NC-4D12，即获得单克隆抗体杂交瘤细胞；其中，所述抗原蛋白来自研磨黑尾叶蝉虫体所得的上清液。
3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于所述抗原蛋白免疫BaL b/c小鼠的具体步骤为：选取10～12周龄的健康BaL b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200μL；3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200μL；再过3周后用不加佐剂的抗原免疫。
4. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于所述融合具体为：最后一次免疫后3天，收集抗血清，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合；采用聚乙二醇作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP 2/0，整个过程在无菌条件下操作，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心后，吸尽上清液，弹匀细胞；将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，在1min内加入50%PEG 0.7mL，静止1min后，逐渐加入已经预温至37℃的RMPI-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用，离心后弃上清液。
5. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于所述HAT培养具体为：将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5%CO2温箱中在37℃下培养；3天后换一半HAT培养基，5天后再换一半HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养。
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| 应用单克隆抗体评价稻田天敌的捕食作用 —稻飞虱和弹尾虫单克隆抗体的制备及其应用;赵伟春;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士） 农业科技辑》;20020615(第1期);中文摘要，第15页第1段至31页最后1段，第40页第1段至第44页最后一段 * |
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