CN111139224A - 一种抗swp2蛋白的单克隆细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用，属于农业和动物检疫技术领域。本发明一方面提供了一种新的抗SWP2蛋白的单克隆细胞株和该单克隆细胞株分泌的SWP2单克隆抗体，另一方面提供了上述单克隆细胞株和SWP2单克隆抗体在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。本发明中抗SWP2蛋白的单克隆细胞株所产生的单克隆抗体能够高特异性地结合SWP2抗原，具有很高的亲和力，对于虾体是否感染EHP能够提供准确结果。

Description

一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用

技术领域

本发明属于农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用，和该单克隆细胞株生产的SWP2单克隆抗体及其应用。

背景技术

微孢虫（microsporidia）是一种单细胞的真核内寄生虫，广泛寄生于虾、甲壳类等动物。对虾肝肠微孢虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）是微孢虫的一种， 属于微孢虫科、肠胞虫属，最早于2009年在泰国养殖的斑节对虾（Penaeus monodon）中发现，随后在亚洲各国的凡纳滨对虾、脊尾白虾和中国对虾养殖区陆续有EHP检出。研究表明EHP的感染途径较广，可通过污染的养殖水体和病虾进行水平传播，也可以通过受精卵和虾苗进行垂直传播。EHP感染的对虾初期没有明显症状，但随着病程的发展体色、胃、肠均明显异常，体色发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，个别虾体还会出现白便症状。由于该病在早前难以发现，往往要养殖30-45天以上才会表现出生长缓慢，不长个的现象，因此极易造成饲料空耗，给养殖户带来较大的经济损失。近几年，EHP在全世界范围内传播，亚洲的中国、马来西亚、越南、印度尼西亚、泰国已经成为了重灾区，印度和墨西哥也有发现，极大地打击了虾农的生产积极性。

病害防治首先要对病害做出正确的诊断。PCR技术由于高特异性、高灵敏度的优点，已被广泛应用于虾肝肠微孢虫的鉴定。蛋白质印迹法（Western Blot，WB）也是分子生物学中常用的一种实验方法，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

本发明所包含的单克隆细胞株及其分泌的单克隆抗体是针对EHP的一种孢壁蛋白基因（SWP2），该基因在微孢子的侵染过程中发挥了重要作用。PCR方法能从DNA水平检测EHP的存在，而WB方法能提供蛋白水平的检测结果，因此可以作为PCR方法的有效补充，经WB方法检测为阳性的样品往往说明样品中的EHP具有较强传染性。同时本发明中的单克隆抗体具有较强特异性，对于虾体是否感染EHP能够提供准确结果。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用的技术方案。

为了解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

所述的一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株，其特征在于该单克隆细胞株保藏编号为：CCTCC NO：C2019311。

所述的一种SWP2单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体由权利要求1所述的单克隆细胞株分泌。

所述的一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的单克隆细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体。

所述的一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。

所述的一种SWP2单克隆抗体在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。

所述的一种试剂盒作为检测虾肝肠微孢虫病试剂的用途。

本发明提供的一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株是通过构建SWP2重组表达质粒，将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，进行SWP2重组蛋白的表达和纯化，采用常规免疫方法对BALB/c小鼠进行免疫，选取效价最高的小鼠脾脏进行细胞融合，对阳性杂交瘤细胞筛选和克隆，经过数次克隆化操作，获得分泌单克隆抗体的单克隆细胞株。

本发明提供的SWP2单克隆抗体来自BALB/c小鼠脾脏，该小鼠经过液体石蜡致敏，注射杂交瘤细胞，并收集腹水，纯化后得到SWP2单克隆抗体。

本发明采用Western blot杂交方法检测虾样品，取虾的肝胰腺组织，得到蛋白溶液澄清液，根据样品的蛋白浓度进行制胶制样，取样品进行电泳实验，转膜后进行一抗和二抗孵育，ECL曝光得到发光条带，得到虾病验证结果。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的抗SWP2蛋白的单克隆细胞株，并且该抗SWP2蛋白的单克隆细胞株所产生的单克隆抗体能够高特异性地结合SWP2抗原，具有很高的亲和力，对于虾体是否感染EHP能够提供准确结果。

附图说明

图1为融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图，M：Protein marker(Cat.No.:C600525):1：上样；2：流出；3:20 mM Imidazole洗脱组分；4-5:50mM midazole洗脱组分；6：500mM midazole洗脱组分。

图2为纯化蛋白的SDS-PAGE分析图。

图3为纯化蛋白的Western Blot分析图。

图4为1-8EHP阳性虾样品的Western Blot分析图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来进一步解释本发明。

实施例：

1 SWP2重组表达质粒的构建

根据SWP2的基因组信息，采用基因合成方法获得SWP2基因片段的PCR产物；将PCR产物和表达载体Pet15B用NdeI、XhoI进行双酶切，割胶回收双酶切片段和载体，并用T4DNAigase将两者连接；连接液转入top10感受态细胞中，筛选阳性克隆并进行测序鉴定。

2.1 SWP2重组蛋白的表达和纯化

2.1 表达

将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，热激后涂布在含有对应抗生素的平板上，培养；挑取单克隆到含有抗生素的液体培养基中培养，当OD值达到0.6时，添加诱导剂IPTG继续培养，分别于20°C条件下培养16 h、37°C条件下培养4 h，未添加诱导剂的为阴性对照；离心弃上清，收集菌体；在收集到的菌体中加入缓冲液A悬浮，使用超声破碎仪使其充分溶解并离心，离心后的沉淀使用缓冲液B进行溶解，分别对上清和沉淀制样，进行SDS-PAGE检测；在含对应抗生素的培养基中培养菌液，当OD值达到0.6时，添加0.5 mM的IPTG，20°C条件下过夜培养进行大量表达，离心收集细胞菌体。

2.2 纯化

细胞菌体用缓冲液C溶解并超声破碎，离心收集上清粗蛋白；取5 ml Ni-NTA，用5倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5 ml/min；将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育1h；将孵育后的产物上柱，收集流出；用Binding buffer清洗平衡柱子；用Washing buffer洗柱子，并收集流出；用Elution buffer洗脱，收集流出； 对粗蛋白、洗杂流出、洗脱流出分别制样，进行SDS-PAGE检测；将纯度较好的3组分透析到1×PBS， pH7.4缓冲液中，透析结束后蛋白用PEG20000浓缩，0.22 μm滤膜过滤后分装1 ml/tube，-80°C保存。

2.3 目的蛋白检测

对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测与Western Blot验证。

3 单抗的筛选与制备

3.1 动物免疫及小鼠效价测定

采用常规免疫方法对BALB/c小鼠进行免疫。初免后每隔三周免疫一次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次。使用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清的抗体效价，选取免疫效价检测值最高的小鼠追加免疫一次，三天后取该鼠的脾脏进行细胞融合。

3.2 骨髓瘤细胞复苏

从液氮中取出冻存细胞，立即放入37°C水浴中融化，离心，弃上清，用少量完全培养液打散细胞团，加入约完全培养基于冻存管中，用吸管吹打均匀，全部吸出转至细胞培养瓶中，置于37°C二氧化碳培养箱中培养。待细胞长满瓶底后传至另一细胞瓶中培养，在倒置显微镜下观察其细胞状态，状态良好的细胞准备做融合用。

3.3 免疫脾细胞的制备

取效价最高且加强免疫的小鼠，眼球摘除采血，分离血清作为检测时的阳性对照血清。将小鼠颈椎脱臼致死，浸泡于酒精消毒，移入超净工作台内，固定于解剖板上，剪开左侧皮肤和腹膜，取出脾脏置于已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛有基础培养液的平皿内的滤膜中，用两个注射器上的弯针头将脾脏刺孔，然后其中一个弯针头固定滤膜，另一个弯针头挤压滤膜，使脾细胞完全释放到基础培养液中。用无菌滴管吹打细胞制成单细胞悬液，收获脾细胞悬液。将脾细胞悬液转移到离心管中，离心弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次。

3.4 细胞融合

用PEG将分离得到的脾细胞与提前复苏备用的骨髓瘤细胞进行融合，离心后弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次，加入用HAT的细胞培养液吹打成单细胞悬液，铺入96孔细胞培养板。

3.5 阳性杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后第7天，培养板孔底长出肉眼可见的克隆，首先通过ELISA间接法对所有细胞孔进行初次筛选，记录呈现强阳性的细胞孔。对初筛呈阳性的各细胞孔应及时在24孔细胞培养板中进行扩大培养和克隆化。

3.6 阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法将细胞悬液连续稀释至每孔加样仅含单个细胞，转移至96孔板培养，经过数次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将获得的阳性杂交瘤细胞在细胞培养瓶中扩大培养，而后冻存及制备腹水等。

3.7 单克隆抗体的大量制备与纯化

小鼠腹水的制备：取6周龄健康雌性小鼠，腹腔注射0.5 ml液体石蜡致敏，一到两周后，每只小鼠腹腔注射1~2×10⁶个杂交瘤细胞，观察小鼠状态7~10天后待小鼠腹腔明显膨大后收集腹水，离心上清液即为腹水，分装标记备用。

单克隆抗体的纯化：腹水离心15 min（4000 rpm，室温）取上清，向纯化柱内倒入，冲散beads。静置，待beads在纯化柱底部全部沉淀后放出腹水，并收集腹水流穿。1×PBS冲洗纯化柱，直到beads变白为止（少数洗不白的除外）。将腹水流穿重新过一遍纯化柱，重复上述操作至少2遍10倍柱体积1×PBS分2次冲洗纯化柱。抗体洗脱，将洗脱液加入纯化柱，封闭纯化柱下端，冲散beads，待beads在纯化柱底部全部沉淀后，流出液体，用事先装有中和液的1.5ml离心管收集洗脱液。对纯化的抗体用Merinton SMA4000微量紫外分光光度计测定浓度，并用ELISA检测抗体效价。

4 用Western blot杂交方法检测虾样品

4.1 蛋白提取

取约30 mg虾的肝胰腺组织，加200 μl RIPA裂解液。低温高速匀浆3次，冰上裂解2 h，中间1 h拿出冰浴超声1次，中间停止15 S后继续裂解1 h。4°C 12000 g高速离心，吸取上清，并再次离心，直到得到的蛋白溶液澄清透亮，4°C暂存待蛋白定量。

4.2 浓度测定

用8个梯度的BSA作为标准品对照。BCA蛋白定量，BCA液每孔200 μl与硫酸铜液4 μl混合，配制成为BCA蛋白定量工作液使用。上样，标准品与样品每孔上样20 ul，之后加入BCA工作液，37°C温箱孵育30 min。用酶标仪570 nm读出OD值，绘制标准曲线，以标准品浓度μg/μl为横轴，OD值为纵轴，绘制线性方程，计算每个样品的蛋白浓度。

4.3 制胶

根据目的蛋白的分子量，配制12%的分离胶，浓缩胶浓度为5%，备用。

4.4 制样

5×Loading Buffer室温融化并平衡，按照1:4的比例加入到调整好浓度的样品中，反复轻柔吹打。样品管插入浮漂板中，使样品体积浸没于沸水液面以下，不加盖，沸水浴10min以使蛋白充分变性。自然冷却样品后，低速离心，混匀后分装样本。

4.5 上样与电泳

10孔胶上样6 ul，电泳条件：浓缩胶恒压90 V，约20 min；分离胶恒压160 V，通过样品中溴酚蓝的位置来确定电泳停止时间。电泳时在电泳槽外加入冰块或冰袋，避免长时间电泳造成电极与溶液温度过高。

4.6 转膜

电泳结束后，轻轻取下凝胶，去除浓缩胶部分，只保留分离胶，用纯净水冲洗；打开转膜夹芯，先放一层海绵垫，再放三张浸润平衡过转膜液的中速滤纸，小心在滤纸上放上凝胶，再加三张滤纸，使用凝胶滚筒反复轻柔赶走去除其中可能存在的气泡，整个过程不时滴加转膜液；将整个转膜芯放入转膜槽，加满提前4°C冰箱预冷的转膜液，外槽中放入冰冻好的冰盒用于降温。

湿转法转膜：300 mA恒流，转膜时间以目的蛋白分子大小而定，每1 kDa分子的转膜1 min。完成后用丽春红染色试剂染色，观察转膜效果，丽春红使PVDF膜上的蛋白条带染色，条带清晰，带型清楚，则说明蛋白分离效果明显，可以进行下一步实验。

4.7 封闭

用TBST洗涤染色后的膜5 min，弃去洗涤液，选择脱脂牛奶封闭，将膜完全浸没5%牛奶-TBST中室温轻摇60 min。

4.8 孵育一抗

一抗孵育：用5% BSA/TBST稀释一抗（抗体稀释液通常与封闭液相同），室温孵育15min，放4℃摇床过夜。

4.9洗涤

从4℃拿出膜，在摇床室温平衡15 min ，待溶液恢复室温之后吸弃抗体孵育液，加入5ml TBST洗膜5次，每次3 min；最后一次洗完后，倒去TBST，将孵育盒反扣在吸水纸上，吸取残留的液体。

4.10孵育二抗

用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，加入Goat-Anit-Mouse二抗，室温轻摇40 min。

4.11洗涤

加入5 ml TBST洗膜5次，每次3 min，最后一次洗完，不要倒掉TBST，将洗好的膜浸没其中，放4℃平衡10 min。

4.12 ECL曝光

在压片盒中先铺一层保鲜膜，使用平头镊取膜，用吸水纸吸去多余的TBST，平整将PVDF膜放在保鲜膜上。加入配制好的ECL发光液，关闭红光灯，待肉眼可辨有微弱荧光条带时，开红光灯，用吸水纸吸去多余发光液，覆盖保鲜膜，加上大小合适的胶片，压盒曝光30 S左右，胶片取出放入显影液显影1-3 min，条带出现后，放入定影液定影2 min。

5 实验结果

5.1 SWP2基因片段序列

SWP2基因片段序列如SEQ ID NO.1所示。

5.2 表达的SWP2蛋白序列

SWP2重组蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

5.3 蛋白纯化与验证

SWP2蛋白的原核表达、纯化及检测验证的结果如图1-3所示，表明重组表达的SWP2蛋白大小与预测相符合，满足实验要求。

5.4 小鼠血清效价测定

用间接ELISA方法对免疫小鼠进行血清效价的检测，结果显示1#，2#，3#，4#, 5# ，其3#小鼠血清效价最高，大约为1︰256K，可以满足细胞融合的要求（如下表）。

小鼠尾血效价测定

5.5 单克隆细胞株的筛选

免疫的BALB/c小鼠脾细胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合后，取细胞上清经间接ELISA方法测定OD450值，选中其中阳性值最高的单克隆细胞株经亚克隆筛选，共获得3株能稳定分泌单克隆抗体的单克隆细胞株，分别命名为2D11H7、3G3D4、3H3C8。

5.6 纯化后的抗体效价检测

经纯化后的抗体的效价和浓度检测结果如下表，其中3H3C8菌株的效价最高，因此以此菌株制备高效的单克隆抗体为WB杂交实验使用。并将3H3C8菌株送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2019311，地址位于中国武汉市武汉大学，保藏日期为2019年11月28日，分类命名为单克隆细胞株3H3C8。

纯化抗体效价

5.7 虾样品的Western blot杂交

1-8号样品是明确的EHP阳性虾样品，0号样品是EHP阴性虾样品，使用本发明的抗SWP2蛋白的单克隆细胞株分泌的单克隆抗体，采用WB方法进行重新验证的结果如图4所示。结果显示，1-8样品均显示明显的28 kDa大小条带，说明该单克隆抗体能够被用来进行虾的肝肠微孢虫病检测。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 711

<212> DNA

<213> 单克隆细胞株(monoclonal cell line)

<400> 3

catatgataa ctaacaaaat gctgttcgtc aactacttca tgcacgctca gactcgtact 60

actcacgagg catctgcaac tccacaagaa cagaagacta tcttcaccat caaggtgctg 120

gcacctcaag agtactctaa gtactacgag cagacccatg agtctctggg tgctgatctg 180

cacatgatca aagatgaggt ccagaacgaa ctgaacaaat ccgtgcgttt ccgtgaaaac 240

aacctgaaaa tccagatcga cctggaatcc ccggcatctc atccggtaat ggatcagctg 300

gatgaaacca tctgtgaagg ttctatgacg tctgtgacca ccctgctgaa taacatcaac 360

gtgatcgatg cttctagcca ttacatcgtt ctgctgccgt gtaaagctga taaccacacc 420

gaaatcttca acagcgccca cgtagacgtt ccgctggtta tgcacaaagt taacatcgaa 480

tgctccaacc gcatcgccat tttccgcgaa agcaataaag aaatgctgat gtcctccttt 540

ggcaacgcgg ttctgaaagc gatcggtgcg ccgctggacg actatgcgaa actgacgacc 600

gtaagcaacg gcgacgaagg cattgaaagc cacctgacca ttaacgaaga aaccattcac 660

aatattctgg actccaaatg cttttataac attctggcgc tgtaactcga g 711

<210> 3

<211> 253

<212> PRT

<213> 单克隆细胞株(monoclonal cell line)

<400> 3

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ile Thr Asn Lys Met Leu Phe Val Asn Tyr Phe

20 25 30

Met His Ala Gln Thr Arg Thr Thr His Glu Ala Ser Ala Thr Pro Gln

35 40 45

Glu Gln Lys Thr Ile Phe Thr Ile Lys Val Leu Ala Pro Gln Glu Tyr

50 55 60

Ser Lys Tyr Tyr Glu Gln Thr His Glu Ser Leu Gly Ala Asp Leu His

65 70 75 80

Met Ile Lys Asp Glu Val Gln Asn Glu Leu Asn Lys Ser Val Arg Phe

85 90 95

Arg Glu Asn Asn Leu Lys Ile Gln Ile Asp Leu Glu Ser Pro Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Met Asp Gln Leu Asp Glu Thr Ile Cys Glu Gly Ser Met

115 120 125

Thr Ser Val Thr Thr Leu Leu Asn Asn Ile Asn Val Ile Asp Ala Ser

130 135 140

Ser His Tyr Ile Val Leu Leu Pro Cys Lys Ala Asp Asn His Thr Glu

145 150 155 160

Ile Phe Asn Ser Ala His Val Asp Val Pro Leu Val Met His Lys Val

165 170 175

Asn Ile Glu Cys Ser Asn Arg Ile Ala Ile Phe Arg Glu Ser Asn Lys

180 185 190

Glu Met Leu Met Ser Ser Phe Gly Asn Ala Val Leu Lys Ala Ile Gly

195 200 205

Ala Pro Leu Asp Asp Tyr Ala Lys Leu Thr Thr Val Ser Asn Gly Asp

210 215 220

Glu Gly Ile Glu Ser His Leu Thr Ile Asn Glu Glu Thr Ile His Asn

225 230 235 240

Ile Leu Asp Ser Lys Cys Phe Tyr Asn Ile Leu Ala Leu

245 250

Claims (6)

1.一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株，其特征在于该单克隆细胞株保藏编号为：CCTCCNO：C2019311。

2.一种SWP2单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体由权利要求1所述的单克隆细胞株分泌。

3.一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的单克隆细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的一种抗SWP2蛋白的单克隆细胞株在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。

5.根据权利要求2所述的一种SWP2单克隆抗体在制备检测虾肝肠微孢虫病试剂中的应用。

6.根据权利要求3所述的一种试剂盒作为检测虾肝肠微孢虫病试剂的用途。

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